تصوير سريع عالي الدقة لأوعية الصغيرة للدراسات الكمية

Summary

يقدم هذا البروتوكول طريقة سريعة للتصوير الكمي للأوعية الدموية ثلاثية الأبعاد باستخدام الفحص المجهري الفلوري للصفائح الضوئية. يتم إثبات فعالية الطريقة باستخدام نظام الشريان المقوس البلعومي لنموذج جنين الفرخ ، مع تحديد القوى الديناميكية الدموية عبر ديناميكيات السوائل الحسابية.

Abstract

في النماذج الحيوانية الصغيرة لتطور القلب والأوعية الدموية والأمراض ، تتيح المحاكاة الحسابية الخاصة بالموضوع لتدفق الدم إجراء تقييمات كمية لمقاييس ديناميكا الدم التي يصعب قياسها تجريبيا. تسلط المحاكاة الديناميكية للسوائل الحسابية الضوء على الأدوار الحاسمة للميكانيكا في وظيفة القلب والأوعية الدموية وتطور المرض. يعد الحصول على صور حجمية عالية الجودة للسفن ذات الأهمية أمرا أساسيا لدقة وقابلية تكرار نتائج القياس المورفولوجي وقياس التدفق. تقترح هذه الدراسة طريقة سريعة وفعالة من حيث التكلفة ويمكن الوصول إليها للتصوير عالي الدقة الكامل لأوعية الدموية الحيوانية الصغيرة باستخدام الفحص المجهري الفلوري للصفائح الخفيفة. يتضمن بروتوكول تحضير عينة الورقة الخفيفة iDISCO + (التصوير ثلاثي الأبعاد المدعوم بالملصقات المناعية للأعضاء التي تم تطهيرها بالمذيبات) (1) وضع العلامات على الأوعية الدموية بعامل فلورسنت ، (2) الحفاظ على العينة ، و (3) جعل العينة شفافة. على عكس iDISCO + الكلاسيكي ، الذي يستخدم تلطيخ كيميائي مناعي ، يقوم المؤلفون بتسمية بطانة الأوعية الدموية باستخدام poly-L-lysine الموسومة ب FITC ، وهي صبغة فلورية غير محددة بأسعار معقولة ومقاومة عالية للتبييض الضوئي ، في عملية تسمى "الطلاء الداخلي". يقلل وضع العلامات السريع من وقت تحضير العينة من حوالي أربعة أسابيع إلى أقل من 3 أيام. علاوة على ذلك ، فإن استخدام المذيب الإيثيل سينامات (ECi) كعامل مقاصة وحل تصوير يجعل العينات أكثر أمانا في التعامل معها ومتوافقة مع مجموعة واسعة من مرافق التصوير. يتم تطبيق البروتوكول المقترح للحصول على أكوام صور مجهرية مضان للصفائح الضوئية عالية الدقة لنظام القلب والأوعية الدموية في أجنة الكتاكيت تتراوح من اليوم 3 (HH18) إلى اليوم 8 (HH34). توضح هذه الدراسة أيضا مدى ملاءمة هذه الطريقة لقياس كمية الأوعية الدموية من خلال إعادة البناء ثلاثية الأبعاد والنمذجة الديناميكية الدموية الحسابية لجنين الكتكوت في اليوم 5 (HH 26).

Introduction

التصوير الحجمي ضروري لإجراء دراسات دقيقة لفسيولوجيا القلب والأوعية الدموية وأمراضها. ينتج التصوير الكمي مجموعات صور عالية الدقة ذات أبعاد حجمية سليمة. يجب الحفاظ على العينات للحفاظ على مورفولوجيتها في الجسم الحي وحجم التجويف بالإضافة إلى تصويرها بسعة موحدة عالية الدقة. من مكدسات التصوير عالية الدقة ، يمكن للمستخدم إنشاء عروض وعائية ثلاثية الأبعاد عالية الدقة تسمح بعرض كامل لأشكال الأوعية وهيكلها^{واتصالها 1}.

تمتلك هياكل القلب والأوعية الدموية ميزات تشريحية معقدة ثلاثية الأبعاد لا يمكن التقاطها بدقة عند فحصها من خلال عدسة ثنائية الأبعاد مفككة. التصوير المورفولوجي واسع المجال والمنظار المجسم والأقسام النسيجية غير كافية في التقاط الاختلافات المعقدة ثلاثية الأبعاد^1،2،3. صور التصوير المقطعي المحوسب بالصغر والنانو هي المعيار الذهبي للتصوير الحجمي الكمي للحيوانات الصغيرة^1،4 ، ولكن لا يمكن الوصول إليها على نطاق واسع أو اعتمادها بين المجتمع البيولوجي. سمحت الابتكارات الحديثة في تطهير الأنسجة والفحص المجهري للأعضاء / الصغيرة بالتطبيقات الكمية لتقنيات إزالة التثبيت الكامل ووضع العلامات على الأوعية^{الدموية 5،6،7}. يعمل تطهير الأنسجة على تجانس تشتت الضوء في عينات الأنسجة ، وبالتالي تقليل التأخير في انتشار الضوء عبر الوسط عن طريق تقليل فرصة تشتت الضوء أو امتصاصه. تتطلب الشفافية العالية معالجة صارمة للأنسجة قد تؤثر على مضاد أو سطوع ملصقات إشارة التألق⁸. ظهر الفحص المجهري للصفائح الضوئية كأداة تصوير سريعة وقوية تم تبنيها على نطاق واسع من قبل علماء الأحياء⁹ ، مما يوفر اكتسابا في السرعة عدة أوامر من حيث الحجم عبر المجاهر الماسحة والقدرة على تصوير عينات يزيد حجمها عن 1 سم. من خلال الفحص المجهري الفلوري للصفائح الضوئية (LSFM) ، يضيء الليزر مقطعا عرضيا للعينة بسرعة وعمق متزايدين مقارنة بالفحص المجهري متحد البؤر. لهذا السبب ، تتطلب الطريقة شفافية عالية في العينة.

هنا ، يقوم المؤلفون بتكييف طرق المقاصة الحديثة iDISCO + ، والجمع بينها وبين الطلاء^{الداخلي 10} في نموذج جنين الكتاكيت لعرض فعالية الطريقة من تطور القلب والأوعية الدموية في وقت مبكر إلى متأخر. iDISCO (التصوير ثلاثي الأبعاد الذي يدعم الملصقات المناعية للأعضاء التي تم تطهيرها بالمذيبات) هي طريقة مقاصة عضوية قائمة على المذيبات ، والتي ، على عكس الطرق القائمة على المقاصة المائية ، لا تخضع للتصوير الأثري الناجم عن تبخر المذيبات. يختلف iDISCO عن iDISCO + في أن خطوة الجفاف رباعي هيدروفوران الأولى (iDISCO) يتم استبدالها بجفاف الميثانول الأكثر اعتدالا متبوعا بخطوة استخراج الدهون (iDISCO +). تشمل مزايا طريقة المقاصة iDISCO + وضع العلامات المناعية للعينات والأجنة الكبيرة من البالغين ، وانكماش الأنسجة المنخفض ، والشفافية العالية^8،11. الأهم من ذلك ، أن iDISCO + يسمح بإنشاء مجموعات صور عالية الدقة ، والتوسع في تقنيات وضع العلامات المناعية البيولوجية التقليدية للحصول على معلومات حول عينات الأعضاء الكبيرة أو الجنين بأكمله بدلا من الاقتصار على أخذ عينات من المناطق الصغيرة التي تفتقر إلى المعلومات حول التنظيم على مستوى الأنسجة بالكامل ، كما هو الحال مع علم الأنسجة^{التقليدي 9}. تشمل عيوب iDISCO + حقيقة أن بروتينات الفلورسنت المشفرة وراثيا لا يتم الحفاظ^{عليها 11}. تم تقديم طريقة وضع العلامات على الأنسجة للطلاء الداخلي لأول مرة كفحص عالي الإنتاجية لعيوب القلب والأوعية الدموية باستخدام قلوب أجنة الكتاكيت HH31-HH36 التي تم إغراقها ب 0.5 مجم / مل من FITC-poly-L-lysine في قمة البطين الأيسر. سمح للصبغة بالالتصاق لمدة 4 دقائق قبل التثبيت والتخزين¹⁰.

وجدت الدراسة الحالية أنه يمكن استخدام نفس تركيز FITC-poly-L-lysine لمجموعة واسعة من الأجنة (HH18 - HH34) ولكنها وجدت أن وقت التثبيت المثالي يختلف (من 5-10 دقائق) لضمان الأوعية ذات العلامات الزاهية. قد يرغب مستخدمو تقنية endo-DISCO الحالية في ضبط تركيز الصبغة (يتناقص بمقدار 0.1 مجم / مل في المرة الواحدة) إذا ثبت أن المحلول لزج جدا بحيث لا يمكن تسمية جميع الأوعية المرغوبة ، ولكن يتم تشجيعهم على ضبط وقت التثبيت أولا وتحسين الانقباض العضلي للبطين الأيسر قبل ضبط تركيز الصبغة. حاول المؤلفون الطلاء الداخلي بتركيز 0.1 مجم / مل ووجدوا أنه في حين أن الصبغة تنتشر بسهولة أكبر عبر الأوعية الصغيرة ، إلا أنه تم غسلها بسهولة أكبر عند تروية PFA. يوضح المؤلفون أن مكدسات التصوير عالية الدقة التي تم إنشاؤها من خلال التقنية الحالية ذات جودة كافية للنمذجة الديناميكية الدموية الحسابية. تحدث مسارات تدفق الدم والقوى الديناميكية الدموية المقابلة ، بما في ذلك توزيعات الضغط وإجهاد قص الجدار ، في أنماط موضعية معقدة لا يمكن حلها إلا من خلال محاكاة التدفق الحسابي^1،12. تؤثر هذه القوى الميكانيكية الحيوية على سلوك أنسجة القلب والأوعية الدموية المجاورة وتؤدي إلى تكيف الأوعية الدموية ونموها وإعادة^{تشكيلها 13}. يلقي فهم قيم القوة الديناميكية الدموية المحلية ضوءا حاسما على المنظمين الميكانيكيين لوظيفة القلب والأوعية الدموية وبدء المرض أو^{تطوره 2}.

Protocol

يفسر مكتب رعاية المختبر سياسة خدمة الصحة العامة على أنها تنطبق على نموذج الكتكوت على أنه "فقاري" فقط بعد الفقس. هذه الأجنة معفاة بالمثل من اختصاص اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامها (IACUC). يمكن الوصول إلى الأسئلة المتداولة ذات الصلة بالمعاهد الوطنية للصحة على: http://grants.nih.gov/grants/olaw/faqs.htm#ApplicabilityofthePHSPolicy.

1. جمع الأجنة ووضع العلامات والتثبيت

1. سحبت الموضة قضبان شعرية زجاجية بقطر داخلي 0.75 إلى إبر دقيقة مقطوعة باستخدام microforge^1،12.
   ملاحظة: يعتمد حجم الطرف المطلوب على عمر / معدل التدفق المطلوب. يمكن بدلا من ذلك قطع الإبرة الدقيقة باستخدام ملقط التشريح الدقيق أو المقص بدقة منخفضة للغاية.
2. قم بتسخين محلول Tyrode إلى حوالي 38 ^{درجة مئوية.}
3. قم بإذابة مادة FITC poly-L-lysine الصلبة في محلول Tyrode لتحضير محلول مخزون 0.5 مجم / مل.
   ملاحظة: تم تحسين هذا التركيز لوضع العلامات على شرايين جنين الكتاكيت. قد يختلف التركيز الأمثل لأنواع الأنسجة الأخرى. يجب تخزين محلول المخزون الإضافي عند -20 درجة مئوية.
4. قم بتشريح جنين الطيور (الذي يتراوح من HH18 (اليوم 3) إلى HH34 (اليوم 8) لدراسة قلب الكتاكيت الحالية) من صفار البيض عن طريق قطع الجنين بمقص طرف منحني واستخدام ماصة نقل أو ملعقة لنقل الجنين إلى طبق بتري مقاس 35 مم مملوء بمحلول Tyrode الدافئ.
5. قم بإزالة الأغشية المشيمية والآلانتية التي تغلف الجنين وغشاء التامور حول القلب بعناية باستخدام ملقط رفيع عن طريق عمل شقوق صغيرة (~ 0.1 مم) في الأغشية وسحبها بعيدا عن الجنين.
6. انقل الجنين إلى طبق بتري جديد ونظيف مليء بمحلول Tyrode الدافئ للحفاظ على نبض القلب.
7. املأ حقنة بلاستيكية سعة 5 مل بمحلول Tyrode الدافئ. قم بقص الطرف العريض لطرف الماصة البلاستيكية من 0 إلى 20 ميكرولتر وقم بتثبيته على الطرف المسطح للحقنة. تم الآن تمديد المحقنة إلى قطر طرف الماصة الناعم.
8. قم ببناء "خط حقن" عن طريق توصيل جزء من أنابيب السيليكون ذات القطر الداخلي 0.03 بوصة بجهاز الحقنة ذات طرف الماصة المؤمن حديثا (الخطوة 1.7). قم بتوصيل إبرة زجاجية شعرية بالطرف الآخر من الأنبوب.
9. قم بتركيب الإبرة الدقيقة على حامل الحقن الدقيق المرفق بمعالج دقيق. تطهير أنابيب السيليكون والإبرة الدقيقة من فقاعات الهواء.
10. باستخدام أداة المعالجة الدقيقة ، أدخل الإبرة في قمة القلب وقم ببث الجنين^1،12عن طريق حقن محلول Tyrode ببطء في القلب. استمر في حقن الجنين حتى يتم تطهيره إلى حد كبير من الدم.
11. استخدم المعالج الدقيق لسحب الإبرة وخط الحقن للخلف من موقع الإدراج وتوجيه الإبرة بحيث لا يتم إزعاجها أثناء تحضير خط الحقن التالي. قم بإزالة أنبوب السيليكون من الإبرة والحقنة.
    ملاحظة: قد يجد بعض المستخدمين أنه من الأفضل إبقاء الإبرة متصلة بالقلب ، وفي هذه الحالة يجب على المستخدم إزالة أنبوب السيليكون بين الإبرة والحقنة ، مع الحفاظ على الإبرة في مكانها.
12. قم بإجراء الطلاء الداخلي لتسمية بطانة الأوعية الدموية بالمضان الأخضر.
    1. باستخدام ماصة دقيقة، قم بتحميل 20-40 ميكرولتر من محلول مخزون FITC poly-L-lysine في أنبوب السيليكون، مع الحرص على عدم تكوين فقاعات هواء أمام حاجز السائل FITC.
    2. أعد توصيل المحقنة المملوءة بمحلول Tyrode واستخدم المعالج الدقيق للحقن ببطء في قمة القلب ، وإعادة إدخال الإبرة إذا لزم الأمر. قم بإزالة الإبرة بعد نشر FITC poly-L-lysine وقبل دخول أي فقاعات هواء إلى القلب.
    3. دع FITC poly-L-lysine يجلس في الجنين لمدة 5-10 دقائق.
       ملاحظة: (فحص الجودة الاختياري) للتحقق من التألق ، التقط صورة باستخدام ستيريو فلورسنت أو منظار كبير. يمكن استخدام الصورة للمساعدة في تحديد عامل الجفاف بعد اكتمال إزالة الأجنة.
13. املأ حقنة سعة 5 مل ب 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) وقم بتوصيلها بأنبوب حقن السيليكون لخطوة حقن ثالثة.
14. قم بتنقية الجنين^1،12 بنسبة 4٪ PFA حتى تصبح جميع هياكل القلب والأوعية الدموية في كامل طاقتها وتبدأ الأنسجة في أن تصبح أكثر غموضا.
15. قم بتحميل الجنين برفق في قارورة سعة 2-5 مل مملوءة بما يكفي من 4٪ PFA لتغطية العينة. احرص على عدم تشويه الجنين بشكل مفرط.
    ملاحظة: اختر قارورة كبيرة بما يكفي للعينة محل الاهتمام لتجنب سحق العينة أو تشويهها.
16. احتضان الجنين طوال الليل عند 4 درجات مئوية باستخدام شاكر.

2. جفاف الأجنة وإزالتها

1. قم بإخراج الماصة بعناية 4٪ PFA.
   ملاحظة: من هذه النقطة فصاعدا ، تجنب الاتصال المباشر بالجنين لمنع تلف الأنسجة أو تشوهها.
2. لغسل الجنين ، احتضان الجنين في محلول عازلة للفوسفات الطازج (PBS) في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة مع رجها برفق. كرر مرتين إضافيتين ليصبح المجموع 3 غسلات.
3. ابدأ في تجفيف الجنين في غطاء الدخان. قم بإخراج PBS بعناية واحتضان الجنين في سلسلة متدرجة من 5 حضانات ميثانول في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة لكل منها: تركيز 20٪ و 40٪ و 60٪ و 80٪ و 100٪.
4. اترك الجنين في الميثانول الطازج بنسبة 100٪ في درجة حرارة الغرفة طوال الليل.
   ملاحظة: (نقطة توقف اختيارية). يمكن تخزين الأجنة عند -20 درجة مئوية في 100٪ ميثانول لاستخدامها لاحقا لمدة تصل إلى 6 أشهر.
5. في غطاء الدخان ، ابدأ إجراء إزالة الدهون. احتضان الجنين في 2: 1 (حجم إلى حجم) DCM: محلول الميثانول في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 ساعات ، مع رجها برفق.
   تنبيه: DCM سام ويجب التعامل معه في الدخان. اتخذ احتياطات إضافية عند العمل مع DCM. قد تساعد القفازات المزدوجة في توفير حاجز إضافي.
6. خذ إيثيل سينامات (ECi) من 4 درجات مئوية واتركه في درجة حرارة الغرفة ليذوب.
7. اغسل الأجنة في 100٪ DCM طازج في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة ، مع رجها. كرر الغسيل DCM بنسبة 100٪ لتحقيق إجمالي 2 غسلة.
8. ماصة خارج DCM واحتضان الجنين في 100٪ ECi. اترك الجنين في ECi حتى يختفي في حوالي 1 ساعة. هز الأنبوب برفق إذا لزم الأمر.
9. (خطوة التحقق الاختيارية) افحص جودة المقاصة وتلوين الأوعية باستخدام ستيريو فلورسنت أو منظار كبير. التقط صورة للجنين لتحديد عامل تحجيم الجفاف الخاص بالمرحلة / العمر.
10. قم بتخزين الجنين الذي تم تطهيره عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر حتى يصبح جاهزا للتصوير ، مع الحفاظ على الجنين محميا من الضوء.

3. الحصول على البيانات

1. لتصوير الأجنة ، استخدم المجهر الفلوري الخفيف. قم بلصق رأس جنين تم تطهيره بصريا على شعرية زجاجية باستخدام هلام الغراء الفائق.
2. قم بتركيب الشعيرات الدموية الزجاجية على حامل العينة ، واملأ غرفة التصوير ب ECi ، وقم بخفض الجنين في غرفة التصوير.
3. اضبط المعلمات وقم بإجراء التصوير.

4. التطبيق الكمي: إعادة بناء 3D والنمذجة الديناميكية للسوائل الحسابية

ملاحظة: في هذه الخطوات، يتم تحميل مكدسات الصور عالية الدقة التي تم إنشاؤها بواسطة الألواح الضوئية في البرنامج مفتوح المصدر SimVascular¹⁴ لإعادة البناء التشريحي ثلاثي الأبعاد والنمذجة الديناميكية للسوائل الحسابية. توجد دروس مفصلة على موقع SimVascular (انظر جدول المواد). تتكون إعادة الإعمار من إنشاء مسارات في الأوعية ذات الأهمية ، وإنشاء تجزئة ثنائية الأبعاد على طول المسارات ، والجمع بين التجزئة المرتفعة في نموذج صلب ثلاثي الأبعاد. تتكون النمذجة الحسابية من إعداد هندسة متشابكة ، وتحديد الشروط الحدودية ، وتشغيل عمليات المحاكاة.

1. قم بإنشاء SVProject جديد ضمن ملف وقم بتحميل مكدس تصوير ورقة ضوئية عالي الدقة عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن على الصور ثم النقر فوق إضافة / استبدال الصورة.
2. اتبع خطوات البرنامج التعليمي لإعادة بناء تشريح الأوعية الدموية في السيليكو.
   1. قم بإنشاء مسار بالنقر بزر الماوس الأيمن على المسارات وتحديد إنشاء مسار. ضع علامات المسار على طول السفينة ذات الأهمية. كرر لكل وعاء محل اهتمام.
   2. لكل مسار تم إنشاؤه ، تتبع المقاطع العرضية للوعاء ثنائي الأبعاد بالنقر بزر الماوس الأيمن على التجزئة وتحديد إنشاء مجموعة كفاف. حدد مسار السفينة وانقر نقرا مزدوجا فوق اسم السفينة ضمن التجزئة لبدء التجزئة اليدوية.
   3. بمجرد تقسيم جميع السفن، قم بإنشاء نموذج بالنقر بزر الماوس الأيمن فوق النماذج ثم تحديد إنشاء نموذج. حدد نوع PolyData ، وأدخل اسم النموذج ، وانقر فوق إنشاء نموذج صلب ، وحدد جميع التجزئة التي يجب أن تكون جزءا من النموذج.
3. قم بربط الهندسة عن طريق تشغيل مشير Tetgen المدمج في SimVascular SVMesher. حدد الحد الأقصى لحجم الحافة وقم بإجراء كل من الربط السطحي والحجمي.
   ملاحظة: اختر حجم شبكة يمكنه حل التفاصيل الهندسية الدقيقة والتغيرات الديناميكية الدموية المترجمة في الوعاء. ابدأ بالزر تقدير حجم شبكة عمومي . قد تكون دراسة تقارب الشبكة ضرورية عند وضع اللمسات الأخيرة على عمليات المحاكاة.
4. قم بإعداد محاكاة حساب لتدفق الدم باستخدام SimVascular Solver. قم بإنشاء ملفات محاكاة بالنقر بزر الماوس الأيمن فوق عمليات المحاكاة وتحديد إنشاء مهمة محاكاة. اضبط المعلمات الأساسية وحدد BCs للمدخل والمخرج لظروف حدودية محددة.
   1. اضبط معلمات Solver ، وانتقل إلى علامة التبويب إنشاء ملفات وتشغيل المحاكاة ، وحدد ملف شبكي ، وانقر فوق إنشاء ملفات بيانات للمحاكاة.
5. قم بتشغيل المحاكاة باستخدام محطة عمل حوسبة عالية الأداء أو كمبيوتر عملاق.

النتائج

ينتج بروتوكول التصوير السريع عالي الدقة المثبت بالكامل المقدم هنا (الشكل 1 ، الجدول 1) تجويف الأوعية الدموية المحددة بوضوح كما هو موضح في الشكل 2 والشكل 3 والشكل 4 ، حيث تكون بطانة الأوعية الدموية لجنين الكتا...

Discussion

تعد القدرة على دراسة علم الأحياء ثلاثي الأبعاد أمرا بالغ الأهمية لفهم دقيق للتعقيد المورفولوجي وبنية الأعضاء الداخلية وروابط الأوعية الدموية. تعد الصور الوعائية ثلاثية الأبعاد الدقيقة والموثوقة أيضا أساسية لمحاكاة ديناميكية الدم الحسابية الخاصة بالموضوع ، والتي غال?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5 forceps	Fine Science Tools	11252-30
#55-forceps	Fine Science Tools	11295-51
0.03 inch inner diameter silicone tubing	VWR	32829-182
20 μL pipette tips	VWR	76322-134
35 mm Petri dish	VWR	10799-192
5 mL plastic syringe	VWR	BD 309646
Dichloromethane (DCM)	Sigma-Aldrich	270997	Refer to MSDS. Stored in side cabinet under fume hood
Ethyl cinnamate (ECi)	Sigma-Aldrich	112372	Stored at 4 °C
Fine Curved scissors	Fine Science Tools	14061-09
FITC-poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P3069	Store at -20 °C (powder, stock solution), 4ºC (working solution)
Fluoresent microscope	EVIDENT SCIENTIFIC	MVX10
Glass capillary tubes (0.75 mm ID)	Sutter Instrument	FG-GB100-75-10
Lightsheet microscope	Zeiss	Z.1 system
Methanol	Sigma-Aldrich	M1775	Refer to MSDS. Stored in flammable cabinet under fume hood
Microforge	Narishige International USA, Inc.	MF2
Micromanipulator	World Percision Instrrument	M3301R
Paraformaldehyde (PFA) 4%	Thermo Scientific	J19943.K2	Refer to MSDS. Stored at -20 °C (powder), 4 °C (4% working solution)
Phosphate buffered saline (PBS)	Cytiva	SH30256.01	Stored on benchtop
SimVascular			open source software www.simvascular.org
Tyrode’s Solution			Made in-house