定量的研究のための小動物血管系の迅速なホールマウント高分解能イメージング

要約

このプロトコルは、ライトシート蛍光顕微鏡を使用した定量的なホールマウント3次元血管イメージングの迅速な方法を導入します。この方法の有効性は、ニワトリ胚モデルの咽頭アーチ動脈系を使用して実証され、血行動態の力は計算流体力学 によって 定量化されます。

要約

心血管の発達と疾患の小動物モデルでは、被験者固有の血流の計算シミュレーションにより、実験的に測定するのが難しい血行動態指標の定量的評価が可能になります。計算流体力学シミュレーションは、心血管機能と疾患の進行における力学の重要な役割に光を当てます。対象血管の高品質な体積画像を取得することは、形態学的測定と流量定量結果の精度と再現性の中心です。この研究は、ライトシート蛍光顕微鏡を使用して小動物の血管系のホールマウント高解像度イメージングのための迅速で費用対効果が高く、アクセス可能な方法を提案しています。修正されたiDISCO+(免疫標識対応3次元イメージング・オブ・ソルベント・クリアード臓器)ライトシートサンプル調製プロトコルでは、(1)蛍光剤による血管系の標識、(2)サンプルの保存、(3)サンプルの透明化が行われます。免疫組織化学染色を用いる従来のiDISCO+とは異なり、著者たちは、光退色に対して高い耐性を持つ手頃な価格の非特異的蛍光色素であるFITCタグ付きポリ-L-リジンを血管内皮に標識し、「エンドペインティング」と呼ばれるプロセスで標識した。迅速なラベリングにより、サンプル調製時間は約4週間から3日未満に短縮されます。さらに、クリアリング剤およびイメージングソリューションとして最小限の危険性溶媒である桂皮酸エチル(ECi)を使用することで、サンプルの取り扱いが安全になり、より広範なイメージング施設に準拠できます。提案されたプロトコルは、3日目(HH18)から8日目(HH34)までのニワトリ胚の心血管系の高分解能ライトシート蛍光顕微鏡画像スタックを取得するために適用されます。この研究は、5日目(HH 26)のニワトリ胚の3D再構成と計算血行動態モデリングによる血管定量に対するこの方法の適合性をさらに実証しています。

概要

ボリュームイメージングは、心血管生理学と疾患の正確な研究に必要です。定量的イメージングは、無傷の体積寸法で高解像度の画像スタックを生成します。サンプルは、 in vivo の形態と内腔の体積を維持するために保存されるだけでなく、均一な高解像度容量でイメージングされる必要があります。高解像度のイメージングスタックから、ユーザーは血管の形状、構造、および接続性の完全な表示を可能にする高忠実度の3次元血管レンダリングを生成できます¹。

心血管構造は、2次元のバラバラなレンズを通して調べるときには正確に捉えることができない複雑な3次元の解剖学的特徴を持っています。ステレオスコープ広視野形態学的イメージングおよび組織学的切片は、複雑な3次元変異^1,2,3を捉えるには不十分です。マイクロおよびナノコンピュータ断層撮影画像は、定量的小動物体積イメージング^1,4のゴールドスタンダードですが、生物学界では広くアクセスできず、採用されていません。組織透明化および全臓器/小動物顕微鏡法における最近の革新により、全マウント透明化および血管標識技術の定量的応用が可能になりました^5,6,7。ティッシュクリアリングは、組織サンプル中の光の散乱を均質化し、光の散乱や吸収の可能性を下げることで、培地を通る光の伝播の遅延を減らす働きをします。高い透明性を得るには、蛍光シグナル標識の抗原性や輝度に影響を与える可能性のある厳密な組織処理が必要です⁸。ライトシート顕微鏡は、^{生物学者9}に広く採用されている高速で強力なイメージングツールとして登場し、走査型顕微鏡よりも数桁の速度向上と、サイズが1cmを超えるサンプルのイメージング能力を提供します。ライトシート蛍光顕微鏡(LSFM)により、レーザーは共焦点顕微鏡と比較して速度と深さを増してサンプルの断面を照らします。このため、この方法には高いサンプル透過性が必要です。

ここでは、著者らは最近のiDISCO+クリア法を適応させ、ニワトリ胚動物モデルのエンドペインティング¹⁰と組み合わせて、心血管発達の初期から後期までの有効性を示しています。iDISCO(Immunolabeling-enabled three-dimensional imaging of solvent-cleared organs)は、有機溶媒ベースの清浄法であり、水性清澄化法とは異なり、溶媒蒸発によるイメージングアーチファクトの影響を受けません。iDISCO+とiDISCO+が異なるのは、前者のテトラヒドロフラン脱水ステップ(iDISCO)が、より穏やかなメタノール脱水ステップとそれに続く脂質抽出ステップ(iDISCO+)に置き換えられる点です。iDISCO+クリアリング法の利点には、大きな成体サンプルや胚の免疫標識、組織の収縮率の低さ、透明性の高さなどがあります^8,11。重要なことは、iDISCO+は、従来の^組織学9のように組織全体の組織に関する情報が不足している小さな領域のサンプリングに限定されるのではなく、従来の生物学的免疫標識技術を拡張して、大きな臓器サンプルまたは胚全体の情報を取得することで、高解像度の画像スタックの生成を可能にすることです。iDISCO+の欠点は、遺伝的にコードされた蛍光タンパク質が保存されないという事実である¹¹。エンドペインティングの組織標識法は、左心室尖に0.5 mg/mlのFITC-poly-L-lysineを灌流したHH31-HH36ニワトリ胚心臓を用いた心血管欠損のハイスループットスクリーニングとして最初に導入されました。染料を4分間結合させてから、固定および保存^した10。

本研究では、同じFITC-ポリ-L-リジン濃度をより広い範囲の胚(HH18-HH34)に使用できることがわかりましたが、明るく標識された血管を確保するために理想的な固定時間(5〜10分)が見つかりました。現在のendo-DISCO技術のユーザーは、溶液が粘性が高すぎてすべての目的の血管を標識できない場合に、色素濃度を調整する(一度に0.1 mg / mLずつ減少する)ことを望むかもしれませんが、色素濃度を調整する前に、まず固定時間を調整し、左心室の筋肉収縮を最適化することをお勧めします。著者らは、0.1 mg/mLの濃度でエンドペインティングを試みたところ、色素は小さな血管を通じて広がりやすい一方で、PFA灌流時には洗い流されやすいことがわかりました。著者たちは、本手法で生成された高解像度イメージングスタックが、計算血行動態モデリングに十分な品質であることを明らかにした。血流経路と、圧力や壁面せん断応力分布を含む対応する血行動態力は、計算フローシミュレーション^1,12によってのみ解決できる複雑な局所パターンで発生します。これらの生体力学的力は、隣接する心血管組織の挙動に影響を及ぼし、血管の適応、成長、およびリモデリングを引き起こします¹³。局所的な血行動態力の値を理解することは、心血管機能と疾患の発症または進行のメカニズム調節因子に重要な光を当てます².

プロトコル

実験動物福祉局は、公衆衛生局の方針を、孵化後にのみ「脊椎動物」としてヒヨコモデルに適用されると解釈しています。これらの胚も同様に、動物施設管理委員会(IACUC)の管轄から免除されています。関連する国立衛生研究所のよくある質問は、http://grants.nih.gov/grants/olaw/faqs.htm#ApplicabilityofthePHSPolicy からアクセスできます。

1. 胚の採取、標識、固定

1. ファッションは、マイクロフォージ^1,12を使用して、内径0.75のガラスキャピラリーロッドをカットされたマイクロニードルに引っ張りました。
   注:必要なチップのサイズは、必要な動物の年齢/流量によって異なります。マイクロニードルは、マイクロダイセクション鉗子またはハサミを使用して切断することもできますが、精度は大幅に低下します。
2. Tyrodeの溶液を約38^°Cに温めます。
3. FITCポリ-L-リジン固体をTyrode溶液に溶解し、0.5 mg/mLのストック溶液を調製します。
   注:この濃度は、ニワトリ胚動脈の標識に最適化されています。他の組織タイプの最適な濃度は異なる場合があります。追加のストック溶液は-20°Cで保存する必要があります。
4. 鳥の胚(HH18(3日目)からHH34(8日目)まで、現在のひよこの心臓研究の範囲)を卵黄から解剖します 湾曲した先端のはさみで胚の周りを切り取り、トランスファーピペットまたはへらを使用して、胚を温かいタイロード溶液で満たされた35mmのペトリ皿に移します。
5. 胚を包み込んでいる絨毛膜と尿膜膜、および心臓の周りの心膜を細い先端の鉗子で慎重に取り除き、膜に小さな切開(~0.1 mm)を施して胚から引き離します。
6. 温かいタイロード溶液で満たされた新しいきれいなペトリ皿に胚を移し、心臓の鼓動を保ちます。
7. 5 mLのプラスチックシリンジに温かいTyrode溶液を入れます。0-20 μLのプラスチックピペットチップの広い方の端を切り取り、シリンジの平らな先端に取り付けます。シリンジは、細いピペットチップの直径まで延長されました。
8. 新たに固定されたピペットチップシリンジ装置に内径0.03インチのシリコンチューブのセグメントを取り付けることにより、「インジェクションライン」を構築します(ステップ1.7)。ガラスキャピラリーマイクロニードルをチューブの反対側の端に取り付けます。
9. マイクロマニピュレーターに取り付けられたマイクロインジェクションホルダーにマイクロニードルを取り付けます。シリコンチューブとマイクロニードルの気泡をパージします。
10. マイクロマニピュレータを使用して、針を心臓の頂点に挿入し、タイロードの溶液をゆっくりと心臓に注入することにより、胚^1,12を灌流します。胚から血液が大部分除去されるまで、胚の灌流を続けます。
11. マイクロマニピュレーターを使用して、針と注射ラインを挿入部位から引き戻し、次の注射ラインの準備中に針が邪魔されないように針を向けます。針とシリンジからシリコンチューブを取り外します。
    注:一部のユーザーは、針を心臓に取り付けたままにしておくのが最適であると感じる場合がありますが、その場合、ユーザーは針を所定の位置に保持したまま、針とシリンジの間のシリコンチューブを取り外す必要があります。
12. エンドペインティングを行い、血管内皮を緑色の蛍光で標識します。
    1. マイクロピペットを使用して、20〜40 μLのFITCポリ-L-リジンストック溶液をシリコンチューブにロードし、FITC液体バリアの前方に気泡が発生しないように注意してください。
    2. タイロードの溶液を充填した注射器を再度取り付け、マイクロマニピュレーターを使用して心臓の頂点にゆっくりと注入し、必要に応じて針を再挿入します。FITCポリ-L-リジンが拡散した後、気泡が心臓に入る前に針を取り外してください。.
    3. FITCポリ-L-リジンを胚に5〜10分間放置します。
       注:(オプションの品質チェック)蛍光を確認するには、蛍光灯ステレオまたはマクロスコープで写真を撮ります。この写真は、胚の清算が完了した後に脱水因子を決定するのに役立てることができます。
13. 5 mLシリンジに4%パラホルムアルデヒド(PFA)を充填し、シリコン注入チューブに取り付けて3番目の注入ステップを行います。
14. 胚^1,12を4%PFAで灌流し、すべての心血管構造が全容積容量に達し、組織がより不透明になり始めるまで灌流します。
15. サンプルを覆うのに十分な4%PFAで満たされた2〜5mLのバイアルに胚を静かにロードします。胚を過度に変形させないように注意してください。
    注:サンプルが押しつぶされたり変形したりしないように、目的のサンプルに十分な大きさのバイアルを選択してください。
16. 胚をシェーカーで4°Cで一晩インキュベートします。

2.胚の脱水と清澄化

1. 4% PFAを慎重にピペットで取り出します。
   注:この時点から、組織の損傷や変形を防ぐために、胚との直接の接触を避けてください。
2. 胚を洗浄するには、新鮮なリン酸緩衝液(PBS)で室温で30分間、静かに振とうしながら胚をインキュベートします。さらに2回繰り返して、合計3回の洗浄を行います。
3. ヒュームフードで胚の脱水を開始します。PBSを慎重にピペットで取り出し、室温でそれぞれ1時間ずつ、20%、40%、60%、80%、および100%のメタノール濃度の段階的な一連のメタノールインキュベーションで胚をインキュベートします。
4. 胚を新鮮な100%メタノールに室温で一晩放置します。
   注:(オプションの停止ポイント)。胚は、100%メタノール中で-20°Cで保存し、後で最大6ヶ月間使用することができます。
5. ヒュームフードで、脂質除去手順を開始します。胚を2:1(体積対体積)DCM:メタノール溶液で室温で3時間、穏やかに振とうしながらインキュベートします。
   注意: DCMは有毒であり、煙の中で取り扱わなければなりません。DCM を使用するときは、特に注意してください。ダブルグローブは、追加のバリアを提供するのに役立つ場合があります。
6. 桂皮エチル(ECi)を4°Cから取り出し、室温で解凍します。
7. 胚を新鮮な100%DCMで室温で15分間、振とうしながら洗浄します。100%DCM洗浄を繰り返して、合計2回の洗浄を達成します。
8. DCMをピペットで取り出し、胚を100%ECiでインキュベートします。胚が約1時間で透明になるまで、胚をECiに放置します。必要に応じてチューブを静かに振ってください。
9. (オプションの確認手順)透明化と血管染色の品質を蛍光ステレオまたはマクロスコープで調べます。胚の写真を撮って、ステージ/年齢固有の脱水スケーリング係数を決定します。
10. 透明化した胚は、イメージングの準備が整うまで4°Cで最大6ヶ月間保存し、胚を光から保護します。

3. データの取得

1. 胚をイメージングするには、ライトシート蛍光顕微鏡を使用します。光学的にクリアされた胚の頭部を、瞬間接着剤ジェルを使用してガラスキャピラリーに貼り付けます。
2. ガラスキャピラリーをサンプルホルダーに取り付け、イメージングチャンバーにECiを充填し、イメージングチャンバー内の胚を下げます。
3. パラメータを調整し、イメージングを行います。

4. 定量的応用:3次元再構成と計算流体力学モデリング

注:これらのステップでは、ライトシートで生成された高解像度画像スタックをオープンソースソフトウェアSimVascular¹⁴ にロードして、3D解剖学的再構成と計算流体力学モデリングを行います。SimVascular の Web サイトには、詳細なチュートリアルがあります ( 資料の表を参照)。再構築は、対象の船舶にパスラインを作成し、パスラインに沿って 2D セグメンテーションを作成し、ロフト セグメンテーションを 3D ソリッド モデルに結合することで構成されます。コンピュテーショナルモデリングは、メッシュ化されたジオメトリの準備、境界条件の定義、およびシミュレーションの実行で構成されます。

1. [ファイル] で新しい SVProject を作成し、[ 画像 ] を右クリックして [ 画像の追加/置換] をクリックして、高解像度のライトシート イメージング スタックをアップロードします。
2. ソフトウェアチュートリアルの手順に従って、血管の解剖学的構造をsilicoで再構築します。
   1. パスラインを作成するには、 パス を右クリックし、 パスの作成を選択します。目的の船舶に沿ってパスマーカーを配置します。対象の容器ごとに繰り返します。
   2. 作成した各パスラインについて、[Segmentations]を右クリックして[Create Contour Group]を選択し、2D船舶の断面をトレースします。船舶のパスを選択し、[Segmentation]の下の船舶名をダブルクリックして、手動のセグメンテーションを開始します。
   3. すべての船舶がセグメント化されたら、[ モデル ]を右クリックして[ モデルの作成]を選択し、モデルを作成します。 PolyData タイプを選択し、モデル名を入力してCreate Solid Modelをクリックし、モデルの一部にする必要があるすべてのセグメンテーションを選択します。
3. SimVascular SVMesher に組み込まれている Tetgen メッシャーを実行して、ジオメトリをメッシュ化します。最大エッジサイズを定義し、サーフェスとボリュームの両方のメッシュ化を実行します。
   注:血管内の細かい幾何学的詳細と局所的な血行動態の変動を解決できるメッシュサイズを選択してください。[ グローバル メッシュ サイズの見積もり ]ボタンから開始します。メッシュ収束スタディは、シミュレーションを最終決定する際に必要になる場合があります。
4. SimVascular ソルバーを使用して計算血流シミュレーションを設定します。シミュレーション ファイルを作成するには、[ Simulations ] を右クリックして [Create Simulation Job] を選択します。基本パラメータを調整し、特定の境界条件の入口と出口のBCを選択します。
   1. ソルバーパラメータを調整し、[Create Files and Run simulation]タブに移動してメッシュファイルを選択し、[ Create Data Files for Simulation]をクリックします。
5. ハイパフォーマンスコンピューティングワークステーションまたはスーパーコンピューターを使用してシミュレーションを起動します。

結果

ここに示す迅速なホールマウント高解像度イメージングプロトコル(図1、表1)は、 図2、 図3、 および図4に示すように、明確に輪郭が描かれた血管内腔を生成します。ニワトリの胚血管系内皮はGFP蛍光であるため、初期から成熟した心臓の発達までの胚段階にわたって緑色で輪?...

ディスカッション

3Dで生物学を研究する能力は、形態学的複雑さ、内部臓器構造、および血管接続を正確に理解するために重要です。正確で信頼性の高い3D血管画像は、被験者固有の計算血行動態シミュレーションの中心でもあり、多くの場合、壁のせん断応力や圧力分布などの主要な血行動態パラメータを定量化する唯一の信頼できる手段です。ここでは、LSFMを用いた小動物の高解?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5 forceps	Fine Science Tools	11252-30
#55-forceps	Fine Science Tools	11295-51
0.03 inch inner diameter silicone tubing	VWR	32829-182
20 μL pipette tips	VWR	76322-134
35 mm Petri dish	VWR	10799-192
5 mL plastic syringe	VWR	BD 309646
Dichloromethane (DCM)	Sigma-Aldrich	270997	Refer to MSDS. Stored in side cabinet under fume hood
Ethyl cinnamate (ECi)	Sigma-Aldrich	112372	Stored at 4 °C
Fine Curved scissors	Fine Science Tools	14061-09
FITC-poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P3069	Store at -20 °C (powder, stock solution), 4ºC (working solution)
Fluoresent microscope	EVIDENT SCIENTIFIC	MVX10
Glass capillary tubes (0.75 mm ID)	Sutter Instrument	FG-GB100-75-10
Lightsheet microscope	Zeiss	Z.1 system
Methanol	Sigma-Aldrich	M1775	Refer to MSDS. Stored in flammable cabinet under fume hood
Microforge	Narishige International USA, Inc.	MF2
Micromanipulator	World Percision Instrrument	M3301R
Paraformaldehyde (PFA) 4%	Thermo Scientific	J19943.K2	Refer to MSDS. Stored at -20 °C (powder), 4 °C (4% working solution)
Phosphate buffered saline (PBS)	Cytiva	SH30256.01	Stored on benchtop
SimVascular			open source software www.simvascular.org
Tyrode’s Solution			Made in-house