Imagerie rapide à haute résolution de l’ensemble du système vasculaire de petits animaux pour des études quantitatives

Résumé

Ce protocole introduit une méthode rapide pour l’imagerie vasculaire tridimensionnelle quantitative à montage entier à l’aide de la microscopie à fluorescence à feuillet de lumière. L’efficacité de la méthode est démontrée à l’aide du système d’artère de l’arc pharyngé du modèle d’embryon de poulet, avec des forces hémodynamiques quantifiées par la dynamique des fluides numérique.

Résumé

Dans les petits modèles animaux de développement cardiovasculaire et de maladies, les simulations informatiques spécifiques du flux sanguin permettent des évaluations quantitatives de paramètres hémodynamiques difficiles à mesurer expérimentalement. Les simulations numériques de la dynamique des fluides mettent en lumière les rôles critiques de la mécanique dans la fonction cardiovasculaire et la progression de la maladie. L’acquisition d’images volumétriques de haute qualité des récipients d’intérêt est essentielle à la précision et à la reproductibilité des résultats de mesure morphologique et de quantification des débits. Cette étude propose une méthode rapide, rentable et accessible pour l’imagerie haute résolution de l’ensemble du système vasculaire de petits animaux à l’aide de la microscopie à fluorescence à feuillet de lumière. Le protocole modifié iDISCO+ (immunomarking-enabled three-dimensional imaging of solvant-cleared organs) implique (1) le marquage du système vasculaire avec un agent fluorescent, (2) la préservation de l’échantillon et (3) la transparence de l’échantillon. Contrairement à l’iDISCO+ classique, qui utilise une coloration immunohistochimique, les auteurs marquent l’endothélium vasculaire avec de la poly-L-lysine marquée FITC, un colorant fluorescent non spécifique abordable qui résiste très bien au photo-blanchiment, dans un processus appelé « endo-peinture ». L’étiquetage rapide réduit le temps de préparation des échantillons d’environ quatre semaines à moins de 3 jours. De plus, l’utilisation de solvant peu dangereux (ECi) comme agent de clarification et solution d’imagerie rend les échantillons plus sûrs à manipuler et conformes à un plus large éventail d’installations d’imagerie. Le protocole proposé est appliqué pour obtenir des empilements d’images de microscopie à fluorescence à feuillet de lumière à haute résolution du système cardiovasculaire dans des embryons de poussin allant du jour 3 (HH18) au jour 8 (HH34). Cette étude démontre en outre l’adéquation de cette méthode pour la quantification vasculaire par reconstruction 3D et modélisation hémodynamique computationnelle d’un embryon de poussin du jour 5 (HH 26).

Introduction

L’imagerie volumétrique est nécessaire pour des études précises de la physiologie et des maladies cardiovasculaires. L’imagerie quantitative produit des piles d’images haute résolution avec des dimensions volumétriques intactes. Les échantillons doivent être conservés pour conserver leur morphologie et leur volume lumineux in vivo , ainsi que pour être imagés dans une capacité de haute résolution uniforme. À partir de piles d’imagerie haute résolution, l’utilisateur peut générer des rendus vasculaires tridimensionnels haute fidélité qui permettent un affichage complet de la forme, de la structure et de^{la connectivité des} vaisseaux1.

Les structures cardiovasculaires possèdent des caractéristiques anatomiques tridimensionnelles complexes qui ne peuvent pas être capturées avec précision lors de leur examen à travers une lentille bidimensionnelle et disjointe. L’imagerie morphologique à grand champ et les coupes histologiques stéréoscopiques sont inadéquates pour capturer des variations tridimensionnelles complexes ^1,2,3. Les images de micro et nano-tomographie sont la référence en matière d’imagerie volumétrique quantitative des petits animaux ^1,4, mais ne sont pas largement accessibles ou adoptées par la communauté biologique. Les innovations récentes en matière de nettoyage des tissus et de microscopie des organes entiers/petits animaux ont permis des applications quantitatives des techniques de nettoyage de la monture entière et de marquage vasculaire ^5,6,7. Le nettoyage des tissus permet d’homogénéiser la diffusion de la lumière dans les échantillons de tissus, réduisant ainsi les retards de propagation de la lumière à travers le milieu en diminuant le risque de diffusion ou d’absorption de la lumière. Une transparence élevée nécessite un traitement tissulaire rigoureux qui peut affecter l’antigénicité ou la luminosité du marquage du signal de fluorescence⁸. La microscopie à feuillet de lumière est devenue un outil d’imagerie rapide et puissant, largement adopté par les biologistes⁹, offrant un gain de vitesse de plusieurs ordres de grandeur par rapport aux microscopes à balayage et la capacité d’imager des échantillons de plus de 1 cm. Grâce à la microscopie à fluorescence à feuillet de lumière (LSFM), un laser illumine une section efficace d’échantillon avec une vitesse et une profondeur accrues par rapport à la microscopie confocale ; Pour cette raison, la méthode nécessite une grande transparence de l’échantillon.

Ici, les auteurs adaptent les méthodes récentes de nettoyage iDISCO+, en les combinant avec l’endo-peinture¹⁰ dans le modèle animal d’embryon de poussin pour mettre en évidence l’efficacité de la méthode du développement cardiovasculaire précoce à tardif. iDISCO (immunomarking-enabled three-dimensional imaging of solvant-cleared organs) est une méthode de clarification à base de solvant organique qui, contrairement aux méthodes basées sur la clarification aqueuse, n’est pas sujette à des artefacts d’imagerie causés par l’évaporation du solvant. iDISCO diffère de l’iDISCO+ en ce que l’étape de déshydratation du tétrahydrofurane du premier (iDISCO) est remplacée par une déshydratation plus douce du méthanol suivie d’une étape d’extraction des lipides (iDISCO+). Les avantages de la méthode de clarification iDISCO+ comprennent l’immunomarquage de grands échantillons d’adultes et d’embryons, un faible rétrécissement des tissus et une transparence élevée ^8,11. Il est important de noter qu’iDISCO+ permet de générer des piles d’images à haute résolution, en s’appuyant sur les techniques traditionnelles d’immunomarquage biologique pour obtenir des informations sur de grands échantillons d’organes ou sur un embryon entier plutôt que de se limiter à l’échantillonnage de petites régions qui manquent d’informations sur l’ensemble de l’organisation au niveau tissulaire, comme avec l’histologie traditionnelle⁹. Les inconvénients d’iDISCO+ incluent le fait que les protéines fluorescentes génétiquement codées ne sont pas préservées¹¹. La méthode de marquage tissulaire de l’endo-peinture a d’abord été introduite en tant que dépistage à haut débit des anomalies cardiovasculaires à l’aide de cœurs d’embryons de poulet HH31-HH36 qui ont été perfusés avec 0,5 mg/ml de FITC-poly-L-lysine dans l’apex ventriculaire gauche. Le colorant a été laissé se lier pendant 4 minutes avant la fixation et le stockage¹⁰.

La présente étude a révélé que la même concentration de FITC-poly-L-lysine pouvait être utilisée pour une plus large gamme d’embryons (HH18 - HH34), mais a révélé que le temps de fixation idéal variait (de 5 à 10 minutes) pour garantir des vaisseaux clairement étiquetés. Les utilisateurs de la technique endo-DISCO actuelle voudront peut-être ajuster la concentration du colorant (diminuant de 0,1 mg/mL à la fois) si la solution s’avère trop visqueuse pour marquer tous les vaisseaux souhaités, mais ils sont encouragés à ajuster d’abord le temps de fixation et à optimiser la contraction musculaire du ventricule gauche avant d’ajuster la concentration du colorant. Les auteurs ont tenté une endopeinture à une concentration de 0,1 mg/mL et ont constaté que même si le colorant se répandait plus facilement à travers les petits vaisseaux, il était plus facilement emporté lors de la perfusion de PFA. Les auteurs montrent que les piles d’imagerie à haute résolution générées par la présente technique sont de qualité suffisante pour la modélisation hémodynamique computationnelle. Les voies d’écoulement sanguin et les forces hémodynamiques correspondantes, y compris les distributions de pression et de contrainte de cisaillement de la paroi, se produisent selon des modèles localisés complexes qui ne peuvent être résolus que par des simulations de flux^{informatiques1,12}. Ces forces biomécaniques affectent le comportement des tissus cardiovasculaires adjacents et déclenchent l’adaptation, la croissance et le remodelage vasculaires¹³. La compréhension des valeurs locales de la force hémodynamique jette une lumière critique sur les régulateurs mécanistes de la fonction cardiovasculaire et de l’initiation ou de la progression de la maladie².

Protocole

Le Bureau du bien-être des animaux de laboratoire interprète la politique du Service de santé publique comme s’appliquant au modèle du poussin en tant qu'« animal vertébré » uniquement après l’éclosion. De même, ces embryons sont exemptés de la compétence du Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (IACUC). La foire aux questions pertinente des National Institutes of Health peut être consultée à l’adresse suivante : http://grants.nih.gov/grants/olaw/faqs.htm#ApplicabilityofthePHSPolicy.

1. Collecte, étiquetage et fixation des embryons

1. Fashion a tiré des tiges capillaires en verre de 0,75 diamètre intérieur dans des micro-aiguilles coupées à l’aide d’une microforge ^1,12.
   REMARQUE : La taille de l’embout nécessaire dépend de l’âge/débit souhaité de l’animal. La micro-aiguille peut également être coupée à l’aide d’une pince de microdissection ou de ciseaux avec une précision considérablement réduite.
2. Réchauffez la solution de Tyrode à environ 38^°C.
3. Dissoudre la poly-L-lysine solide de FITC dans la solution de Tyrode pour préparer une solution mère à 0,5 mg/mL.
   REMARQUE : Cette concentration est optimisée pour l’étiquetage des artères des embryons de poulet. La concentration optimale pour d’autres types de tissus peut varier. La solution mère supplémentaire doit être conservée à -20 °C.
4. Disséquez l’embryon d’oiseau (allant de HH18 (jour 3) à HH34 (jour 8) pour la présente étude cardiaque de poussin) du jaune d’œuf en coupant autour de l’embryon avec des ciseaux à bout incurvé et en utilisant une pipette de transfert ou une spatule pour transférer l’embryon dans une boîte de Pétri de 35 mm remplie de solution chaude de Tyrode.
5. Retirez avec précaution les membranes choriales et allantoïdiennes qui enveloppent l’embryon et la membrane péricardique autour du cœur à l’aide d’une pince à pointe fine en faisant de minuscules incisions (~0,1 mm) dans les membranes et en les éloignant de l’embryon.
6. Transférez l’embryon dans une nouvelle boîte de Pétri propre remplie de solution chaude de Tyrode pour maintenir le cœur battant.
7. Remplissez une seringue en plastique de 5 ml avec la solution chaude de Tyrode. Coupez l’extrémité large d’une pointe de pipette en plastique de 0 à 20 μL et fixez-la à l’extrémité plate de la seringue. La seringue a maintenant été étendue au diamètre fin de l’embout de la pipette.
8. Construisez une « ligne d’injection » en fixant un segment de tube en silicone de 0,03 pouce de diamètre intérieur à l’appareil à pointe-seringue de pipette nouvellement fixé (étape 1.7). Fixez une micro-aiguille capillaire en verre à l’extrémité opposée du tube.
9. Montez la micro-aiguille sur le support de micro-injection fixé à un micromanipulateur. Purgez le tube en silicone et la micro-aiguille des bulles d’air.
10. À l’aide du micromanipulateur, insérez l’aiguille dans l’apex du cœur et perfuser l’embryon ^1,12 en injectant lentement la solution de Tyrode dans le cœur. Continuez à perfuser l’embryon jusqu’à ce qu’il soit largement débarrassé de son sang.
11. À l’aide du micromanipulateur, tirez l’aiguille et la ligne d’injection vers l’arrière de leur site d’insertion et orientez l’aiguille de manière à ce qu’elle ne soit pas dérangée lors de la préparation de la prochaine ligne d’injection. Retirez le tube en silicone de l’aiguille et de la seringue.
    REMARQUE : Certains utilisateurs peuvent trouver optimal de garder l’aiguille attachée au cœur, auquel cas l’utilisateur doit retirer le tube en silicone entre l’aiguille et la seringue, tout en maintenant l’aiguille en place.
12. Effectuez une endo-peinture pour marquer l’endothélium vasculaire avec une fluorescence verte.
    1. À l’aide d’une micropipette, chargez 20 à 40 μL de solution mère de poly-L-lysine FITC dans le tube de silicone, en prenant soin de ne pas créer de bulles d’air devant la barrière de liquide FITC.
    2. Remettez en place la seringue remplie de solution de Tyrode et utilisez le micromanipulateur pour injecter lentement dans l’apex du cœur, en réinsérant l’aiguille si nécessaire. Retirez l’aiguille après que la poly-L-lysine FITC a été diffusée et avant que des bulles d’air ne pénètrent dans le cœur.
    3. Laissez la poly-L-lysine FITC reposer dans l’embryon pendant 5 à 10 min.
       REMARQUE : (contrôle de qualité facultatif) Pour vérifier la fluorescence, prenez une photo avec une stéréo fluorescente ou un macroscope. L’image peut être utilisée pour aider à déterminer un facteur de déshydratation une fois l’élimination de l’embryon terminée.
13. Remplissez une seringue de 5 ml avec du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % et fixez-la à la tubulure d’injection de silicone pour une troisième étape d’injection.
14. Perfuser l’embryon ^1,12 avec 4 % de PFA jusqu’à ce que toutes les structures cardiovasculaires soient à leur pleine capacité et que le tissu commence à devenir plus opaque.
15. Chargez doucement l’embryon dans un flacon de 2 à 5 ml rempli d’une quantité suffisante de PFA à 4 % pour couvrir l’échantillon. Veillez à ne pas déformer excessivement l’embryon.
    REMARQUE : Choisissez un flacon suffisamment grand pour l’échantillon d’intérêt afin d’éviter d’écraser ou de déformer l’échantillon.
16. Incuber l’embryon pendant la nuit à 4 °C à l’aide d’un agitateur.

2. Déshydratation et élimination de l’embryon

1. Pipetez soigneusement le PFA à 4 %.
   REMARQUE : À partir de ce moment, évitez tout contact direct avec l’embryon pour éviter d’endommager ou de déformer les tissus.
2. Pour laver l’embryon, incubez l’embryon dans une solution tampon de phosphate fraîche (PBS) à température ambiante pendant 30 minutes tout en secouant doucement. Répétez deux fois de plus pour un total de 3 lavages.
3. Commencez à déshydrater l’embryon dans une hotte. Pipetez soigneusement le PBS et incubez l’embryon dans une série graduée de 5 incubations de méthanol à température ambiante pendant 1 h chacune : 20 %, 40 %, 60 %, 80 % et 100 % de concentration de méthanol.
4. Laissez l’embryon dans du méthanol frais à 100 % à température ambiante pendant la nuit.
   REMARQUE : (Point d’arrêt facultatif). Les embryons peuvent être conservés à -20 °C dans du méthanol à 100 % pour une utilisation ultérieure jusqu’à 6 mois.
5. Dans la hotte, commencez la procédure d’élimination des lipides. Incuber l’embryon dans une solution de méthanol 2:1 (volume à volume) : solution de méthanol à température ambiante pendant 3 h, en agitant doucement.
   ATTENTION : Le DCM est toxique et doit être manipulé dans la hotte. Prenez des précautions supplémentaires lorsque vous travaillez avec DCM. Des gants doubles peuvent aider à fournir une barrière supplémentaire.
6. Prélever le cinnamate d’éthyle (ECi) à 4 °C et le laisser décongeler à température ambiante.
7. Laver les embryons dans du DCM frais à 100 % à température ambiante pendant 15 min, en les secouant. Répétez le lavage à 100 % DCM pour obtenir un total de 2 lavages.
8. Pipetez le DCM et incubez l’embryon à 100 % ECi. Laissez l’embryon dans ECi jusqu’à ce qu’il disparaisse en environ 1 h. Secouez doucement le tube si nécessaire.
9. (Étape de vérification facultative) Examinez la qualité du nettoyage et de la coloration des vaisseaux à l’aide d’un stéréoscope ou d’un macroscope fluorescent. Prenez une photo de l’embryon pour déterminer le facteur d’échelle de déshydratation spécifique au stade ou à l’âge.
10. Conservez l’embryon éliminé à 4 °C jusqu’à 6 mois jusqu’à ce qu’il soit prêt à être imagé, en gardant l’embryon à l’abri de la lumière.

3. Acquisition des données

1. Pour imager les embryons, utilisez un microscope fluorescent à feuillet de lumière. Fixez la tête d’un embryon optiquement dégagé à un capillaire en verre à l’aide de gel de superglue.
2. Montez le capillaire en verre sur le porte-échantillon, remplissez la chambre d’imagerie avec ECi et abaissez l’embryon dans la chambre d’imagerie.
3. Ajustez les paramètres et effectuez l’imagerie.

4. Application quantitative : reconstruction 3D et modélisation numérique de la dynamique des fluides

REMARQUE : Dans ces étapes, des piles d’images haute résolution générées par des feuilles de lumière sont chargées dans le logiciel open source SimVascular¹⁴ pour la reconstruction anatomique 3D et la modélisation numérique de la dynamique des fluides. Des tutoriels détaillés existent sur le site SimVascular (voir Table des matériaux). La reconstruction consiste à créer des trajectoires dans les récipients d’intérêt, à créer des segmentations 2D le long des trajectoires et à combiner des segmentations lissées dans un modèle solide 3D. La modélisation informatique consiste à préparer une géométrie maillée, à définir des conditions aux limites et à exécuter des simulations.

1. Créez un nouveau SVProject sous Fichier et téléchargez une pile d’imagerie à feuille de lumière haute résolution en cliquant avec le bouton droit de la souris sur Images , puis en cliquant sur ajouter/remplacer une image.
2. Suivez les étapes du tutoriel du logiciel pour reconstruire les anatomies vasculaires in silico.
   1. Créez un chemin d’accès en cliquant avec le bouton droit de la souris sur Chemins d’accès et en sélectionnant Créer un chemin d’accès. Placez des balises de chemin le long d’un récipient d’intérêt. Répétez l’opération pour chaque récipient d’intérêt.
   2. Pour chaque chemin créé, tracez des coupes transversales de navire 2D en cliquant avec le bouton droit de la souris sur Segmentations et en sélectionnant le groupe Créer un contour. Sélectionnez le chemin du navire et double-cliquez sur le nom du navire sous Segmentation pour commencer la segmentation manuelle.
   3. Une fois que tous les navires ont été segmentés, créez un modèle en cliquant avec le bouton droit de la souris sur Modèles , puis en sélectionnant Créer un modèle. Sélectionnez le type PolyData , entrez un nom de modèle, cliquez sur Créer un modèle solide et sélectionnez toutes les segmentations qui doivent faire partie du modèle.
3. Maillez la géométrie en exécutant le mailleur Tetgen intégré à SimVascular SVMesher. Définissez une taille d’arête maximale et effectuez un maillage de surface et de volume.
   REMARQUE : Choisissez une taille de maille qui peut résoudre les détails géométriques fins et les variabilités hémodynamiques localisées dans le vaisseau. Commencez par le bouton Estimer une taille de maillage globale . Une étude de convergence du maillage peut être nécessaire lors de la finalisation des simulations.
4. Configurez une simulation computationnelle du flux sanguin à l’aide du solveur SimVascular. Créez des fichiers de simulation en cliquant avec le bouton droit de la souris sur Simulations et en sélectionnant Créer une tâche de simulation. Ajustez les paramètres de base et sélectionnez les BC d’entrée et de sortie pour des conditions limites spécifiques.
   1. Ajustez les paramètres du solveur, accédez à l’onglet Créer des fichiers et exécuter la simulation, sélectionnez le fichier de maillage, cliquez sur Créer des fichiers de données pour la simulation.
5. Lancez la simulation à l’aide d’une station de travail ou d’un supercalculateur de calcul haute performance.

Résultats

Le protocole d’imagerie rapide à haute résolution présenté ici (Figure 1, Tableau 1) produit des lumières vasculaires clairement délimitées, comme le montrent les figures 2, 3 et 4, où l’endothélium vasculaire de l’embryon de poussin est fluorescent à la GFP et donc décrit en vert à travers les stades embryonnaires, du développement cardiaque précoce...

Discussion

La capacité d’étudier la biologie en 3D est essentielle à une compréhension précise de la complexité morphologique, de la structure des organes internes et des connexions vasculaires. Des images vasculaires 3D précises et fiables sont également essentielles aux simulations hémodynamiques computationnelles spécifiques à un sujet, qui sont souvent le seul moyen fiable de quantifier des paramètres hémodynamiques clés tels que la contrainte de cisaillement de la paroi et la d...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5 forceps	Fine Science Tools	11252-30
#55-forceps	Fine Science Tools	11295-51
0.03 inch inner diameter silicone tubing	VWR	32829-182
20 μL pipette tips	VWR	76322-134
35 mm Petri dish	VWR	10799-192
5 mL plastic syringe	VWR	BD 309646
Dichloromethane (DCM)	Sigma-Aldrich	270997	Refer to MSDS. Stored in side cabinet under fume hood
Ethyl cinnamate (ECi)	Sigma-Aldrich	112372	Stored at 4 °C
Fine Curved scissors	Fine Science Tools	14061-09
FITC-poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P3069	Store at -20 °C (powder, stock solution), 4ºC (working solution)
Fluoresent microscope	EVIDENT SCIENTIFIC	MVX10
Glass capillary tubes (0.75 mm ID)	Sutter Instrument	FG-GB100-75-10
Lightsheet microscope	Zeiss	Z.1 system
Methanol	Sigma-Aldrich	M1775	Refer to MSDS. Stored in flammable cabinet under fume hood
Microforge	Narishige International USA, Inc.	MF2
Micromanipulator	World Percision Instrrument	M3301R
Paraformaldehyde (PFA) 4%	Thermo Scientific	J19943.K2	Refer to MSDS. Stored at -20 °C (powder), 4 °C (4% working solution)
Phosphate buffered saline (PBS)	Cytiva	SH30256.01	Stored on benchtop
SimVascular			open source software www.simvascular.org
Tyrode’s Solution			Made in-house