הדמיה מהירה ברזולוציה גבוהה של כלי דם של בעלי חיים קטנים למחקרים כמותיים

Summary

פרוטוקול זה מציג שיטה מהירה להדמיית כלי דם תלת מימדית כמותית באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של יריעות אור. יעילות השיטה מודגמת באמצעות מערכת עורקי קשת הלוע של מודל עובר האפרוח, עם כוחות המודינמיים המכומתים באמצעות דינמיקת נוזלים חישובית.

Abstract

במודלים של בעלי חיים קטנים של התפתחות ומחלות לב וכלי דם, סימולציות חישוביות ספציפיות לנבדק של זרימת הדם מאפשרות הערכות כמותיות של מדדים המודינמיים שקשה למדוד בניסוי. סימולציות דינמיות של נוזלים חישוביים שופכות אור על התפקידים הקריטיים של המכניקה בתפקוד הלב וכלי הדם והתקדמות המחלה. רכישת תמונות נפחיות באיכות גבוהה של כלי השיט המעניינים היא מרכזית לדיוק ולשחזור של תוצאות מדידה מורפולוגית וכימות זרימה. מחקר זה מציע שיטה מהירה, חסכונית ונגישה להדמיה ברזולוציה גבוהה של כלי דם של בעלי חיים קטנים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של יריעות אור. פרוטוקול הכנת דגימת גיליון האור iDISCO+ (הדמיה תלת מימדית המאפשרת תיוג חיסוני של איברים מנוקים מממס) כולל (1) תיוג כלי דם עם חומר פלואורסצנטי, (2) שימור הדגימה ו-(3) הפיכת הדגימה לשקופה. בניגוד ל-iDISCO+ הקלאסי, המשתמש בצביעה אימונוהיסטוכימית, המחברים מתייגים אנדותל כלי דם עם פולי-L-ליזין מתויג FITC, צבע פלואורסצנטי לא ספציפי במחיר סביר ועמיד מאוד בפני הלבנת פוטו, בתהליך המכונה "אנדו-צביעה". התיוג המהיר מפחית את זמן הכנת הדגימה מכארבעה שבועות לפחות משלושה ימים. יתר על כן, השימוש בממס אתיל צינמט (ECi) בעל סיכון מינימלי כחומר הסליקה ופתרון ההדמיה הופך את הדגימות לבטוחות יותר לטיפול ותואמות למגוון רחב יותר של מתקני הדמיה. הפרוטוקול המוצע מיושם להשגת ערימות תמונות מיקרוסקופיה פלואורסצנטיות ברזולוציה גבוהה של מערכת הלב וכלי הדם בעוברי אפרוחים הנעים בין יום 3 (HH18) ליום 8 (HH34). מחקר זה מדגים עוד יותר את התאמתה של שיטה זו לכימות כלי דם באמצעות שחזור תלת מימד ומודלים המודינמיים חישוביים של עובר אפרוח ביום 5 (HH 26).

Introduction

הדמיה נפחית נחוצה למחקרים מדויקים של פיזיולוגיה ומחלות לב וכלי דם. הדמיה כמותית מפיקה ערימות תמונות ברזולוציה גבוהה עם ממדים נפחיים שלמים. יש לשמר את הדגימות כדי לשמור על המורפולוגיה והנפח הלומן שלהן וכן לצלם אותן בקיבולת אחידה ברזולוציה גבוהה. מערימות הדמיה ברזולוציה גבוהה, המשתמש יכול ליצור עיבודי כלי דם תלת מימדיים בנאמנות גבוהה המאפשרים תצוגה מלאה של צורות כלי הדם, המבנה והקישוריות¹.

למבנים קרדיווסקולריים יש תכונות אנטומיות תלת מימדיות מורכבות שלא ניתן ללכוד במדויק כאשר בוחנים אותם דרך עדשה דו מימדית ומפורקת. סטריאוסקופ, הדמיה מורפולוגית בשדה רחב וחתכים היסטולוגיים אינם מספיקים ללכידת וריאציות תלת מימדיות מורכבות ^1,2,3. תמונות טומוגרפיה מיקרו וננו ממוחשבות הן תקן הזהב להדמיה כמותית של בעלי חיים קטנים ^1,4, אך אינן נגישות או מאומצות באופן נרחב בקרב הקהילה הביולוגית. החידושים האחרונים בניקוי רקמות ומיקרוסקופיה של איברים שלמים/בעלי חיים קטנים אפשרו יישומים כמותיים של טכניקות ניקוי תושבת שלמות ותיוג כלי דם ^5,6,7. ניקוי רקמות פועל להומוגניזציה של פיזור האור בדגימות רקמה, ובכך מפחית את העיכובים בהתפשטות האור דרך המדיום על ידי הורדת הסיכוי לפיזור או ספיגת אור. שקיפות גבוהה דורשת עיבוד רקמות קפדני שעלול להשפיע על האנטיגניות או הבהירות של תיוג אותות הקרינה⁸. מיקרוסקופיה של גיליון אור התגלתה ככלי הדמיה מהיר ורב עוצמה שאומץ באופן נרחב על ידי ביולוגים⁹, ומציע עלייה במהירות בכמה סדרי גודל על פני מיקרוסקופים סורקים ויכולת לדמות דגימות בגודל של יותר מ-1 ס"מ. באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של יריעות אור (LSFM), לייזר מאיר חתך דגימה במהירות ועומק מוגברים בהשוואה למיקרוסקופיה קונפוקלית; מסיבה זו, השיטה דורשת שקיפות מדגם גבוהה.

כאן, המחברים מאמצים שיטות ניקוי iDISCO+ עדכניות, ומשלבים אותן עם ציור אנדו¹⁰ במודל חיות עובר אפרוחים כדי להציג את יעילות השיטה מהתפתחות קרדיווסקולרית מוקדמת עד מאוחרת. iDISCO (הדמיה תלת מימדית המאפשרת תיוג חיסוני של איברים מנוקים ממסים) היא שיטת ניקוי אורגנית מבוססת ממס, אשר, בניגוד לשיטות מבוססות ניקוי מימי, אינה כפופה להדמיה של חפצים הנגרמים על ידי אידוי ממס. iDISCO שונה מ-iDISCO+ בכך ששלב ההתייבשות הטטרהידרופורן של הראשון (iDISCO) מוחלף בהתייבשות מתנול מתונה יותר ואחריה שלב מיצוי שומנים (iDISCO+). היתרונות של שיטת הניקוי iDISCO+ כוללים תיוג חיסוני של דגימות ועוברים בוגרים גדולים, התכווצות רקמות נמוכה ושקיפות גבוהה ^8,11. חשוב לציין, iDISCO+ מאפשר יצירת ערימות תמונות ברזולוציה גבוהה, תוך הרחבת טכניקות תיוג חיסוני מסורתיות של ביולוגיה כדי להשיג מידע על דגימות איברים גדולות או עובר שלם במקום להיות מוגבל לדגימה של אזורים קטנים שחסרים מידע על כל הארגון ברמת הרקמה, כמו בהיסטולוגיה מסורתית⁹. החסרונות של iDISCO+ כוללים את העובדה שחלבונים פלואורסצנטיים מקודדים גנטית אינם נשמרים¹¹. שיטת תיוג הרקמות של צביעת אנדו הוצגה לראשונה כסינון תפוקה גבוהה למומים קרדיווסקולריים באמצעות לבבות עוברי אפרוחים HH31-HH36 שהוחדרו עם 0.5 מ"ג/מ"ל של FITC-פולי-L-ליזין בקודקוד החדר השמאלי. הצבע הותר להיקשר במשך 4 דקות לפני קיבוע ואחסון¹⁰.

המחקר הנוכחי מצא כי אותו ריכוז FITC-פולי-L-ליזין יכול לשמש למגוון רחב יותר של עוברים (HH18 - HH34) אך מצא שזמן הקיבוע האידיאלי משתנה (בין 5-10 דקות) כדי להבטיח כלי דם עם תווית בהירה. משתמשים בטכניקת האנדו-דיסקו הנוכחית עשויים לרצות להתאים את ריכוז הצבע (ירידה ב-0.1 מ"ג/מ"ל בכל פעם) אם התמיסה תתברר כצמיגה מכדי לסמן את כל כלי הדם הרצויים, אך מומלץ להתאים תחילה את זמן הקיבוע ולייעל את התכווצות השרירים של החדר השמאלי לפני התאמת ריכוז הצבע. המחברים ניסו לצבוע אנדו בריכוז של 0.1 מ"ג/מ"ל ומצאו שבעוד שהצבע מתפשט ביתר קלות דרך כלי דם קטנים, הוא נשטף ביתר קלות עם זלוף PFA. המחברים מראים כי ערימות ההדמיה ברזולוציה גבוהה שנוצרו באמצעות הטכניקה הנוכחית הן באיכות מספקת למודלים המודינמיים חישוביים. מסלולי זרימת דם וכוחות המודינמיים מתאימים, כולל התפלגות לחץ וגזירה של קירות, מתרחשים בדפוסים מקומיים מורכבים שניתן לפתור רק באמצעות סימולציות זרימה חישוביות ^1,12. כוחות ביומכניים אלה משפיעים על התנהגותן של רקמות לב וכלי דם סמוכות ומעוררים הסתגלות של כלי הדם, צמיחה ועיצוב מחדש¹³. הבנת ערכי הכוח ההמודינמיים המקומיים שופכת אור קריטי על הרגולטורים המכאניסטיים של תפקוד הלב וכלי הדם והתחלת או התקדמות מחלות².

Protocol

המשרד לרווחת חיות מעבדה מפרש את מדיניות שירותי בריאות הציבור כחלה על מודל הגוזלים כ"חיית חוליות" רק לאחר הבקיעה. עוברים אלה פטורים באופן דומה מסמכות השיפוט של הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC). ניתן לגשת לשאלות הנפוצות הרלוונטיות של מכוני הבריאות הלאומיים בכתובת: http://grants.nih.gov/grants/olaw/faqs.htm#ApplicabilityofthePHSPolicy.

1. איסוף עוברים, תיוג וקיבוע

1. אופנה משכה מוטות נימי זכוכית בקוטר פנימי של 0.75 לתוך מחטים זעירות חתוכות באמצעות microforge ^1,12.
   הערה: גודל הקצה הנדרש תלוי בגיל/קצב הזרימה הרצוי של בעל החיים. לחלופין, ניתן לחתוך את המיקרו-מחט באמצעות מלקחיים או מספריים עם דיוק מופחת מאוד.
2. יש לחמם את התמיסה של Tyrode לכ-38 ^{מעלות צלזיוס.}
3. ממיסים מוצק פולי-L-ליזין FITC בתמיסה של Tyrode להכנת תמיסת מלאי של 0.5 מ"ג/מ"ל.
   הערה: ריכוז זה מותאם לתיוג עורקי עוברי אפרוחים. הריכוז האופטימלי עבור סוגי רקמות אחרים עשוי להשתנות. יש לאחסן את תמיסת המלאי הנוספת בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
4. נתחו את עובר העופות (החל מ-HH18 (יום 3) ועד HH34 (יום 8) עבור מחקר לב האפרוח הנוכחי) מחלמון הביצה על ידי חיתוך סביב העובר עם מספריים מעוקלים ושימוש בפיפטה או מרית כדי להעביר את העובר לצלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ מלאה בתמיסת טירוד חמה.
5. הסר בזהירות את הממברנות הכוריוניות והאלנטואיות העוטפות את העובר ואת קרום קרום הלב סביב הלב בעזרת מלקחיים עדינים על ידי ביצוע חתכים זעירים (~0.1 מ"מ) בקרומים ומשיכתם הרחק מהעובר.
6. העבירו את העובר לצלחת פטרי חדשה ונקייה מלאה בתמיסת טירוד חמה כדי לשמור על פעימות הלב.
7. מלאו מזרק פלסטיק של 5 מ"ל בתמיסה חמה של Tyrode. חתוך את הקצה הרחב של קצה פיפטה מפלסטיק 0-20 מיקרוליטר והצמד אותו לקצה השטוח של המזרק. המזרק הורחב כעת לקוטר קצה הפיפטה העדין.
8. בנה "קו הזרקה", על ידי הצמדת קטע של צינורות סיליקון בקוטר פנימי של 0.03 אינץ' למנגנון מזרק קצה הפיפטה המאובטח החדש (שלב 1.7). חבר מיקרו-מחט נימית מזכוכית לקצה הנגדי של הצינור.
9. התקן את המיקרו-מחט על מחזיק המיקרו-הזרקה המחובר למיקרומניפולטור. נקה את צינורות הסיליקון והמיקרו-מחט מבועות אוויר.
10. באמצעות המיקרומניפולטור, הכנס את המחט לקודקוד הלב והחדיר את העובר ^1,12 על ידי הזרקה איטית של התמיסה של טירוד ללב. המשיכו לחלחל את העובר עד שהוא מתנקה ברובו מדם.
11. השתמש במיקרומניפולטור כדי למשוך את המחט וקו ההזרקה לאחור ממקום ההחדרה שלה ולכוון את המחט כך שלא תופרע במהלך הכנת קו ההזרקה הבא. הסר את צינור הסיליקון מהמחט והמזרק.
    הערה: חלק מהמשתמשים עשויים למצוא את זה אופטימלי לשמור על המחט מחוברת ללב, ובמקרה זה על המשתמש להסיר את צינור הסיליקון בין המחט למזרק, תוך שמירה על המחט במקומה.
12. בצע צביעה אנדו כדי לתייג את האנדותל של כלי הדם עם פלואורסצנטיות ירוקה.
    1. בעזרת מיקרופיפטה, טען 20-40 מיקרוליטר של תמיסת מלאי פולי-L-ליזין של FITC לתוך צינור הסיליקון, היזהר לא ליצור בועות אוויר לפני מחסום הנוזל של FITC.
    2. חבר מחדש את המזרק המלא בתמיסה של טירוד והשתמש במיקרומניפולטור כדי להזריק לאט לקודקוד הלב, והחדיר מחדש את המחט במידת הצורך. הסר את המחט לאחר פיזור הפולי-L-ליזין של FITC ולפני כניסת בועות אוויר ללב.
    3. תן לפולי-L-ליזין של FITC לשבת בעובר למשך 5-10 דקות.
       הערה: (בדיקת איכות אופציונלית) כדי לאמת פלואורסצנטיות, צלם תמונה באמצעות סטריאו פלואורסצנטי או מקרוסקופ. התמונה עשויה לשמש כדי לסייע בקביעת גורם התייבשות לאחר השלמת פינוי העוברים.
13. מלאו מזרק של 5 מ"ל ב-4% פרפורמלדהיד (PFA) והצמידו אותו לצינור הזרקת הסיליקון לשלב הזרקה שלישי.
14. החדרת העובר ^1,12 עם 4% PFA עד שכל מבני הלב וכלי הדם נמצאים בקיבולת נפח מלאה והרקמה מתחילה להיות אטומה יותר.
15. טען בעדינות את העובר לתוך בקבוקון של 2-5 מ"ל מלא במספיק 4% PFA כדי לכסות את הדגימה. הקפד לא לעוות את העובר יתר על המידה.
    הערה: בחר בקבוקון גדול מספיק עבור הדגימה המעניינת כדי למנוע ריסוק או עיוות של הדגימה.
16. דגרו את העובר למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בעזרת שייקר.

2. התייבשות וניקוי עוברים

1. יש להוציא בזהירות את ה-4% PFA.
   הערה: מנקודה זו ואילך, הימנע ממגע ישיר עם העובר כדי למנוע נזק או עיוות לרקמות.
2. כדי לשטוף את העובר, דגרו את העובר בתמיסת חיץ פוספט טרייה (PBS) בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות תוך ניעור עדין. חזור על הפעולה פעמיים נוספות בסך הכל 3 כביסות.
3. התחל לייבש את העובר במכסה אדים. יש להוציא בזהירות את ה-PBS ולדגור את העובר בסדרה מדורגת של 5 דגירות מתנול בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת כל אחת: 20%, 40%, 60%, 80% ו-100% ריכוז מתנול.
4. השאירו את העובר ב-100% מתנול טרי בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
   הערה: (נקודת עצירה אופציונלית). ניתן לאחסן עוברים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס ב-100% מתנול לשימוש מאוחר יותר עד 6 חודשים.
5. במכסה האדים, התחל בהליך הסרת השומנים. דגירה של עובר ב-DCM 2:1 (נפח לנפח): תמיסת מתנול בטמפרטורת החדר למשך 3 שעות, תוך ניעור עדין.
   זהירות: DCM רעיל ויש לטפל בו באדים. נקוט באמצעי זהירות נוספים בעת עבודה עם DCM. כפפות כפולות עשויות לעזור לספק מחסום נוסף.
6. הוציאו אתיל צינמט (ECi) מ-4 מעלות צלזיוס והשאירו אותו בטמפרטורת החדר להפשרה.
7. שוטפים עוברים ב-100% DCM טרי בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות, תוך ניעור. חזור על שטיפה של 100% DCM כדי להשיג סה"כ 2 כביסות.
8. הוציא DCM ודגר את העובר ב-100% ECi. השאירו את העובר ב-ECi עד שהוא מתנקה תוך כשעה. יש לנער בעדינות את הצינור במידת הצורך.
9. (שלב אימות אופציונלי) בדוק את איכות הפינוי והצביעה בכלי הדם באמצעות סטריאו פלואורסצנטי או מקרוסקופ. צלם תמונה של העובר כדי לקבוע את גורם קנה המידה של ההתייבשות הספציפי לשלב/גיל.
10. אחסן את העובר הנקי בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד 6 חודשים עד שהוא מוכן לצילום, תוך שמירה על העובר מוגן מפני אור.

3. רכישת נתונים

1. כדי לדמות עוברים, השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי של יריעת אור. הצמד את ראשו של עובר מנוקה אופטית לנימים מזכוכית באמצעות ג'ל דבק-על.
2. הרכיבו את נימי הזכוכית למחזיק הדגימה, מלאו את תא ההדמיה ב-ECi והורידו את העובר בתא ההדמיה.
3. התאם את הפרמטרים ובצע הדמיה.

4. יישום כמותני: שחזור תלת מימד ומידול דינמי של נוזלים חישוביים

הערה: בשלבים אלה, ערימות תמונות ברזולוציה גבוהה שנוצרו על ידי גיליון אור נטענות בתוכנת הקוד הפתוח SimVascular¹⁴ לשחזור אנטומי תלת מימדי ומודלים דינמיים של נוזלים חישוביים. מדריכים מפורטים קיימים באתר האינטרנט של SimVascular (ראה טבלת חומרים). שחזור מורכב מיצירת קווי נתיבים בכלי העניין, יצירת סגמנטים דו-ממדיים לאורך קווי המסלולים ושילוב סגמנטים מוגבהים למודל מוצק תלת מימדי. מודלים חישוביים מורכבים מהכנת גיאומטריה מרושתת, הגדרת תנאי גבול והפעלת סימולציות.

1. צור SVProject חדש תחת קובץ והעלה ערימת הדמיה של גיליון אור ברזולוציה גבוהה על ידי לחיצה ימנית על תמונות ולאחר מכן לחיצה על הוספה/החלפה של תמונה.
2. עקוב אחר שלבי הדרכה של התוכנה כדי לשחזר אנטומיה של כלי הדם בסיליקו.
   1. צור קו נתיב על-ידי לחיצה ימנית על נתיבים ובחירה באפשרות צור נתיב. הצב סימוני שבילים לאורך כלי מעניין. חזור על הפעולה עבור כל כלי מעניין.
   2. עבור כל קו נתיב שנוצר, עקוב אחר חתכי כלי דו-ממדיים על ידי לחיצה ימנית על סגמנטציות ובחירה ביצירת קבוצת קווי מתאר. בחר את נתיב כלי השיט ולחץ פעמיים על שם כלי השיט תחת סגמנטציה כדי להתחיל בפילוח ידני.
   3. לאחר חלוקת כל כלי השיט, צור מודל על ידי לחיצה ימנית על מודלים ולאחר מכן בחירה ביצירת מודל. בחר סוג PolyData , הזן שם מודל, לחץ על צור מודל מוצק ובחר את כל הפילוח שצריך להיות חלק מהמודל.
3. חבר את הגיאומטריה על ידי הפעלת ה-Tetgen mesher המובנה ב-SimVascular SVMesher. הגדר גודל קצה מקסימלי ובצע רשת משטח ונפח כאחד.
   הערה: בחר גודל רשת שיכול לפתור פרטים גיאומטריים עדינים ושונות המודינמית מקומית בכלי. התחל עם לחצן הערכת גודל רשת גלובלי . מחקר התכנסות רשת עשוי להיות נחוץ בעת סיום סימולציות.
4. הגדר סימולציה חישובית של זרימת דם באמצעות SimVascular Solver. צור קובצי הדמיה על-ידי לחיצה ימנית על הדמיות ובחירה באפשרות צור עבודת הדמיה. התאם פרמטרים בסיסיים ובחר BCs כניסה ויציאה לתנאי גבול ספציפיים.
   1. התאם את הפרמטרים של Solver, נווט אל הכרטיסייה צור קבצים והפעל הדמיה, בחר קובץ רשת, לחץ על צור קבצי נתונים להדמיה.
5. הפעל את הסימולציה באמצעות תחנת עבודה או מחשב-על בעלי ביצועים גבוהים.

תוצאות

פרוטוקול ההדמיה המהיר ברזולוציה גבוהה המוצג כאן (איור 1, טבלה 1) מייצר לומן כלי דם מתוארים בבירור כפי שמוצג באיור 2, איור 3 ואיור 4, כאשר אנדותל כלי הדם של עובר הגוזל הוא פלואורסצנטי GFP ולכן מתואר בירוק על פני ש?...

Discussion

היכולת ללמוד ביולוגיה בתלת מימד היא קריטית להבנה מדויקת של המורכבות המורפולוגית, מבנה האיברים הפנימיים והקשרים בכלי הדם. תמונות כלי דם תלת מימדיות מדויקות ואמינות הן גם מרכזיות בסימולציות המודינמיות חישוביות ספציפיות לנושא, שהן לרוב האמצעי האמין היחיד לכימות פרמטרים ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5 forceps	Fine Science Tools	11252-30
#55-forceps	Fine Science Tools	11295-51
0.03 inch inner diameter silicone tubing	VWR	32829-182
20 μL pipette tips	VWR	76322-134
35 mm Petri dish	VWR	10799-192
5 mL plastic syringe	VWR	BD 309646
Dichloromethane (DCM)	Sigma-Aldrich	270997	Refer to MSDS. Stored in side cabinet under fume hood
Ethyl cinnamate (ECi)	Sigma-Aldrich	112372	Stored at 4 °C
Fine Curved scissors	Fine Science Tools	14061-09
FITC-poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P3069	Store at -20 °C (powder, stock solution), 4ºC (working solution)
Fluoresent microscope	EVIDENT SCIENTIFIC	MVX10
Glass capillary tubes (0.75 mm ID)	Sutter Instrument	FG-GB100-75-10
Lightsheet microscope	Zeiss	Z.1 system
Methanol	Sigma-Aldrich	M1775	Refer to MSDS. Stored in flammable cabinet under fume hood
Microforge	Narishige International USA, Inc.	MF2
Micromanipulator	World Percision Instrrument	M3301R
Paraformaldehyde (PFA) 4%	Thermo Scientific	J19943.K2	Refer to MSDS. Stored at -20 °C (powder), 4 °C (4% working solution)
Phosphate buffered saline (PBS)	Cytiva	SH30256.01	Stored on benchtop
SimVascular			open source software www.simvascular.org
Tyrode’s Solution			Made in-house