<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أولا نحن في حاجة الى اعداد 2ml المسمار غطاء قنينة لاستخراج : إضافة 400ul العازلة استخراج (1 - بروبانول : H2O : حمض الهيدروكلوريك تتركز 2:1:0.002 المجلد / المجلد / المجلد) و 10 ميكرولتر من معيار الداخلية منها (10ng/μl ) إلى القارورة. التجميد في النيتروجين السائل ثم تضاف حبات السيراميك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة المواد النباتية (بين 50 و 200mg) ، في حين لا تزال تتمركز في قنينة النيتروجين السائل. علما بأن وزن المواد النباتية واضاف لابد من مزيد من المعالجة قبل المقدرة للسماح في وقت لاحق لالكمي الدقيق ، الذي يقوم على أساس الوزن الطازج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من أن تبخرت كل النتروجين السائل قبل أن يغلق بإحكام القارورة مع قبعة. علما أن الحد الأقصى يجب أن يكون الختم المطاطي لمنع انسكاب المذيبات ، وبالتالي ، والمركبات المستخرجة خلال التجانس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجانس النسيج في FastPrep أو Precellys الخالط طاحونة حبة بسرعة 6000 (لPrecellys) لمدة 30 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة قارورة من الخالط بشكل فردي ، وفتح الغطاء بعناية وإضافة إلى ثنائي كلورو ميثان 1ml من كل عينة. إغلاق قنينات مرة أخرى بإحكام والتجانس مرة أخرى ل15sec - 10 الساعة 6000 (Precellys). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل إلى أحد أجهزة الطرد المركزي قوارير منضدية وفصل المرحلة العضوية من المرحلة المائية في ل10.000xg 60sec. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الانفصال مرحلة تحويل الطبقة السفلى خضراء (المرحلة العضوية ، ويحتوي على هرمونات والمعايير الداخلية) من فرد إلى قنينة قنينة الزجاج 4ml نظيفة. تجنب نقل المياه (المرحلة العليا). بدلا من ذلك ، يمكن استخدام خلات الإيثيل بدلا من ثنائي كلورو ميثان. في هذه الحالة سوف تكون المرحلة ethyacetate الطبقة العلوية (أخضر) وأصبح الآن أكثر سهولة لإزالة ونقل إلى قارورة زجاجية 4ml الطازجة. كما كان من قبل ، وتجنب نقل المياه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ينفخون المذيب مع الهواء من خلال مشعب لحوالي 10-25 دقيقة (يعتمد على العينة) ؛ الاختيار مع طرف واحد إذا تدفق الهواء العينات الجافة (بدقة). لا عينات overdry ، قد تتسبب في خسائر لهذه المركبات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة تجفف العينات يمكن أن نبدأ من مثلأيشن الكربوكسيلية الحمضية التي تحتوي على المركبات في عينات لدينا. أولا ، يتم إضافة 100 ميكرولتر من خليط diethyether / الميثانول (09:01 المجلد / المجلد) إلى كل قنينة تليها 4μl حل trimethylsilyldiazomethane 2M (في الهكسان ، الدريتش سيغما). تغلق فورا مع غطاء قنينة المسمار مكشوفة مزودة الحاجز سيليكون تفلون مبطنة. يهز بلطف واحتضان على RT لمدة 25 إلى 30min. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الانتهاء من الخطوة 9 ، بدوره على كتلة التدفئة ودرجة الحرارة التي وضعت في جمع المطلوب. تقلب مركبات ميثليته يعتمد على حجمها ، ولكن أيضا على جماعات أخرى أكثر القطبية مثل O = ، - OH ، و- NH. لحامض الساليسيليك وjasmonic استرات الميثيل حمض جمع درجات الحرارة نحو 80 درجة مئوية تكفي ، بينما على سبيل المثال مركبات أخرى مثل الأحماض الدهنية C18 ، jasmonic تقارن حمض الأمينية ، coronatine و- 12 - أوكسو phytodienoic استر حمض الميثيل تتطلب درجات الحرارة بين 180-200 درجة مئوية لتطيير بفعالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد حضانة 30min رد فعل مثلأيشن يحتاج إلى وقفه لتجنب رد فعل الثانوية غير المرغوب فيها. يتم ذلك عن طريق إضافة 4 ميكرولتر من الخل 2M حل الحمضية (في الهكسين) إلى كل قنينة. بعد إغلاق قنينات مع القبعات وvortexing قصيرة ، يسمح للعينات لاحتضان لمدة 30min. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الفلاتر المستخدمة في استخراج هذه المرحلة بخار يتم يدويا وقدم في شكل غير متوفرة تجاريا. فهي تتألف من أنبوب تفلون الخارجي (حوالي 7 - 8cm طويلة) ، الى جانب واحد من الذي يتم إدخال أنبوب زجاجي جيدا المناسب من حوالي 4cm طول. على الجانب الآخر من الأنبوب التفلون يتم الضغط عيون القرص الصلب المقاوم للصدأ داخل الأنبوب حتى تصل إلى أنبوب زجاجي الداخلية وعلى أن حوالي 20 30mg من الممتزات (إما SuperQ 80/100 (توقف) أو HayeSep ® Q80/100) تضاف. يتم إدراج آخر شبكة القرص الصلب الذي لا يصدأ ، وأخيرا طرف الزجاج ويدفع في أنبوب التفلون ، وبالتالي الضغط بعناية شبكة القرص الصلب المقاوم للصدأ على ماصة. صورة مفصلة يظهر مرشح في الشكل 1. <img src="/files/ftp_upload/1127/1127fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلال فترة الحضانة من 11 خطوة ، ومرشحات لجمع ميثليته ، وبالتالي ، والهرمونات النباتية المتقلبة ، لا بد من غسلها باستخدام 200ul الأول من الميثانول ، ثم يغسل 2 ثنائي كلورو ميثان مع 200ul لكل منهما. ثم ينفخ المذيبات المتبقية في مرشحات قبالة عن طريق الجو. ويمكن الآن أن تستخدم المرشحات لمحاصرة من الهرمونات المتقلبة من خلال عمليات استخراج مرحلة البخار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 30min من الحضانة وقطع الحاجز المطاطي للقارورة قبعات 4ml مع مشرط. لجمع الهرمونات النباتية استخراج بخار المرحلة ترتبط المرشحات لتنظيف خطوط فراغ الفرد بمعدل تدفق نحو 800ml/min. ثم يتم إدراج المرشحات في قارورة من خلال خفض الحاجز. كما تم إدراج تلميح الماصة الصغيرة ليكون بمثابة مدخل الهواء. خلال هذا الجزء الأول من الإجراء قارورة مع إدراج المرشحات والتي ستعقدفي وضع مستقيم لتجنب أي من السائل داخل القارورة للحصول على اتصال مع طرف التصفية ، التي من شأنها تلويث الفلتر وبعد ذلك أيضا GC / MS. ثم يتم عقد قارورة باليد حتى يتم تبخر السائل عن طريق التصفية. ثم توضع في قوارير مع المرشحات يعلق على كتلة التدفئة والحرارة تبخرت المركبات التي تم جمعها ل3min. وصفت مكونات مبدأ النظام وكذلك الإعداد في الشكل 1. بعد هذه الخطوة استخراج بخار المرحلة النهائية توضع قارورة مع المرشحات لا تزال تعلق على الرف ، وسمح ليبرد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما وصلت مرشحات درجة حرارة الغرفة مرة أخرى وأنهم eluted مع 150ml من ثنائي كلورو ميثان إلى قارورة GC - 1.5 مل مزودة إدراج. تغيير تطاير المذيبات المتبقية من تصفية وتوج في قارورة وتحليلها بواسطة GC / MS. </li></ol> واللوني للغاز مجهزة انقسام / حاقن splitless (وضع splitless 250 درجة مئوية ، وحجم الحقن 1μ) ينبغي أن تستخدم ربطه إلى مطياف الكتلة يعمل في وضع التأين الكيميائي (CI) للتحليل). يتم فصل المركبات على HP - 1MS العمود (30M خ خ 0.25mm 025μm) الذي عقد في 40 درجة مئوية لمدة 1min بعد الحقن ، ومن ثم درجة الحرارة المبرمجة في 15 درجة مئوية / دقيقة الى 250 درجة مئوية (ل10min) ، مع الهليوم باعتبارها الناقل الغاز (ثابت 0.7ml/min تدفق). لتحليل MS - تستند على حد سواء ، يمكن أن تستخدم quadropole (مثل اجيلنت HP5973) وايون فخ المستندة إلى مطياف الكتلة (مثل زحل فاريان 2200). كغاز CI إما الأيزوبيوتان (يأتي في خزانات الغاز) أو الميثانول (تستخدم أبخرة من خزان السائل) يمكن استخدامها ، ولكن ، ينبغي في كل حالة يتم فحص أجزاء من رد فعل التأين قبل ايون برامج مختارة (SIC) العد يتم إنشاؤها. وقد استخدمنا البرنامج التالي لنظام فاريان 3900/Saturn GC 2200 MS والميثانول والكاشف CI : 5.00 - 11.30min أيونات (M +1) + 153-158 (ميثيل الساليسيلات 153 ، الميثيل 2 H 5 - الساليسيلات) ؛ 11.30 - 13.30min أيونات (M +1) + 207-228 (ميثيل jasmonate 207 و 225 ، 209 و الميثيل dihydrojasmonate 227) ؛ 13.30 - 16.30min أيونات (M +1) + 237-300 (ميثيل حمض الأبسيسيك 261 ، 2 الميثيل وينبغي تحديد H - 6 حمض الأبسيسيك 267 (حمض الأبسيسيك تنتج في الغالب [2 O MH +1] + الأيونات) جميع المركبات من خلال المقارنة مع المعايير الحقيقية المتاحة تجاريا. الكمي ليتم JA ، SA ، وأبا عن طريق الربط بين منطقة الذروة (المستخرج الأيونات) مع منطقة الذروة (الأيونات المستخرجة) من معيار الداخلية منها ، ويستند أيضا على الوزن الطازج من المواد النباتية المستخدمة.

<ol>
	<li>Schmelz, E. A., Engelberth, J., Tumlinson, J. H., Alborn, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+vapor+phase+extraction+in+metabolic+profiling+of+phytohormones+and+other+metabolites.">The use of vapor phase extraction in metabolic profiling of phytohormones and other metabolites.</a> Plant Journal. 39, 790-808 (2004).</li><li>Engelberth, J., Alborn, H. T., Schmelz, E. A., Tumlinson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airborne+signals+prime+plants+against+insect+herbivore+attack.">Airborne signals prime plants against insect herbivore attack.</a> PNAS. 101, 1781-1785 (2004).</li><li>Schmelz, E. A., Engelberth, J., Alborn, H. T., O&amp;acute, D. o. n. n. e. l., Sammons, P., Toshima, M., H, J. H. T. u. m. l. i. n. s. o. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+analysis+of+phytohormones,+phytotoxins,+and+volatile+organic+compounds+in+plants.">Simultaneous analysis of phytohormones, phytotoxins, and volatile organic compounds in plants.</a> PNAS. 100, 10552-10557 (2003).</li><li>Engelberth, J., Schmelz, E. A., Alborn, H., Cardoza, Y. J., Huang, J., Tumlinson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Quantification+of+Jasmonic+acid+and+Salicylic+acid+by+Vapor+Phase+Extraction+and+Gas+Chromatography+-+Chemical+Ionization-Mass+Spectrometry.">Simultaneous Quantification of Jasmonic acid and Salicylic acid by Vapor Phase Extraction and Gas Chromatography - Chemical Ionization-Mass Spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 312, 242-250 (2003).</li></ol>

قدم الأسلوب هنا ثبت للعمل بشكل صحيح لمجموعة واسعة من المركبات النباتية إشارة بشرط أن يكون حجم وطبيعة المواد الكيميائية للمركب لا يمنع من استخراج ، ميثليته ، وتبخيرها. أيضا ، فإن الإجراء مثيلة كما هو وصفها هنا ليست الطريقة الوحيدة لderivatization. ويمكن Silyllation أستلة من الطرق...

monitoring plant hormones during stress responses

الهرمونات النباتية والمركبات المتصلة يشير تلعب دورا هاما في تنظيم استجابات النبات للمحفزات البيئية المختلفة والضغوط. بين الضغوط الشديدة والحشرات بالأعشاب ، وعدوى للمرض ، والإجهاد الجفاف. لكل من هذه الضغوط مجموعة معينة من الهرمونات و / أو خليط منها ومن المعروف أن ردود صقل ، وبالتالي ضمان بقاء النبات. الهرمونات الرئيسية المشاركة في تنظيم هذه الردود هي حمض jasmonic (JA) ، وحمض الصفصاف (SA) ، وحمض الأبسيسيك (ABA). إلى فهم أفضل لدور الهرمونات الفردية ، وكذلك تفاعلها المحتملة خلال هذه الاستجابات من الضروري رصد التغيرات في وفرة في زمنية وكذلك بطريقة المكانية. لالكمي سهلة وحساسة واستنساخه من هذه الإشارات وغيرها من المركبات طورنا طريقة القائمة على استخراج مرحلة البخار واللوني للغاز / قياس الطيف الكتلي (GC / MS) التحليل (1 ، 2 ، 3 ، 4). بعد استخراج هذه المركبات من الأنسجة النباتية المائية الحمضية 1 - بروبانول مختلطة مع ثنائي كلورو ميثان حمض الكربوكسيلية هي المحتوية على مركبات ميثليته ، تتطاير تحت حرارة ، والتي تم جمعها على الماصة البوليمرية. بعد شطف إلى قارورة العينة يتم فصل analytes اللوني بواسطة الغاز والكشف عنها بواسطة التأين الكيميائي مطياف الكتلة. استخدام المعايير الداخلية المناسبة ثم يسمح لتقدير بسيط من المجالات المتعلقة ذروة قياسية الحليلة والداخلية.

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Plant Hormones During Stress Responses at JoVE.com

Monitoring Plant Hormones During Stress Responses

وهناك طريقة بسيطة تسمح لاستخراج السريعة وتحليل الهرمونات النباتية متعددة من عينات الأنسجة الصغيرة. يستخدم الإجراء استخراج بخار المرحلة كخطوة تنقية الرسمي. ويتم تحليل العينات بواسطة أيونات + GC / MS مع التأين الكيميائية التي تنتج أساسا (M +1).

الهرمونات النباتية خلال رصد استجابات التوتر

Plant hormones and related signaling compounds play an important role in the regulation of plant responses to various environmental stimuli and stresses. ...

monitoring-plant-hormones-during-stress-responses

Research

JoVE Journal

Biology

16.5K Views.  University of Texas. وهناك طريقة بسيطة تسمح لاستخراج السريعة وتحليل الهرمونات النباتية متعددة من عينات الأنسجة الصغيرة. يستخدم الإجراء استخراج بخار المرحلة كخطوة تنقية الرسمي. ويتم تحليل العينات بواسطة أيونات + GC / MS مع التأين الكيميائية التي تنتج أساسا (M +1).

Video: Monitoring Plant Hormones During Stress Responses

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called photoreceptors to sense and adapt to light. The red/far-red light-absorbing phytochrome photoreceptors have been studied extensively. Phytochromes exist as a family of proteins with distinct and overlapping functions in all higher plant systems in which they have been studied1. Phytochrome-mediated light responses, which range from seed germination through flowering and senescence, are often localized to specific plant tissues or organs2. Despite the discovery and elucidation of individual and redundant phytochrome functions through mutational analyses, conclusive reports on distinct sites of photoperception and the molecular mechanisms of localized pools of phytochromes that mediate spatial-specific phytochrome responses are limited. We designed experiments based on the hypotheses that specific sites of phytochrome photoperception regulate tissue- and organ-specific aspects of photomorphogenesis, and that localized phytochrome pools engage distinct subsets of downstream target genes in cell-to-cell signaling. We developed a biochemical approach to selectively reduce functional phytochromes in an organ- or tissue-specific manner within transgenic plants. Our studies are based on a bipartite enhancer-trap approach that results in transactivation of the expression of a gene under control of the Upstream Activation Sequence (UAS) element by the transcriptional activator GAL43. The biliverdin reductase (BVR) gene under the control of the UAS is silently maintained in the absence of GAL4 transactivation in the UAS-BVR parent4. Genetic crosses between a UAS-BVR transgenic line and a GAL4-GFP enhancer trap line result in specific expression of the BVR gene in cells marked by GFP expression4. BVR accumulation in Arabidopsis plants results in phytochrome chromophore deficiency in planta5-7. Thus, transgenic plants that we have produced exhibit GAL4-dependent activation of the BVR gene, resulting in the biochemical inactivation of phytochrome, as well as GAL4-dependent GFP expression. Photobiological and molecular genetic analyses of BVR transgenic lines are yielding insight into tissue- and organ-specific phytochrome-mediated responses that have been associated with corresponding sites of photoperception4, 7, 8. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) of GFP-positive, enhancer-trap-induced BVR-expressing plant protoplasts coupled with cell-type-specific gene expression profiling through microarray analysis is being used to identify putative downstream target genes involved in mediating spatial-specific phytochrome responses. This research is expanding our understanding of sites of light perception, the mechanisms through which various tissues or organs cooperate in light-regulated plant growth and development, and advancing the molecular dissection of complex phytochrome-mediated cell-to-cell signaling cascades.

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

The molecular basis of spatial-specific phytochrome responses is being investigated using transgenic plants that exhibit tissue- and organ-specific phytochrome deficiencies. The isolation of specific cells exhibiting induced phytochrome chromophore depletion by Fluorescence-Activated Cell Sorting followed by microarray analyses is being utilized to identify genes involved in spatial-specific phytochrome responses.

التحقيق في الأنسجة والجهاز محددة الردود فيتوكروم باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية بمساعدة خلية من نوع التنميط معينة في التعبير thaliana Arabidopsis</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

Bioassays for Monitoring Insecticide Resistance

Pest resistance to pesticides is an increasing problem because pesticides are an integral part of high-yielding production agriculture. When few products are labeled for an individual pest within a particular crop system, chemical control options are limited. Therefore, the same product(s) are used repeatedly and continual selection pressure is placed on the target pest. There are both financial and environmental costs associated with the development of resistant populations. The cost of pesticide resistance has been estimated at approximately $ 1.5 billion annually in the United States. This paper will describe protocols, currently used to monitor arthropod (specifically insects) populations for the development of resistance. The adult vial test is used to measure the toxicity to contact insecticides and a modification of this test is used for plant-systemic insecticides. In these bioassays, insects are exposed to technical grade insecticide and responses (mortality) recorded at a specific post-exposure interval. The mortality data are subjected to Log Dose probit analysis to generate estimates of a lethal concentration that provides mortality to 50% (LC50) of the target populations and a series of confidence limits (CL's) as estimates of data variability. When these data are collected for a range of insecticide-susceptible populations, the LC50 can be used as baseline data for future monitoring purposes. After populations have been exposed to products, the results can be compared to a previously determined LC50 using the same methodology.

This manuscript demonstrates and discusses techniques used to survey pesticide susceptibility and detect resistance to contact and systemic pesticides in arthropod pests.

اختبارات بيولوجية على مقاومة المبيدات الحشرية الرصد

Pest resistance to pesticides is an increasing problem because pesticides are an integral part of high-yielding production agriculture. When few products ...

Linking Predation Risk, Herbivore Physiological Stress and Microbial Decomposition of Plant Litter

The quantity and quality of detritus entering the soil determines the rate of decomposition by microbial communities as well as recycle rates of nitrogen (N) and carbon (C) sequestration1,2. Plant litter comprises the majority of detritus3, and so it is assumed that decomposition is only marginally influenced by biomass inputs from animals such as herbivores and carnivores4,5. However, carnivores may influence microbial decomposition of plant litter via a chain of interactions in which predation risk alters the physiology of their herbivore prey that in turn alters soil microbial functioning when the herbivore carcasses are decomposed6. A physiological stress response by herbivores to the risk of predation can change the C:N elemental composition of herbivore biomass7,8,9 because stress from predation risk increases herbivore basal energy demands that in nutrient-limited systems forces herbivores to shift their consumption from N-rich resources to support growth and reproduction to C-rich carbohydrate resources to support heightened metabolism6. Herbivores have limited ability to store excess nutrients, so stressed herbivores excrete N as they increase carbohydrate-C consumption7. Ultimately, prey stressed by predation risk increase their body C:N ratio7,10, making them poorer quality resources for the soil microbial pool likely due to lower availability of labile N for microbial enzyme production6. Thus, decomposition of carcasses of stressed herbivores has a priming effect on the functioning of microbial communities that decreases subsequent ability to of microbes to decompose plant litter6,10,11.
We present the methodology to evaluate linkages between predation risk and litter decomposition by soil microbes. We describe how to: induce stress in herbivores from predation risk; measure those stress responses, and measure the consequences on microbial decomposition. We use insights from a model grassland ecosystem comprising the hunting spider predator (Pisuarina mira), a dominant grasshopper herbivore (Melanoplus femurrubrum),and a variety of grass and forb plants9.

We present methods to evaluate how predation risk can alter the chemical quality of herbivore prey by inducing dietary changes to meet demands of heightened stress, and how the decomposition of carcasses from these stressed herbivores slows subsequent plant litter decomposition by soil microbes.

ربط المخاطر الافتراس، والإجهاد الفسيولوجي آكل النبات والتحلل الميكروبي للنباتات القمامة

The quantity and quality of detritus entering the soil  determines the rate of decomposition by microbial communities as well as  recycle rates of ...

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. Alterations of this program can lead to the growth of damaged cells, a hallmark of cancer development, or to premature cell death such as seen in neurodegenerative diseases. Much of what is known concerning the molecular basis for translational control has been obtained from polysome analysis using a density gradient fractionation system. This technique relies on ultracentrifugation of cytoplasmic extracts on a linear sucrose gradient. Once the spin is completed, the system allows fractionation and quantification of centrifuged zones corresponding to different translating ribosomes populations, thus resulting in a polysome profile. Changes in the polysome profile are indicative of changes or defects in translation initiation that occur in response to various types of stress. This technique also allows to assess the role of specific proteins on translation initiation, and to measure translational activity of specific mRNAs. Here we describe our protocol to perform polysome profiles in order to assess translation initiation of eukaryotic cells and tissues under either normal or stress growth conditions.

Here, we describe a method to analyze changes in the initiation of mRNA translation of eukaryotic cells in response to stress conditions. This method is based on the velocity separation on sucrose gradients of translating ribosomes from non-translating ribosomes.

تحليل ترجمة بدء أثناء حالة الإجهاد التي كتبها Polysome التنميط

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

Hydroponics: A Versatile System to Study Nutrient Allocation and Plant Responses to Nutrient Availability and Exposure to Toxic Elements

Hydroponic systems have been utilized as one of the standard methods for plant biology research and are also used in commercial production for several crops, including lettuce and tomato. Within the plant research community, numerous hydroponic systems have been designed to study plant responses to biotic and abiotic stresses. Here we present a hydroponic protocol that can be easily implemented in laboratories interested in pursuing studies on plant mineral nutrition.
This protocol describes the hydroponic system set up in detail and the preparation of plant material for successful experiments. Most of the materials described in this protocol can be found outside scientific supply companies, making the set up for hydroponic experiments less expensive and convenient.
The use of a hydroponic growth system is most advantageous in situations where the nutrient media need to be well controlled and when intact roots need to be harvested for downstream applications. We also demonstrate how nutrient concentrations can be modified to induce plant responses to both essential nutrients and toxic non-essential elements.

Here, we present an easy-to-follow protocol to establish a successful hydroponic system for plant nutrition studies. This protocol has been extensively tested in Arabidopsis and can easily be adapted to other plant species to study specific nutritional requirements or the effect of non-essential elements on plant growth and development.

الزراعة المائية: نظام تنوعا لدراسة الغذائية تخصيص ومصنع الردود على توافر المواد الغذائية والتعرض للعناصر السامة

Hydroponic systems have been utilized as one of the standard methods for plant biology research and are also used in commercial production for several ...

Split Green Fluorescent Protein System to Visualize Effectors Delivered from Bacteria During Infection

Bacteria, one of the most important causative agents of various plant diseases, secrete a set of effector proteins into the host plant cell to subvert the plant immune system. During infection cytoplasmic effectors are delivered to the host cytosol via a type III secretion system (T3SS). After delivery into the plant cell, the effector(s) targets the specific compartment(s) to modulate host cell processes for survival and replication of the pathogen. Although there has been some research on the subcellular localization of effector proteins in the host cells to understand their function in pathogenicity by using fluorescent proteins, investigation of the dynamics of effectors directly injected from bacteria has been challenging due to the incompatibility between the T3SS and fluorescent proteins.
Here, we describe our recent method of an optimized split superfolder green fluorescent protein system (sfGFPOPT) to visualize the localization of effectors delivered via the bacterial T3SS in the host cell. The sfGFP11 (11th &#946;-strand of sfGFP)-tagged effector secreted through the T3SS can be assembled with a specific organelle targeted sfGFP1-10OPT (1-10th &#946;-strand of sfGFP) leading to fluorescence emission at the site. This protocol provides a procedure to visualize the reconstituted sfGFP fluorescence signal with an effector protein from Pseudomonas syringae in a particular organelle in the Arabidopsis and Nicotiana benthamiana plants.

Fluorescent protein-based approaches to monitor effectors secreted by bacteria into host cells are challenging. This is due to the incompatibility between fluorescent proteins and the type-III secretion system. Here, an optimized split superfolder GFP system is used for visualization of effectors secreted by bacteria into the host plant cell.

تقسيم نظام البروتينات الفلورية الخضراء لتصور المستجيبة التي سلمت من البكتيريا أثناء الإصابة

Bacteria, one of the most important causative agents of various plant diseases, secrete a set of effector proteins into the host plant cell to subvert the ...

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and physiology. Thus, organisms have evolved targeted and specific stress responses dedicated to repair damage and maintain homeostasis. These mechanisms include the unfolded protein response of the endoplasmic reticulum (UPRER), the unfolded protein response of the mitochondria (UPRMT), the heat shock response (HSR), and the oxidative stress response (OxSR). The protocols presented here describe methods to detect and characterize the activation of these pathways and their physiological consequences in the nematode, C. elegans. First, the use of pathway-specific fluorescent transcriptional reporters is described for rapid cellular characterization, drug screening, or large-scale genetic screening (e.g., RNAi or mutant libraries). In addition, complementary, robust physiological assays are described, which can be used to directly assess sensitivity of animals to specific stressors, serving as functional validation of the transcriptional reporters. Together, these methods allow for rapid characterization of the cellular and physiological effects of internal and external proteotoxic perturbations.

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Here, we characterize cellular proteotoxic stress responses in the nematode C. elegans by measuring the activation of fluorescent transcriptional reporters and assaying sensitivity to physiological stress.

قياسات استجابات الإجهاد الفسيولوجي في C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the most important post-translational modifications in eukaryotic organisms. Ubiquitylation is mediated by a sequential cascade of three enzyme classes including ubiquitin-activating enzymes (E1 enzymes), ubiquitin-conjugating enzymes (E2 enzymes), and ubiquitin ligases (E3 enzymes), and sometimes, ubiquitin-chain elongation factors (E4 enzymes). Here, in vitro protocols for ubiquitylation assays are provided, which allow the assessment of E3 ubiquitin ligase activity, the cooperation between E2-E3 pairs, and substrate selection. Cooperating E2-E3 pairs can be screened by monitoring the generation of free poly-ubiquitin chains and/or auto-ubiquitylation of the E3 ligase. Substrate ubiquitylation is defined by selective binding of the E3 ligase and can be detected by western blotting of the in vitro reaction. Furthermore, an E2~Ub discharge assay is described, which is a useful tool for the direct assessment of functional E2-E3 cooperation. Here, the E3-dependent transfer of ubiquitin is followed from the corresponding E2 enzyme onto free lysine amino acids (mimicking substrate ubiquitylation) or internal lysines of the E3 ligase itself (auto-ubiquitylation). In conclusion, three different in vitro protocols are provided that are fast and easy to perform to address E3 ligase catalytic functionality.

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The present study provides detailed in vitro ubiquitylation assay protocols for the analysis of E3 ubiquitin ligase catalytic activity. Recombinant proteins were expressed using prokaryotic systems such as Escherichia coli culture.

في فيترو تحليل E3 يوبيكيتين ليجاز وظيفة

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

Construction of Homozygous Mutants of Migratory Locust Using CRISPR/Cas9 Technology

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an important research model for insect metamorphosis. The CRISPR/Cas9 system can accurately locate at a specific DNA locus and cleave within the target site, efficiently introducing double-strand breaks to induce target gene knockout or integrate new gene fragments into the specific locus. CRISPR/Cas9-mediated genome editing is a powerful tool for addressing questions encountered in locust research as well as a promising technology for locust control. This study provides a systematic protocol for CRISPR/Cas9-mediated gene knockout with the complex of Cas9 protein and single guide RNAs (sgRNAs) in migratory locusts. The selection of target sites and design of sgRNA are described in detail, followed by in vitro synthesis and verification of the sgRNAs. Subsequent procedures include egg raft collection and tanned-egg separation to achieve successful microinjection with low mortality rate, egg culture,&#160;preliminary estimation of the mutation rate, locust breeding as well as detection, preservation, and passage of the mutants to ensure population stability of the edited locusts. This method can be used as a reference for CRISPR/Cas9 based gene editing applications in migratory locusts as well as in other insects.

This study provides a systematically optimized procedure of CRISPR/Cas9 ribonuclease-based construction of homozygous locust mutants as well as a detailed method for cryopreservation and resuscitation of the locust eggs.

بناء طفرات متماثلة الزيجوت من الجراد المهاجر باستخدام تقنية كريسبر / كاس 9

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an ...

Combining Clearing and Fluorescence Microscopy for Visualising Changes in Gene Expression and Physiological Responses to Plasmodiophora brassicae

Infection of Brassica crops by the soilborne protist Plasmodiophora brassicae leads to gall formation on the underground organs. The formation of galls requires cellular reprogramming and changes in the metabolism of the infected plant. This is necessary to establish a pathogen-oriented physiological sink toward which the host nutrients are redirected. For a complete understanding of this particular plant-pathogen interaction and the mechanisms by which host growth and development are subverted and repatterned, it is essential to track and observe the internal changes accompanying gall formation with cellular resolution. Methods combining fluorescent stains and fluorescent proteins are often employed to study anatomical and physiological responses in plants. Unfortunately, the large size of galls and their low transparency act as major hurdles in performing whole-mount observations under the microscope. Moreover, low transparency limits the employment of fluorescence microscopy to study clubroot disease progression and gall formation. This article presents an optimized method for fixing and clearing galls to facilitate epifluorescence and confocal microscopy for inspecting P. brassicae-infected galls. A tissue-clearing protocol for rapid optical clearing was used followed by vibratome sectioning to detect anatomical changes and localize gene expression with promoter fusions and reporter lines tagged with fluorescent proteins. This method will prove useful for studying cellular and physiological responses in other pathogen-triggered structures in plants, such as nematode-induced syncytia and root knots, as well as leaf galls and deformations caused by insects.

Combining Clearing and Fluorescence Microscopy for Visualising Changes in Gene Expression and Physiological Responses to Plasmodiophora brassicae

The present protocol describes an optimized method for the histological observation of galls induced by Plasmodiophora brassicae. Vibratome sections of hypocotyls are cleared before fluorescence imaging to study the involvement of transcription factors and phytohormones during disease progression. This protocol overcomes resin embedding limitations, enabling in planta visualization of fluorescent proteins.

الجمع بين مجهر المقاصة والتألق لتصور التغيرات في التعبير الجيني والاستجابات الفسيولوجية للبلازموديوفورا براسيكاي

Infection of Brassica crops by the soilborne protist Plasmodiophora brassicae leads to gall formation on the underground organs. The formation of galls ...