<ol><li> Zunächst müssen wir die 2ml Schraubverschluss Fläschchen für die Extraktion vorbereitet: In 400ul Extraktionspuffer (1-propanol: H2O: konzentrierter HCl 2:1:0.002 vol / vol / vol) und 10 ul der jeweiligen internen Standards (10ng/μl ) in eine Durchstechflasche. Einfrieren in flüssigem Stickstoff und fügen Sie dann die Keramik-Perlen. </li><li> Fügen Sie das Pflanzenmaterial (zwischen 50 und 200 mg), während die Fläschchen noch in den flüssigen Stickstoff angeordnet sind. Beachten Sie, dass das Gewicht des zugegebenen Pflanzenmaterial zu schätzen vor der weiteren Verarbeitung später erlauben, für eine exakte Quantifizierung, die auf das Frischgewicht beruht hat. </li><li> Stellen Sie sicher, dass alle flüssigen Stickstoff vor dicht schließende das Fläschchen mit einer Kappe verdampft. Beachten Sie, dass die Kappe eine Gummidichtung, um Freisetzungen von Lösungsmitteln und somit extrahierten Verbindungen während der Homogenisierung zu verhindern muss. </li><li> Homogenisieren des Gewebes in einem FastPrep oder Precellys bead grinder Homogenisator mit einer Geschwindigkeit von 6000 (für Precellys) für 30 sec. </li><li> Entfernen Röhrchen aus Homogenisator individuell, öffnen Sie vorsichtig die Kappe und 1ml von Dichlormethan zu jeder Probe. Close Fläschchen wieder dicht und erneut homogenisieren für 10-15sec bei 6000 (Precellys). </li><li> Transfer-Fläschchen zu einer Tischzentrifuge und trennen Sie die organische Phase von der wässrigen Phase bei 10.000xg für 60sec. </li><li> Nach Phasentrennung Übertragung der untere grüne Schicht (organische Phase enthält die Hormone und die internen Standards) von einzelnen Flaschen, um eine saubere 4ml Glasfläschchen. Vermeiden Sie den Transfer von Wasser (obere Phase). Alternativ können Ethylacetat anstelle von Dichlormethan verwendet werden. In diesem Fall wird die ethyacetate Phase wird die obere Schicht (grün) und ist nun leichter zu entfernen und in ein frisches 4ml Glasfläschchen. Nach wie vor vermeiden die Übertragung von Wasser. </li><li> Blow off des Lösungsmittels mit Luft durch einen Verteiler für ca. 10-25 min (je nach Probe); erkundigen Sie sich bei einem Luftstrom Spitze, wenn die Proben trocken sind (vorsichtig). Nicht übertrocknen Proben, könnte aus diesem Grund in Höhe von Verbindungen. </li><li> Nachdem die Proben getrocknet sind, können wir beginnen die Methylierung der Carbonsäure-haltige Verbindungen in unseren Proben. Zunächst werden 100 ul einer diethyether / Methanol-Gemisch (9:1 vol / vol) in jedes Fläschchen von 4μl einer 2M Trimethylsilyldiazomethan Lösung (in Hexan, Sigma Aldrich) zugegeben. Vials werden sofort mit einem Open-Air-Schraubverschluss mit einem Teflon-ausgekleideten Silikonseptum ausgestattet geschlossen. Vorsichtig schütteln und bei RT für 25 bis 30min. </li><li> Nach Abschluss der Stufe 9, auf einem Heizblock und setzen wiederum auf die gewünschte Temperatur Sammlung. Die Volatilität des methylierten Verbindungen hängt von ihrer Größe, sondern auch auf andere, polare Gruppen wie = O,-OH und-NH. Für Jasmonsäure und Salicylsäure-Methylester eine Sammlung Temperaturen um 80 ° C ausreichend, wohingegen beispielsweise andere Verbindungen wie C18-Fettsäuren, Jasmonsäure-Aminosäure-Konjugate, Coronatin und 12-oxo-phytodienoic säuremethylester erfordern Temperatur zwischen 180-200 ° C, um effektiv zu verflüchtigen. </li><li> Nach 30min Inkubation der Methylierungsreaktion muss gestoppt, um unerwünschte Nebenreaktion zu vermeiden. Dies wird durch Zugabe von 4 ul einer 2 M Essigsäure-Lösung (in Hexan) in jedes Fläschchen getan. Nach dem Schließen der Röhrchen mit Kappen und einen kurzen Vortexen werden die Proben dürfen für eine weitere 30min inkubiert. </li><li> Die Filter für diese Dampfphase Extraktion verwendet werden handgefertigt und in der vorgestellten Form nicht im Handel erhältlich. Sie bestehen aus einer äußeren Teflonschlauch (ca. 7-8cm lang), in die von der einen Seite eine gut sitzende Glasrohr von ca. 4cm Länge eingelegt ist. Auf der anderen Seite der Teflonschlauch ein Edelstahlgewebe Scheibe ist in der Röhre geschoben, bis es das innere Glasrohr erreicht und auf die über 20-30mg Adsorbens (entweder SuperQ 80/100 (abgebrochen) oder HayeSep ® Q80/100) hinzugefügt werden. Ein weiterer Edelstahlgewebe Disc eingelegt ist und schließlich ein Glas von Spitze wird in den Teflonschlauch schiebt, damit vorsichtiges Drücken der Edelstahlgewebe Disc auf dem saugfähigen. Ein detailliertes Bild eines Filters ist in Abbildung 1 dargestellt. <img src="/files/ftp_upload/1127/1127fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. </li><li> Während der Inkubationszeit von Schritt 11, müssen die Filter für die Sammlung des methylierten und somit volatile Pflanzenhormone, gewaschen mit ersten 200 &amp;mgr; l Methanol und dann 2 Wäschen mit 200 &amp;mgr; l Dichlormethan. Solvent übrigen in die Filter wird dann durch Luft geblasen. Die Filter können nun für das Auffangen flüchtiger Hormone durch Dampf-Flüssig-Extraktion verwendet werden. </li><li> Nach 30min Inkubation der Gummisepta der 4ml Fläschchen Kappen sind mit einem Skalpell ausgeschnitten. Um die Pflanzenhormone von Dampf-Flüssig-Extraktion der gereinigten Filtern auf einzelne Vakuumleitungen bei einer Flussrate von ca. 800ml/min verbunden sind zu sammeln. Die Filter werden dann in das Fläschchen durch den Schnitt Septen eingefügt. Eine kleine Pipettenspitze wird auch eingesetzt, um als Lufteinlass handeln. Während dieser ersten Teil des Verfahrens, die Fläschchen mit den eingesetzten Filter müssen gehalten werdenin eine aufrechte Position zu einem der Flüssigkeit im Inneren der Flasche zu vermeiden, in Kontakt mit dem Filter Spitze, die den Filter und anschließend auch die GC / MS verunreinigen bekommen würde. Die Fläschchen werden dann von Hand gehalten, bis die gesamte Flüssigkeit durch den Filter verdampft wird. Dann werden die Flaschen mit den beiliegenden Filter sind auf dem Heizblock und Wärme verdampft Verbindungen für 3min gesammelt platziert. Die Hauptkomponenten des Systems sowie die Einrichtung sind in Abbildung 1 dargestellt. Nach dieser letzten Dampfphase Extraktionsschritt die Fläschchen mit den Filtern noch angebracht sind auf einem Gestell angebracht und abkühlen. </li><li> Wenn der Filter Raumtemperatur wieder erreicht sie mit 150 ml Dichlormethan in ein 1,5 ml GC-Fläschchen mit einer Einlage versehen eluiert. Alter Ausblasen der restliche Lösungsmittel aus dem Filter die Vials verschlossen und analysiert mittels GC / MS. </li></ol> Ein Gaschromatograph mit Split / Splitlos-Injektor (Splitless-Modus 250 ° C, Injektionsvolumen 1μ) Schnittstelle mit einem Massenspektrometer in chemische Ionisation-Modus (CI) betrieben für die Analyse verwendet werden) ausgestattet. Compounds basieren auf HP-1MS Säule (30m x 0,25 mm x 025μm) statt bei 40 ° C für 1 min nach der Injektion und dann bei 15 ° C programmiert / min auf 250 ° C (10 min), mit Helium als Trägergas Gas (constant flow 0.7ml/min). Für die MS-Analyse sowohl ein Quadrupol (zB Agilent HP5973) und einer Ionenfalle basiert (zB Varian Saturn 2200) Massenspektrometer verwendet werden kann. Als CI Gas entweder Isobutan (kommt in der Gas-Tanks) oder Methanol (Dämpfe aus einem Flüssigkeitsbehälter verwendet werden) verwenden können, aber in jedem Fall die Fragmente der Ionisierungsreaktion sollten vor dem ausgewählten Ionen-count (SIC) Programme überprüft werden geschaffen werden. Wir haben folgendes Programm für eine Varian GC 3900/Saturn MS 2200 System und Methanol als CI-Reagenz eingesetzt: 5.00-11.30min Ionen (M +1) + 153-158 (Methylsalicylat 153, Methyl-2 H 5-Salicylat); 11.30-13.30min Ionen (M +1) + 207-228 (Methyljasmonat 207 und 225, Methyldihydrojasmonat 209 und 227); 13.30-16.30min Ionen (M +1) + 237-300 (methyl Abscisinsäure 261, Methyl-2 H 6-Abscisinsäure 267 (Abscisinsäure produziert überwiegend [MH 2 O +1] +-Ionen). Alle Verbindungen sollten durch Vergleich mit authentischen kommerziell erhältlichen Standards identifiziert werden. Quantifizierung von JA, SA, und ABA durch Korrelation der Peakfläche erfolgt (extrahierten Ionen) mit dem Peak-Fläche (extrahierten Ionen) der jeweiligen internen Standards und ist auch auf das Frischgewicht des Pflanzenmaterials verwendet wird.

<ol>
	<li>Schmelz, E. A., Engelberth, J., Tumlinson, J. H., Alborn, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+vapor+phase+extraction+in+metabolic+profiling+of+phytohormones+and+other+metabolites.">The use of vapor phase extraction in metabolic profiling of phytohormones and other metabolites.</a> Plant Journal. 39, 790-808 (2004).</li><li>Engelberth, J., Alborn, H. T., Schmelz, E. A., Tumlinson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airborne+signals+prime+plants+against+insect+herbivore+attack.">Airborne signals prime plants against insect herbivore attack.</a> PNAS. 101, 1781-1785 (2004).</li><li>Schmelz, E. A., Engelberth, J., Alborn, H. T., O&amp;acute, D. o. n. n. e. l., Sammons, P., Toshima, M., H, J. H. T. u. m. l. i. n. s. o. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+analysis+of+phytohormones,+phytotoxins,+and+volatile+organic+compounds+in+plants.">Simultaneous analysis of phytohormones, phytotoxins, and volatile organic compounds in plants.</a> PNAS. 100, 10552-10557 (2003).</li><li>Engelberth, J., Schmelz, E. A., Alborn, H., Cardoza, Y. J., Huang, J., Tumlinson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Quantification+of+Jasmonic+acid+and+Salicylic+acid+by+Vapor+Phase+Extraction+and+Gas+Chromatography+-+Chemical+Ionization-Mass+Spectrometry.">Simultaneous Quantification of Jasmonic acid and Salicylic acid by Vapor Phase Extraction and Gas Chromatography - Chemical Ionization-Mass Spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 312, 242-250 (2003).</li></ol>

Die hier vorgestellte Methode hat sich bewährt, um zuverlässig arbeiten für eine breite Palette von pflanzlichen Signalstoffe, sofern die Größe und die chemische Natur der Verbindung nicht verhindern, dass es extrahiert, methyliert, und verdampft. Auch die Methylierung Verfahren, da es hier beschrieben ist nicht die einzige Möglichkeit der Derivatisierung. Silyllation und Acetylierung sind alternative Methoden und Protokolle können leicht gefunden werden online. Wenn das Massenspektro...

monitoring plant hormones during stress responses

Pflanzenhormone und damit verbundene Signal-Verbindungen spielen eine wichtige Rolle in der Regulation der pflanzlichen Reaktion auf verschiedene Reize aus der Umwelt und betont. Unter den härtesten Beanspruchungen Raupenfraß, Pathogeninfektion und Trockenstress. Für jede dieser Belastungen einer bestimmten Gruppe von Hormonen und / oder Kombinationen davon sind für die Feinabstimmung der Antworten genannt, wodurch die Pflanze das Überleben. Die wichtigsten Hormone bei der Regulation dieser Reaktionen beteiligt sind, Jasmonsäure (JA), Salicylsäure (SA) und Abscisinsäure (ABA). Zum besseren Verständnis der Rolle der einzelnen Hormone sowie deren mögliche Wechselwirkungen während dieser Reaktionen ist es notwendig, auf Veränderungen in ihrer Fülle in einem zeitlichen als auch in einer räumlichen Mode zu überwachen. Für die einfache, empfindliche und reproduzierbare Quantifizierung dieser und anderer Signalstoffe wir eine Methode entwickelt, auf Dampf-Flüssig-Extraktion und Gaschromatographie / Massenspektrometrie (GC / MS)-Analyse (1, 2, 3, 4). Nach dem Extrahieren dieser Verbindungen aus dem Pflanzengewebe durch saure wässrige 1-propanol mit Dichlormethan versetzt die Carbonsäure-haltige Verbindungen methyliert sind, verflüchtigt unter Hitze, und auf einem polymeren saugfähig. Nach der Elution in ein Probenfläschchen die Analyten durch Gas-Chromatographie getrennt und detektiert die durch chemische Ionisation-Massenspektrometrie. Der Einsatz von geeigneten internen Standards ermöglicht dann die einfache Quantifizierung über die Peakflächen von Analyt und interner Standard.

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Plant Hormones During Stress Responses at JoVE.com

Monitoring Plant Hormones During Stress Responses

Eine einfache Methode ist vorgesehen, dass ermöglicht eine schnelle Extraktion und Analyse von mehreren pflanzlichen Hormonen aus kleinen Gewebeproben. Das Verfahren nutzt Dampf-Flüssig-Extraktion als die feierliche Reinigungsschritt. Die Proben werden mittels GC / MS mit chemischer Ionisation, die vor allem produziert (M +1) +-Ionen analysiert.

Überwachung Pflanzenhormone bei Stress Responses

Plant hormones and related signaling compounds play an important role in the regulation of plant responses to various environmental stimuli and stresses. ...

monitoring-plant-hormones-during-stress-responses

Research

JoVE Journal

Biology

16.5K Aufrufe.  University of Texas. Eine einfache Methode ist vorgesehen, dass ermöglicht eine schnelle Extraktion und Analyse von mehreren pflanzlichen Hormonen aus kleinen Gewebeproben. Das Verfahren nutzt Dampf-Flüssig-Extraktion als die feierliche Reinigungsschritt. Die Proben werden mittels GC / MS mit chemischer Ionisation, die vor allem produziert (M +1) +-Ionen analysiert.

Serie: Monitoring Plant Hormones During Stress Responses

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called photoreceptors to sense and adapt to light. The red/far-red light-absorbing phytochrome photoreceptors have been studied extensively. Phytochromes exist as a family of proteins with distinct and overlapping functions in all higher plant systems in which they have been studied1. Phytochrome-mediated light responses, which range from seed germination through flowering and senescence, are often localized to specific plant tissues or organs2. Despite the discovery and elucidation of individual and redundant phytochrome functions through mutational analyses, conclusive reports on distinct sites of photoperception and the molecular mechanisms of localized pools of phytochromes that mediate spatial-specific phytochrome responses are limited. We designed experiments based on the hypotheses that specific sites of phytochrome photoperception regulate tissue- and organ-specific aspects of photomorphogenesis, and that localized phytochrome pools engage distinct subsets of downstream target genes in cell-to-cell signaling. We developed a biochemical approach to selectively reduce functional phytochromes in an organ- or tissue-specific manner within transgenic plants. Our studies are based on a bipartite enhancer-trap approach that results in transactivation of the expression of a gene under control of the Upstream Activation Sequence (UAS) element by the transcriptional activator GAL43. The biliverdin reductase (BVR) gene under the control of the UAS is silently maintained in the absence of GAL4 transactivation in the UAS-BVR parent4. Genetic crosses between a UAS-BVR transgenic line and a GAL4-GFP enhancer trap line result in specific expression of the BVR gene in cells marked by GFP expression4. BVR accumulation in Arabidopsis plants results in phytochrome chromophore deficiency in planta5-7. Thus, transgenic plants that we have produced exhibit GAL4-dependent activation of the BVR gene, resulting in the biochemical inactivation of phytochrome, as well as GAL4-dependent GFP expression. Photobiological and molecular genetic analyses of BVR transgenic lines are yielding insight into tissue- and organ-specific phytochrome-mediated responses that have been associated with corresponding sites of photoperception4, 7, 8. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) of GFP-positive, enhancer-trap-induced BVR-expressing plant protoplasts coupled with cell-type-specific gene expression profiling through microarray analysis is being used to identify putative downstream target genes involved in mediating spatial-specific phytochrome responses. This research is expanding our understanding of sites of light perception, the mechanisms through which various tissues or organs cooperate in light-regulated plant growth and development, and advancing the molecular dissection of complex phytochrome-mediated cell-to-cell signaling cascades.

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

The molecular basis of spatial-specific phytochrome responses is being investigated using transgenic plants that exhibit tissue- and organ-specific phytochrome deficiencies. The isolation of specific cells exhibiting induced phytochrome chromophore depletion by Fluorescence-Activated Cell Sorting followed by microarray analyses is being utilized to identify genes involved in spatial-specific phytochrome responses.

Untersuchung Tissue-und Organ-spezifische Phytochrom Antworten mit FACS-gestützte zelltypspezifisch Expression Profiling in Arabidopsis thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

Forschung

Biologie

Bioassays for Monitoring Insecticide Resistance

Pest resistance to pesticides is an increasing problem because pesticides are an integral part of high-yielding production agriculture. When few products are labeled for an individual pest within a particular crop system, chemical control options are limited. Therefore, the same product(s) are used repeatedly and continual selection pressure is placed on the target pest. There are both financial and environmental costs associated with the development of resistant populations. The cost of pesticide resistance has been estimated at approximately $ 1.5 billion annually in the United States. This paper will describe protocols, currently used to monitor arthropod (specifically insects) populations for the development of resistance. The adult vial test is used to measure the toxicity to contact insecticides and a modification of this test is used for plant-systemic insecticides. In these bioassays, insects are exposed to technical grade insecticide and responses (mortality) recorded at a specific post-exposure interval. The mortality data are subjected to Log Dose probit analysis to generate estimates of a lethal concentration that provides mortality to 50% (LC50) of the target populations and a series of confidence limits (CL's) as estimates of data variability. When these data are collected for a range of insecticide-susceptible populations, the LC50 can be used as baseline data for future monitoring purposes. After populations have been exposed to products, the results can be compared to a previously determined LC50 using the same methodology.

This manuscript demonstrates and discusses techniques used to survey pesticide susceptibility and detect resistance to contact and systemic pesticides in arthropod pests.

Bioassays zur Überwachung Insecticide Resistance

Pest resistance to pesticides is an increasing problem because pesticides are an integral part of high-yielding production agriculture. When few products ...

Linking Predation Risk, Herbivore Physiological Stress and Microbial Decomposition of Plant Litter

The quantity and quality of detritus entering the soil determines the rate of decomposition by microbial communities as well as recycle rates of nitrogen (N) and carbon (C) sequestration1,2. Plant litter comprises the majority of detritus3, and so it is assumed that decomposition is only marginally influenced by biomass inputs from animals such as herbivores and carnivores4,5. However, carnivores may influence microbial decomposition of plant litter via a chain of interactions in which predation risk alters the physiology of their herbivore prey that in turn alters soil microbial functioning when the herbivore carcasses are decomposed6. A physiological stress response by herbivores to the risk of predation can change the C:N elemental composition of herbivore biomass7,8,9 because stress from predation risk increases herbivore basal energy demands that in nutrient-limited systems forces herbivores to shift their consumption from N-rich resources to support growth and reproduction to C-rich carbohydrate resources to support heightened metabolism6. Herbivores have limited ability to store excess nutrients, so stressed herbivores excrete N as they increase carbohydrate-C consumption7. Ultimately, prey stressed by predation risk increase their body C:N ratio7,10, making them poorer quality resources for the soil microbial pool likely due to lower availability of labile N for microbial enzyme production6. Thus, decomposition of carcasses of stressed herbivores has a priming effect on the functioning of microbial communities that decreases subsequent ability to of microbes to decompose plant litter6,10,11.
We present the methodology to evaluate linkages between predation risk and litter decomposition by soil microbes. We describe how to: induce stress in herbivores from predation risk; measure those stress responses, and measure the consequences on microbial decomposition. We use insights from a model grassland ecosystem comprising the hunting spider predator (Pisuarina mira), a dominant grasshopper herbivore (Melanoplus femurrubrum),and a variety of grass and forb plants9.

We present methods to evaluate how predation risk can alter the chemical quality of herbivore prey by inducing dietary changes to meet demands of heightened stress, and how the decomposition of carcasses from these stressed herbivores slows subsequent plant litter decomposition by soil microbes.

Linking Prädationsrisiko, Herbivore Physiologische Stress und mikrobielle Zersetzung des Pflanzenstreu

The quantity and quality of detritus entering the soil  determines the rate of decomposition by microbial communities as well as  recycle rates of ...

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. Alterations of this program can lead to the growth of damaged cells, a hallmark of cancer development, or to premature cell death such as seen in neurodegenerative diseases. Much of what is known concerning the molecular basis for translational control has been obtained from polysome analysis using a density gradient fractionation system. This technique relies on ultracentrifugation of cytoplasmic extracts on a linear sucrose gradient. Once the spin is completed, the system allows fractionation and quantification of centrifuged zones corresponding to different translating ribosomes populations, thus resulting in a polysome profile. Changes in the polysome profile are indicative of changes or defects in translation initiation that occur in response to various types of stress. This technique also allows to assess the role of specific proteins on translation initiation, and to measure translational activity of specific mRNAs. Here we describe our protocol to perform polysome profiles in order to assess translation initiation of eukaryotic cells and tissues under either normal or stress growth conditions.

Here, we describe a method to analyze changes in the initiation of mRNA translation of eukaryotic cells in response to stress conditions. This method is based on the velocity separation on sucrose gradients of translating ribosomes from non-translating ribosomes.

Analyse der Translation Initiation Während Stress-Bedingungen durch Polysomprofile Profiling

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

Hydroponics: A Versatile System to Study Nutrient Allocation and Plant Responses to Nutrient Availability and Exposure to Toxic Elements

Hydroponic systems have been utilized as one of the standard methods for plant biology research and are also used in commercial production for several crops, including lettuce and tomato. Within the plant research community, numerous hydroponic systems have been designed to study plant responses to biotic and abiotic stresses. Here we present a hydroponic protocol that can be easily implemented in laboratories interested in pursuing studies on plant mineral nutrition.
This protocol describes the hydroponic system set up in detail and the preparation of plant material for successful experiments. Most of the materials described in this protocol can be found outside scientific supply companies, making the set up for hydroponic experiments less expensive and convenient.
The use of a hydroponic growth system is most advantageous in situations where the nutrient media need to be well controlled and when intact roots need to be harvested for downstream applications. We also demonstrate how nutrient concentrations can be modified to induce plant responses to both essential nutrients and toxic non-essential elements.

Here, we present an easy-to-follow protocol to establish a successful hydroponic system for plant nutrition studies. This protocol has been extensively tested in Arabidopsis and can easily be adapted to other plant species to study specific nutritional requirements or the effect of non-essential elements on plant growth and development.

Hydroponics: ein vielseitiges System Nährstoff Allocation und Pflanzen Reaktionen auf die Nährstoffverfügbarkeit und Belastung durch toxische Elemente zu studieren

Hydroponic systems have been utilized as one of the standard methods for plant biology research and are also used in commercial production for several ...

Split Green Fluorescent Protein System to Visualize Effectors Delivered from Bacteria During Infection

Bacteria, one of the most important causative agents of various plant diseases, secrete a set of effector proteins into the host plant cell to subvert the plant immune system. During infection cytoplasmic effectors are delivered to the host cytosol via a type III secretion system (T3SS). After delivery into the plant cell, the effector(s) targets the specific compartment(s) to modulate host cell processes for survival and replication of the pathogen. Although there has been some research on the subcellular localization of effector proteins in the host cells to understand their function in pathogenicity by using fluorescent proteins, investigation of the dynamics of effectors directly injected from bacteria has been challenging due to the incompatibility between the T3SS and fluorescent proteins.
Here, we describe our recent method of an optimized split superfolder green fluorescent protein system (sfGFPOPT) to visualize the localization of effectors delivered via the bacterial T3SS in the host cell. The sfGFP11 (11th &#946;-strand of sfGFP)-tagged effector secreted through the T3SS can be assembled with a specific organelle targeted sfGFP1-10OPT (1-10th &#946;-strand of sfGFP) leading to fluorescence emission at the site. This protocol provides a procedure to visualize the reconstituted sfGFP fluorescence signal with an effector protein from Pseudomonas syringae in a particular organelle in the Arabidopsis and Nicotiana benthamiana plants.

Fluorescent protein-based approaches to monitor effectors secreted by bacteria into host cells are challenging. This is due to the incompatibility between fluorescent proteins and the type-III secretion system. Here, an optimized split superfolder GFP system is used for visualization of effectors secreted by bacteria into the host plant cell.

Split-grün fluoreszierendes Protein System Effektoren geliefert von Bakterien während der Infektion zu visualisieren

Bacteria, one of the most important causative agents of various plant diseases, secrete a set of effector proteins into the host plant cell to subvert the ...

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and physiology. Thus, organisms have evolved targeted and specific stress responses dedicated to repair damage and maintain homeostasis. These mechanisms include the unfolded protein response of the endoplasmic reticulum (UPRER), the unfolded protein response of the mitochondria (UPRMT), the heat shock response (HSR), and the oxidative stress response (OxSR). The protocols presented here describe methods to detect and characterize the activation of these pathways and their physiological consequences in the nematode, C. elegans. First, the use of pathway-specific fluorescent transcriptional reporters is described for rapid cellular characterization, drug screening, or large-scale genetic screening (e.g., RNAi or mutant libraries). In addition, complementary, robust physiological assays are described, which can be used to directly assess sensitivity of animals to specific stressors, serving as functional validation of the transcriptional reporters. Together, these methods allow for rapid characterization of the cellular and physiological effects of internal and external proteotoxic perturbations.

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Here, we characterize cellular proteotoxic stress responses in the nematode C. elegans by measuring the activation of fluorescent transcriptional reporters and assaying sensitivity to physiological stress.

Messung physiologischer Stressreaktionen in C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the most important post-translational modifications in eukaryotic organisms. Ubiquitylation is mediated by a sequential cascade of three enzyme classes including ubiquitin-activating enzymes (E1 enzymes), ubiquitin-conjugating enzymes (E2 enzymes), and ubiquitin ligases (E3 enzymes), and sometimes, ubiquitin-chain elongation factors (E4 enzymes). Here, in vitro protocols for ubiquitylation assays are provided, which allow the assessment of E3 ubiquitin ligase activity, the cooperation between E2-E3 pairs, and substrate selection. Cooperating E2-E3 pairs can be screened by monitoring the generation of free poly-ubiquitin chains and/or auto-ubiquitylation of the E3 ligase. Substrate ubiquitylation is defined by selective binding of the E3 ligase and can be detected by western blotting of the in vitro reaction. Furthermore, an E2~Ub discharge assay is described, which is a useful tool for the direct assessment of functional E2-E3 cooperation. Here, the E3-dependent transfer of ubiquitin is followed from the corresponding E2 enzyme onto free lysine amino acids (mimicking substrate ubiquitylation) or internal lysines of the E3 ligase itself (auto-ubiquitylation). In conclusion, three different in vitro protocols are provided that are fast and easy to perform to address E3 ligase catalytic functionality.

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The present study provides detailed in vitro ubiquitylation assay protocols for the analysis of E3 ubiquitin ligase catalytic activity. Recombinant proteins were expressed using prokaryotic systems such as Escherichia coli culture.

In vitro Analyse der E3-Ubiquitin-Ligase-Funktion

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

Construction of Homozygous Mutants of Migratory Locust Using CRISPR/Cas9 Technology

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an important research model for insect metamorphosis. The CRISPR/Cas9 system can accurately locate at a specific DNA locus and cleave within the target site, efficiently introducing double-strand breaks to induce target gene knockout or integrate new gene fragments into the specific locus. CRISPR/Cas9-mediated genome editing is a powerful tool for addressing questions encountered in locust research as well as a promising technology for locust control. This study provides a systematic protocol for CRISPR/Cas9-mediated gene knockout with the complex of Cas9 protein and single guide RNAs (sgRNAs) in migratory locusts. The selection of target sites and design of sgRNA are described in detail, followed by in vitro synthesis and verification of the sgRNAs. Subsequent procedures include egg raft collection and tanned-egg separation to achieve successful microinjection with low mortality rate, egg culture,&#160;preliminary estimation of the mutation rate, locust breeding as well as detection, preservation, and passage of the mutants to ensure population stability of the edited locusts. This method can be used as a reference for CRISPR/Cas9 based gene editing applications in migratory locusts as well as in other insects.

This study provides a systematically optimized procedure of CRISPR/Cas9 ribonuclease-based construction of homozygous locust mutants as well as a detailed method for cryopreservation and resuscitation of the locust eggs.

Konstruktion homozygoter Mutanten der Wanderheuschrecke mittels CRISPR/Cas9-Technologie

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an ...

Combining Clearing and Fluorescence Microscopy for Visualising Changes in Gene Expression and Physiological Responses to Plasmodiophora brassicae

Infection of Brassica crops by the soilborne protist Plasmodiophora brassicae leads to gall formation on the underground organs. The formation of galls requires cellular reprogramming and changes in the metabolism of the infected plant. This is necessary to establish a pathogen-oriented physiological sink toward which the host nutrients are redirected. For a complete understanding of this particular plant-pathogen interaction and the mechanisms by which host growth and development are subverted and repatterned, it is essential to track and observe the internal changes accompanying gall formation with cellular resolution. Methods combining fluorescent stains and fluorescent proteins are often employed to study anatomical and physiological responses in plants. Unfortunately, the large size of galls and their low transparency act as major hurdles in performing whole-mount observations under the microscope. Moreover, low transparency limits the employment of fluorescence microscopy to study clubroot disease progression and gall formation. This article presents an optimized method for fixing and clearing galls to facilitate epifluorescence and confocal microscopy for inspecting P. brassicae-infected galls. A tissue-clearing protocol for rapid optical clearing was used followed by vibratome sectioning to detect anatomical changes and localize gene expression with promoter fusions and reporter lines tagged with fluorescent proteins. This method will prove useful for studying cellular and physiological responses in other pathogen-triggered structures in plants, such as nematode-induced syncytia and root knots, as well as leaf galls and deformations caused by insects.

Combining Clearing and Fluorescence Microscopy for Visualising Changes in Gene Expression and Physiological Responses to Plasmodiophora brassicae

The present protocol describes an optimized method for the histological observation of galls induced by Plasmodiophora brassicae. Vibratome sections of hypocotyls are cleared before fluorescence imaging to study the involvement of transcription factors and phytohormones during disease progression. This protocol overcomes resin embedding limitations, enabling in planta visualization of fluorescent proteins.

Kombination von Clearing- und Fluoreszenzmikroskopie zur Visualisierung von Veränderungen der Genexpression und physiologischen Reaktionen auf Plasmodiophora brassicae

Infection of Brassica crops by the soilborne protist Plasmodiophora brassicae leads to gall formation on the underground organs. The formation of galls ...