معتمد من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح كيلوبايت GM54544.

الجزء 1 : الأجهزة والمعدات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مطلوب مجهر تشريح جيد للتشريح الجنين ؛ يقترح التكبير 40X ، مع قطع العين 25X الحد الأقصى لزيادة التكبير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مطلوبة ملقط غرامة (رقم 5) لاختيار دليل للأجنة وأجنة devitellinization. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مطلوب معدات لصنع الزجاج وتعديل الإبر الدقيقة. مطلوبة انسحبت من الزجاج الإبر للتشريح. نحن نفضل الزجاج صلبا للتشريح (تستمر لفترة أطول) ، ولكن معيار أنابيب زجاجية سميكة الجدران (1-1،5 ملم القطر الخارجي) يعمل كذلك. بعض الناس استخدام الإبر التنغستن غرامة ، بالكهرباء إلى الحدة المطلوبة في حمام من هيدروكسيد الصوديوم 1M باستخدام 10 أمبير + autotransformer البطارية. الإبر التنغستن شحذ تشريح لها فائدة أنها مرنة نسبيا وطويل الأمد. وترد الإبر الزجاج جوفاء (مشابهة لتشكيل أقطاب التصحيح المشبك) لأنابيب البلاستيك وتستخدم أثناء تشريح لشفط وطرد من المياه المالحة ، وكذلك التسليم المراقب من الغراء. مجموعة متنوعة من الزجاج جر تتوفر لتصنيع الزجاج الإبر. يمكن للكمبيوتر أن تكون مبرمجة مسبقا جر لسحب مجموعة متنوعة من الأشكال والأحجام. وبراون يلهب النماذج (سوتر الصك شركاه) هي المفضلة على نطاق واسع. وينبغي أن يكون مجمع المجهر (40X 20 هدف) سيكون متاحا لفحص وتعديل كهربائي قبل استخدامه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويشيع استخدام نوعين من الحلول لحمام الأنسجة الجنينية أثناء تشريح : 1) &quot;قياسية&quot; (جان وجان ، 1976a) أو &quot;تعديل المعيار&quot; (Broadie ، 2000) ملاحات ، على أساس الحلول شيوعا للتسجيل في النظم الأخرى اللافقارية ، و 2) &quot;الدموي مثل&quot; (HL) ملاحات (ستيوارت وآخرون 1994) ، حلا وسطا بين المالحة القياسية وقياس التركيزات الأيونية الدموي في ذبابة الفاكهة. تجدر الإشارة إلى أن أيا من هذه ملاحات تحاكي بدقة التركيب الكيميائي للالدموي في الجسم الحي (Broadie ، 2000). يتضمن معيار المالحة (مم) : 135 كلوريد الصوديوم ، 5 بوكل ، 4 MgCl 2 و 1.8 CaCl 2 ، 72 السكروز ، 5 TES ، ودرجة الحموضة 7،2. المجربون قد ترغب أيضا في النظر في إعداد تجاريا المالحة الحشرات (وسائل الإعلام مثل شنايدر الحشرات) ، وهو غير مناسب للتسجيل الكهربية ولكن على الأرجح لحماية صحة الأنسجة المكشوفة. </li></ol> الجزء 2 : التدريج الأجنة والتشريح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لجمع البيض الأمثل ، والحفاظ على الشباب (&lt;7 أيام) ، ذكور الذباب صحية والإناث (20-40) على أواني زرع الطازجة لمدة 2-3 أيام. أواني زرع تتألف في العادة من الأكواب البلاستيكية 100 مل (ثلاثي صب) مثقبة لتوفير ما يكفي من دوران الهواء ، وتغطي لوحة آغار 60 مم. لوحات تحتوي على أجار التفاح أو عصير العنب مع تصلب آغار. عدة وصفات موجودة ، ولكن هو مثال واحد على النحو التالي : 700 مليلتر من الماء ، 25-30 آغار غراما ، و 300 مل من عصير (العنب أو التفاح) ، 0.5g البارابين الميثيل (ف hydroxymethylbenzoate) ، والسكر 30G. الأوتوكلاف الماء وآغار ، وتغلي بشكل منفصل ف hydroxymethylbenzoate مع السكر وعصير. مزيج من عصير آغار والحلول وتصب بسرعة الى 60 ملم لوحات ، وإزالة الفقاعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل جمع البيض ، ويتم تغذية الذباب مع لصق الخميرة (7 جرام خميرة بيكر في 9 مل من المياه المخزنة في 4 درجات مئوية) على لوحات جديدة ، تغير ما لا يقل عن مرتين في اليوم لمدة يومين على الاقل. قبل 3 أيام ، يجب أن يكون وعاء جيد إنتاج البيض 100-200 للساعة الواحدة. وقد لوحظ أفضل وضع البيض في وعاء حافظ على جانبها مع آغار في لوحة خدش. وسيتم وضع العديد من الأجنة في أو بالقرب من الخدوش. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لجمع أعداد كبيرة من الأجنة ، ونقل الأجنة بلطف من لوحة أجار في سلة باستخدام فرشاة الرسم. ويمكن إجراء سلة مع أنبوب الطرد المركزي 15 أو 50 مل. قطع الجزء السفلي ترك مساحة كافية للاعتراض على شاشة (70 ميكرومتر شبكة) بين الغطاء والجزء العلوي من الأنبوب. شطف الأجنة مع DH 2 0 وضعت في طبق بتري من المبيض بنسبة 50 ٪ الى 100 ​​٪ جديدة لإزالة المشيماء الخارجي. بدلا من ذلك ، يمكن جمع البيض بشكل فردي باستخدام الملقط غرامة ، وdechorionated عن طريق وضعها يدويا في قطرة من التبييض. يمكن اجتثاث chorionation تتخذ من أكثر من 30 ثانية إلى 2 دقيقة (التبييض الطازجة أسرع بكثير) ، وينبغي رصدها تحت مجهر تشريح. إزالة المشيماء يعرض لامعة ، والغشاء المحي شفافة. وينبغي أن البيض Dechorionated تشطف ، أو وضعها في المياه المالحة ، والتبييض يدمر الأنسجة devitellinized بسرعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فمن الأهمية بمكان أن مرحلة الأجنة بعناية حتى سن التنموية المنشودة. في المراحل الجنينية تعريف ذبابة الفاكهة (17/01 ؛ كامبوس اورتيغا وHartenstein ، 1985) ليست مفيدة ، وتطوير جميع الوظيفية العصبية والعضلية يحدث في مرحلة متأخرة 16 أو 17 مرحلة. وبالتالي ، فإن قام قبل ساعات التنموية الأجنة عند 25 درجة مئوية في حاضنة مرطب ، في ساعات بعد الإخصاب أو ، وهو الأكثر شيوعا ، وبعد وضع البيض (AEL). في ظل هذه الظروف ، تخلق يدوم 21 + / -- 1 ساعة عند 25 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البيض من وضع البيض توقيت (1-2 ساعةوينظر المقبل) التي تتراوح أعمارهم مناسب لمعايير شكلية. بعد الغسيل واسعة في DH 2 O ، يتم وضع البيض في صحن dechorionated ثقافة البلاستيك (تحت O 2 درهم) للعرض. ويمكن التأكد من التدريج الصحيح مع المعايير المورفولوجية باستخدام الضوء المنعكس مع مجهر تشريح (كامبوس وHartenstein أورتيغا ، 1985). من المسلم به عموما تنضج في وقت متأخر من مرحلة الأجنة (22 - 24H AEL) على وشك الفقس عن طريق تجزئة للبشرة والقصبة الهوائية المتضخمة. ويمكن أيضا استخدام الأجنة يكون genotyped GFP موازنات ومضان المجهر تشريح مع الفلاتر المناسبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتشريح والأجنة ونظموا dechorionated تنمويا المرفقة (الجانب الظهري متابعة) على ساترة تحت قطرة من المياه المالحة (انظر الخطوة 1.5). تتم إزالة غشاء الأجنة من المحي بواسطة ثقب الغشاء قرب نهاية الأمامي أو الخلفي مع micropipette الزجاج أو إبرة التنغستن ، ومن ثم تحرير بلطف الجنين من الغشاء. استعدادا للتشريح ، ينبغي وضع الجنين على ساترة ليصل السطح الظهري (الجانب الظهرية يصل تشريح سيعرض النظام العصبي وبطني neuromusculature للتجارب ، ولكن من الواضح أن يكون وضع الجنين في طرق أخرى لتسهيل الحصول على أخرى الأنسجة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأجنة مرحلة مبكرة (&lt;16 ساعة AEL) نعلق مباشرة لتنظيف الزجاج أو الزجاج المطلي مع متعدد الليزين (بولي - L - يسين هيدروبروميد ؛ Broadie وباتي ، 1993a ، ب). يجب أن يكون لاصق الأجنة كبار السن (&gt; 16 ساعة AEL) ، في أعقاب تشكيل إهاب ، مثالي لcoverslips (داو كورننغ) Sylgard المغلفة. ويتم استخدام المياه البلمرة cyanoacrylate الغراء الجراحية أو البيطرية (Broadie وباتي ، 1993c ، د). يتم تسليم الغراء من خلال ماصة زجاج كهربائي صغير (10-20 ميكرون غيض القطر الداخلي) موصولة إلى أنبوب المطاط مع تدفق الغراء التي تسيطر عليها ضغط الفم. يجب توخي الحذر أثناء الولادة الغراء ، والصمغ polymerizes بسرعة عند الاتصال المالحة. نلاحظ أيضا أنه لا يمكن إجراء الإلتصاق في المياه المالحة أو منخفضة مع عدم وجود تركيزات أيون ثنائي التكافؤ ، كما يتطلب الغراء أيونات ثنائي التكافؤ لتبلمر. واستخدم لأول مرة بكميات صغيرة من الغراء تعلق بحزم الرأس والذيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حالما يتم لصقها ينتهي من الجنين الى ساترة ، يتم إجراء شق على طول خط الوسط الظهرية مع القطب الزجاج أو شحذ إبرة التنغستن. يرصد هذا أسهل من خلال ثقب بلطف خط شق قبل اتخاذ خفض النهائي. وترد ثم الجانبين من شق إلى ساترة مع أكثر الغراء ، لنشر بلطف الشقة الجنين. الأعضاء الداخلية بما في ذلك في الأمعاء ، والهيئات والدهون ، اختياريا ، ثم تتم إزالة القصبة الهوائية عن طريق الشفط باستخدام ماصة الزجاج المرفقة أنابيب مطاطية (Broadie وباتي 1993a ، ج). وينبغي الآن أن يرفق الجنين شقة للساترة ، البشرة أسفل بطني مع نظام العصبي المركزي والأعصاب الطرفية ، وعضلات جسدية تتعرض للتجريب. </li></ol>

التدريج الدقيق للأجنة غير الحاسمة نظرا لنضوج السريع للخصائص الفنية على مدار الساعة لعدة ساعات فقط. العديد من القضايا من تعقيد هذا التدريج. أولا ، معظم الباحثين استخدام بويضة لأجنة يضع توقيت المرحلة ، ولكن في المرة البيض يمكن أن تتفاوت كثيرا من الحيوان إلى الحيوان في ...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Embryo Collection Cages</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genesee Scientific (www.flystuff.com)</td>
<td>59-100 (for 60 mm dish; other sizes available)</td>
<td>Cages can also be home made using punctured tri-pour beakers, as shown in video</td>
</tr>
<tr>
<td>Sylgard 184</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>Available from various companies</td>
<td>Surgical glue adheres better to sylgard-coated coverslips</td>
</tr>
<tr>
<td>Fine glass tubing, outer diameter 1.0-1.5 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>various</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>For pulling into fine glass needles for dissection and tubes for glue delivery</td>
</tr>
<tr>
<td>Plastic tubing, to attach to glass pipette for mouth suction and glue application</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Tygon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Tubing inner diameter needs to match glass outer diameter.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

harvesting and preparing drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures

ذبابة الفاكهة نموذجا رئيس الوزراء الجينية لدراسة كل من التطور الجنيني وعلم الأعصاب وظيفية. تقليديا ، لا بأس هذه الحقول المعزولة عن بعضها البعض ، مع تواريخ مستقلة إلى حد كبير والمجتمعات العلمية. ومع ذلك ، فإن التفاعل بين هذه المجالات المتباينة عادة البرامج التنموية الكامنة وراء اكتساب الخصائص الكهربائية وتمايز وظيفي الإشارات الكيميائية من نقاط الاشتباك العصبي وظيفية خلال المراحل النهائية لتشكيل الدوائر العصبية. هذه الواجهة هي منطقة ذات أهمية حاسمة للتحقيق فيها. في ذبابة الفاكهة ، وهذه مراحل التطوير الوظيفي يحدث خلال الفترة من 8 ساعات &lt;(عند درجة 25) خلال الثلث الأخير من مرحلة التطور الجنيني. واعتبر هذه الفترة الطويلة في وقت متأخر نظرا لالتنموية المستعصية التحقيق إلى ترسب من إهاب صعبة ، والبشرة غير منفذة. وكان مقدما اختراق تطبيق المياه البلمرة الغراء الجراحية التي يمكن تطبيقها محليا لإهاب لتمكين تشريح للرقابة في وقت متأخر من مرحلة الأجنة. مع شق طولي ظهري ، يمكن وضع الجنين شقة ، وكشف الحبل البطني العصب وعضلات الجسم الحائط لتحقيق التجريبية. وقد تم استخدام هذا النظام بشكل كبير لعزل وتوصيف طفرات جينية الجنينية التي تعوق تشكيل المشبك ، وبالتالي تكشف عن الآليات الجزيئية التي تحكم مواصفات وتمايز الاتصالات المشبك والوظيفية خصائص متشابك الإشارة.

Watch this Scientific Journal Video about Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures at JoVE.com

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

هذا الأسلوب يعرض neuromusculature الجنينية لذبابة الفاكهة المناعية أو تسجيل الكهربية. ومن المفيد لدراسة الأحداث المبكرة في التنمية العصبية والعضلية أو أداء الكهربية في المسوخ التي لا يفقس.

الحصاد وإعداد ذبابة الفاكهة الأجنة لتسجيل الكهربية وغيرها من الإجراءات

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

harvesting-preparing-drosophila-embryos-for-electrophysiological

Research

JoVE Journal

Biology

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

13.3K Views.  University of Illinois. هذا الأسلوب يعرض neuromusculature الجنينية لذبابة الفاكهة المناعية أو تسجيل الكهربية. ومن المفيد لدراسة الأحداث المبكرة في التنمية العصبية والعضلية أو أداء الكهربية في المسوخ التي لا يفقس.

Video: Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

التحضير للثقافات متعلق بالخلايا العصبية من أجنة ذبابة الفاكهة المرحلة Midgastrula

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Electrophysiological Methods for Recording Synaptic Potentials from the NMJ of Drosophila Larvae

In this video, we describe the electrophysiological methods for recording synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila larva. The larval neuromuscular system is a model synapse for the study of synaptic physiology and neurotransmission, and is a valuable research tool that has defined genetics and is accessible to experimental manipulation. Larvae can be dissected to expose the body wall musculature, central nervous system, and peripheral nerves. The muscles of Drosophila and their innervation pattern are well characterized and muscles are easy to access for intracellular recording. Individual muscles can be identified by their location and orientation within the 8 abdominal segments, each with 30 muscles arranged in a pattern that is repeated in segments A2 - A7. Dissected drosophila larvae are thin and individual muscles and bundles of motor neuron axons can be visualized by transillumination1. Transgenic constructs can be used to label target cells for visual identification or for manipulating gene products in specific tissues. In larvae, excitatory junction potentials (EJP&#8217;s) are generated in response to vesicular release of glutamate from the motoneurons at the synapse. In dissected larvae, the EJP can be recorded in the muscle with an intracellular electrode. Action potentials can be artificially evoked in motor neurons that have been cut posterior to the ventral ganglion, drawn into a glass pipette by gentle suction and stimulated with an electrode. These motor neurons have distinct firing thresholds when stimulated, and when they fire simultaneously, they generate a response in the muscle. Signals transmitted across the NMJ synapse can be recorded in the muscles that the motor neurons innervate. The EJP&#8217;s and minature excitatory junction potentials (mEJP&#8217;s) are seen as changes in membrane potential. Electrophysiological responses are recorded at room temperature in modified minimal hemolymph-like solution2 (HL3) that contains 5 mM Mg2+ and 1.5 mM Ca2+. Changes in the amplitude of evoked EJP&#8217;s can indicate differences in synaptic function and structure. Digitized recordings are analyzed for EJP amplitude, mEJP frequency and amplitude, and quantal content.

Here we describe electrophysiological methods for measuring synaptic transmission at the neuromuscular junction of Drosophila larva. Evoked release is initiated artificially by stimulating the motor neuron axons, and transmission through the NMJ can be measured by the postsynaptic response evoked in the muscle.

الكهربية طرق تسجيل الإمكانيات متشابك من يرقات ذبابة الفاكهة من NMJ

In this video, we describe the electrophysiological methods for recording synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila larva. ...

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. Whole-cell patch-clamp techniques can then be employed to record from individually-identifiable neurons and somatic muscles. These recording configurations have been used to track the appearance and maturation of ionic currents and action potential propagation in both neurons and muscles. Genetic mutants affecting these electrical properties have been characterized to reveal the molecular composition of ion channels and associated signaling complexes, and to begin exploration of the molecular mechanisms of functional differentiation. A particular focus has been the assembly of synaptic connections, both in the central nervous system and periphery. The glutamatergic neuromuscular junction (NMJ) is most accessible to a combination of optical imaging and electrophysiological recording. A glass suction electrode is used to stimulate the peripheral nerve, with excitatory junction current (EJC) recordings made in the voltage-clamped muscle. This recording configuration has been used to chart the functional differentiation of the synapse, and track the appearance and maturation of presynaptic glutamate release properties. In addition, postsynaptic properties can be assayed independently via iontophoretic or pressure application of glutamate directly to the muscle surface, to measure the appearance and maturation of the glutamate receptor fields. Thus, both pre- and postsynaptic elements can be monitored separately or in combination during embryonic synaptogenesis. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Electrophysiological recordings from Drosophila embryos allow analyses of developing muscle and neuron electrical properties, as well as characterization of functional synaptogenesis at the glutamatergic neuromuscular junction and central cholinergic and GABAergic synapses.

الكهربية في تسجيل ذبابة الفاكهة الأجنة

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

إعداد الأجنة المجهري للإلكترون من ذبابة الفاكهة أنبوب القلب الجنينية

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

داخل الجسم الحي الطرد المركزي الجنين ذبابة الفاكهة

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current techniques used to view such processes are somewhat limited. The following protocol describes a new technique for mounting fixed and labeled Drosophila embryos for coronal viewing with confocal imaging. This method consists of embedding embryos between two layers of glycerin jelly mounting media, and imaging jelly strips positioned upright. The first step for sandwiching the embryos is to make a thin bedding of glycerin jelly on a slide. Next, embryos are carefully aligned on this surface and covered with a second layer of jelly. After the second layer is solidified, strips of jelly are cut and flipped upright for imaging. Alternatives are described for visualizing the embryos depending upon the type of microscope stand to be used. Since all cells along the dorsal-ventral axis are imaged within a single confocal Z-plane, our method allows precise measurement and comparison of fluorescent signals without photobleaching or light scattering common to 3D reconstructions of longitudinally mounted embryos.

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Here we present a mounting protocol for stained Drosophila embryos in an upright position that allows imaging of cross-sections using Confocal microscopy.

تستقيم تصوير ذبابة الفاكهة الأجنة

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) is a ubiquitous research strategy. HEK-293T cells must be plated onto glass coverslips at low enough density so that they are not in contact with each other in order to allow for electrophysiological recording without confounding effects due to contact with adjacent cells. Transfected channels must also express with high efficiency at the plasma membrane for whole-cell patch clamp recording of detectable currents above noise levels. Heterologous ion channels often require long incubation periods at 28&deg;C after transfection in order to achieve adequate membrane expression, but there are increasing losses of cell-coverslip adhesion and membrane stability at this temperature. To circumvent this problem, we developed an optimized strategy to transfect and plate HEK-293T cells. This method requires that cells be transfected at a relatively high confluency, and incubated at 28&deg;C for varying incubation periods post-transfection to allow for adequate ion channel protein expression. Transfected cells are then plated onto glass coverslips and incubated at 37&deg;C for several hours, which allows for rigid cell attachment to the coverslips and membrane restabilization. Cells can be recorded shortly after plating, or can be transferred to 28&deg;C for further incubation. We find that the initial incubation at 28&deg;C, after transfection but before plating, is key for the efficient expression of heterologous ion channels that normally do not express well at the plasma membrane. Positively transfected, cultured cells are identified by co-expressed eGFP or eGFP expressed from a bicistronic vector (e.g. pIRES2-EGFP) containing the recombinant ion channel cDNA just upstream of an internal ribosome entry site and an eGFP coding sequence. Whole-cell patch clamp recording requires specialized equipment, plus the crafting of polished recording electrodes and L-shaped ground electrodes from borosilicate glass. Drug delivery to study the pharmacology of ion channels can be achieved by directly micropipetting drugs into the recording dish, or by using microperfusion or gravity flow systems that produce uninterrupted streams of drug solution over recorded cells.

Reliable method for highly efficient in vitro expression and subsequent electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T).

الاستراتيجية الأمثل للتعبير وترنسفكأيشن تسجيل الكهربية المؤتلف من القنوات ايون الجهد بوابات - 293T كلوة الجنين البشري في خلايا

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

العزلة وتنقية كينيسين من ذبابة الفاكهة الأجنة

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, cell differentiation and organogenesis 1. Correct preparation of the experimental samples is a crucial, often neglected, step. The goal of preparation is to ensure physiological relevance and to establish optimal imaging conditions. To maintain tissue viability, it is critical to avoid dehydration, hypoxia, overheating or medium deterioration 2. 
 The Drosophila egg chamber is a well established system for examining questions relating, but not limited, to body patterning, mRNA localization and cytoskeletal organization 3,4. For early- and mid-stage egg chambers, mounting in halocarbon oil is good for survival in that it allows free diffusion of oxygen, prevents dehydration and hypoxia and has superb optical properties for microscopy. Imaging of fluorescent proteins is possible through the introduction of transgenes into the egg chamber or physical injection of labeled RNA, protein or antibodies 5-7. For example, addition of MS2 constructs to the genome of animals enables real time observation of mRNAs in the oocyte 8. These constructs allow for in vivo labeling of mRNA through utilization of the MS2 bacteriophage RNA stem loop interaction with its coat protein 9. 
 Here, we present a protocol for the extraction of ovaries as well as isolating individual ovarioles and egg chambers from the female Drosophila. For a detailed description of Drosophila oogenesis see Allan C. Spradling (1993, reprinted 2009) 10.

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

The Drosophila egg chamber is an excellent model for studying the mechanisms of mRNA localization. In order to capture the dynamic events that underpin the processes of localization, rapid high resolution imaging of live tissue is required. Here, we present a protocol for dissection and imaging of live samples with minimal disruption.

إعداد فردية ذبابة الفاكهة البيض غرف للتصوير لايف

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, ...

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle microtubules to prevent anaphase onset until the chromosomes are properly connected. Cells use this mechanism to prevent aneuploidy or genomic instability, and hence cancers and other human diseases like birth defects and Alzheimer's1. A number of the SAC components such as Mad1, Mad2, Bub1, BubR1, Bub3, Mps1, Zw10, Rod and Aurora B kinase have been identified and they are all kinetochore dynamic proteins2. Evidence suggests that the kinetochore is where the SAC signal is initiated. The SAC prime regulatory target is Cdc20. Cdc20 is one of the essential APC/C (Anaphase Promoting Complex or Cyclosome) activators3 and is also a kinetochore dynamic protein4-6. When activated, the SAC inhibits the activity of the APC/C to prevent the destruction of two key substrates, cyclin B and securin, thereby preventing the metaphase to anaphase transition7,8. Exactly how the SAC signal is initiated and assembled on the kinetochores and relayed onto the APC/C to inhibit its function still remains elusive.
Drosophila is an extremely tractable experimental system; a much simpler and better-understood organism compared to the human but one that shares fundamental processes in common. It is, perhaps, one of the best organisms to use for bio-imaging studies in living cells, especially for visualization of the mitotic events in space and time, as the early embryo goes through 13 rapid nuclear division cycles synchronously (8-10 minutes for each cycle at 25 &deg;C) and gradually organizes the nuclei in a single monolayer just underneath the cortex9.
Here, I present a bio-imaging method using transgenic Drosophila expressing GFP (Green Fluorescent Protein) or its variant-targeted proteins of interest and a Leica TCS SP2 confocal laser scanning microscope system to study the SAC function in flies, by showing images of GFP fusion proteins of some of the SAC components, Cdc20 and Mad2, as the example.

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The kinetochore is where the SAC initiates its signal monitoring the mitotic segregation of the sister chromatids. A method is described to visualize the recruitment and turnover of one of the kinetochore proteins and its coordination with the chromosome motion in Drosophila embryos using a Leica laser scanning confocal system.