معتمد من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح كيلوبايت GM54544.

الجزء 1 : الأجهزة والمعدات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مطلوب مجهر تشريح جيد للتشريح الجنين ؛ يقترح التكبير 40X ، مع قطع العين 25X الحد الأقصى لزيادة التكبير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مطلوبة ملقط غرامة (رقم 5) لاختيار دليل للأجنة وأجنة devitellinization. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مطلوب معدات لصنع الزجاج وتعديل الإبر الدقيقة. مطلوبة انسحبت من الزجاج الإبر للتشريح. نحن نفضل الزجاج صلبا للتشريح (تستمر لفترة أطول) ، ولكن معيار أنابيب زجاجية سميكة الجدران (1-1،5 ملم القطر الخارجي) يعمل كذلك. بعض الناس استخدام الإبر التنغستن غرامة ، بالكهرباء إلى الحدة المطلوبة في حمام من هيدروكسيد الصوديوم 1M باستخدام 10 أمبير + autotransformer البطارية. الإبر التنغستن شحذ تشريح لها فائدة أنها مرنة نسبيا وطويل الأمد. وترد الإبر الزجاج جوفاء (مشابهة لتشكيل أقطاب التصحيح المشبك) لأنابيب البلاستيك وتستخدم أثناء تشريح لشفط وطرد من المياه المالحة ، وكذلك التسليم المراقب من الغراء. مجموعة متنوعة من الزجاج جر تتوفر لتصنيع الزجاج الإبر. يمكن للكمبيوتر أن تكون مبرمجة مسبقا جر لسحب مجموعة متنوعة من الأشكال والأحجام. وبراون يلهب النماذج (سوتر الصك شركاه) هي المفضلة على نطاق واسع. وينبغي أن يكون مجمع المجهر (40X 20 هدف) سيكون متاحا لفحص وتعديل كهربائي قبل استخدامه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويشيع استخدام نوعين من الحلول لحمام الأنسجة الجنينية أثناء تشريح : 1) &quot;قياسية&quot; (جان وجان ، 1976a) أو &quot;تعديل المعيار&quot; (Broadie ، 2000) ملاحات ، على أساس الحلول شيوعا للتسجيل في النظم الأخرى اللافقارية ، و 2) &quot;الدموي مثل&quot; (HL) ملاحات (ستيوارت وآخرون 1994) ، حلا وسطا بين المالحة القياسية وقياس التركيزات الأيونية الدموي في ذبابة الفاكهة. تجدر الإشارة إلى أن أيا من هذه ملاحات تحاكي بدقة التركيب الكيميائي للالدموي في الجسم الحي (Broadie ، 2000). يتضمن معيار المالحة (مم) : 135 كلوريد الصوديوم ، 5 بوكل ، 4 MgCl 2 و 1.8 CaCl 2 ، 72 السكروز ، 5 TES ، ودرجة الحموضة 7،2. المجربون قد ترغب أيضا في النظر في إعداد تجاريا المالحة الحشرات (وسائل الإعلام مثل شنايدر الحشرات) ، وهو غير مناسب للتسجيل الكهربية ولكن على الأرجح لحماية صحة الأنسجة المكشوفة. </li></ol> الجزء 2 : التدريج الأجنة والتشريح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لجمع البيض الأمثل ، والحفاظ على الشباب (&lt;7 أيام) ، ذكور الذباب صحية والإناث (20-40) على أواني زرع الطازجة لمدة 2-3 أيام. أواني زرع تتألف في العادة من الأكواب البلاستيكية 100 مل (ثلاثي صب) مثقبة لتوفير ما يكفي من دوران الهواء ، وتغطي لوحة آغار 60 مم. لوحات تحتوي على أجار التفاح أو عصير العنب مع تصلب آغار. عدة وصفات موجودة ، ولكن هو مثال واحد على النحو التالي : 700 مليلتر من الماء ، 25-30 آغار غراما ، و 300 مل من عصير (العنب أو التفاح) ، 0.5g البارابين الميثيل (ف hydroxymethylbenzoate) ، والسكر 30G. الأوتوكلاف الماء وآغار ، وتغلي بشكل منفصل ف hydroxymethylbenzoate مع السكر وعصير. مزيج من عصير آغار والحلول وتصب بسرعة الى 60 ملم لوحات ، وإزالة الفقاعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل جمع البيض ، ويتم تغذية الذباب مع لصق الخميرة (7 جرام خميرة بيكر في 9 مل من المياه المخزنة في 4 درجات مئوية) على لوحات جديدة ، تغير ما لا يقل عن مرتين في اليوم لمدة يومين على الاقل. قبل 3 أيام ، يجب أن يكون وعاء جيد إنتاج البيض 100-200 للساعة الواحدة. وقد لوحظ أفضل وضع البيض في وعاء حافظ على جانبها مع آغار في لوحة خدش. وسيتم وضع العديد من الأجنة في أو بالقرب من الخدوش. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لجمع أعداد كبيرة من الأجنة ، ونقل الأجنة بلطف من لوحة أجار في سلة باستخدام فرشاة الرسم. ويمكن إجراء سلة مع أنبوب الطرد المركزي 15 أو 50 مل. قطع الجزء السفلي ترك مساحة كافية للاعتراض على شاشة (70 ميكرومتر شبكة) بين الغطاء والجزء العلوي من الأنبوب. شطف الأجنة مع DH 2 0 وضعت في طبق بتري من المبيض بنسبة 50 ٪ الى 100 ​​٪ جديدة لإزالة المشيماء الخارجي. بدلا من ذلك ، يمكن جمع البيض بشكل فردي باستخدام الملقط غرامة ، وdechorionated عن طريق وضعها يدويا في قطرة من التبييض. يمكن اجتثاث chorionation تتخذ من أكثر من 30 ثانية إلى 2 دقيقة (التبييض الطازجة أسرع بكثير) ، وينبغي رصدها تحت مجهر تشريح. إزالة المشيماء يعرض لامعة ، والغشاء المحي شفافة. وينبغي أن البيض Dechorionated تشطف ، أو وضعها في المياه المالحة ، والتبييض يدمر الأنسجة devitellinized بسرعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فمن الأهمية بمكان أن مرحلة الأجنة بعناية حتى سن التنموية المنشودة. في المراحل الجنينية تعريف ذبابة الفاكهة (17/01 ؛ كامبوس اورتيغا وHartenstein ، 1985) ليست مفيدة ، وتطوير جميع الوظيفية العصبية والعضلية يحدث في مرحلة متأخرة 16 أو 17 مرحلة. وبالتالي ، فإن قام قبل ساعات التنموية الأجنة عند 25 درجة مئوية في حاضنة مرطب ، في ساعات بعد الإخصاب أو ، وهو الأكثر شيوعا ، وبعد وضع البيض (AEL). في ظل هذه الظروف ، تخلق يدوم 21 + / -- 1 ساعة عند 25 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البيض من وضع البيض توقيت (1-2 ساعةوينظر المقبل) التي تتراوح أعمارهم مناسب لمعايير شكلية. بعد الغسيل واسعة في DH 2 O ، يتم وضع البيض في صحن dechorionated ثقافة البلاستيك (تحت O 2 درهم) للعرض. ويمكن التأكد من التدريج الصحيح مع المعايير المورفولوجية باستخدام الضوء المنعكس مع مجهر تشريح (كامبوس وHartenstein أورتيغا ، 1985). من المسلم به عموما تنضج في وقت متأخر من مرحلة الأجنة (22 - 24H AEL) على وشك الفقس عن طريق تجزئة للبشرة والقصبة الهوائية المتضخمة. ويمكن أيضا استخدام الأجنة يكون genotyped GFP موازنات ومضان المجهر تشريح مع الفلاتر المناسبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتشريح والأجنة ونظموا dechorionated تنمويا المرفقة (الجانب الظهري متابعة) على ساترة تحت قطرة من المياه المالحة (انظر الخطوة 1.5). تتم إزالة غشاء الأجنة من المحي بواسطة ثقب الغشاء قرب نهاية الأمامي أو الخلفي مع micropipette الزجاج أو إبرة التنغستن ، ومن ثم تحرير بلطف الجنين من الغشاء. استعدادا للتشريح ، ينبغي وضع الجنين على ساترة ليصل السطح الظهري (الجانب الظهرية يصل تشريح سيعرض النظام العصبي وبطني neuromusculature للتجارب ، ولكن من الواضح أن يكون وضع الجنين في طرق أخرى لتسهيل الحصول على أخرى الأنسجة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأجنة مرحلة مبكرة (&lt;16 ساعة AEL) نعلق مباشرة لتنظيف الزجاج أو الزجاج المطلي مع متعدد الليزين (بولي - L - يسين هيدروبروميد ؛ Broadie وباتي ، 1993a ، ب). يجب أن يكون لاصق الأجنة كبار السن (&gt; 16 ساعة AEL) ، في أعقاب تشكيل إهاب ، مثالي لcoverslips (داو كورننغ) Sylgard المغلفة. ويتم استخدام المياه البلمرة cyanoacrylate الغراء الجراحية أو البيطرية (Broadie وباتي ، 1993c ، د). يتم تسليم الغراء من خلال ماصة زجاج كهربائي صغير (10-20 ميكرون غيض القطر الداخلي) موصولة إلى أنبوب المطاط مع تدفق الغراء التي تسيطر عليها ضغط الفم. يجب توخي الحذر أثناء الولادة الغراء ، والصمغ polymerizes بسرعة عند الاتصال المالحة. نلاحظ أيضا أنه لا يمكن إجراء الإلتصاق في المياه المالحة أو منخفضة مع عدم وجود تركيزات أيون ثنائي التكافؤ ، كما يتطلب الغراء أيونات ثنائي التكافؤ لتبلمر. واستخدم لأول مرة بكميات صغيرة من الغراء تعلق بحزم الرأس والذيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حالما يتم لصقها ينتهي من الجنين الى ساترة ، يتم إجراء شق على طول خط الوسط الظهرية مع القطب الزجاج أو شحذ إبرة التنغستن. يرصد هذا أسهل من خلال ثقب بلطف خط شق قبل اتخاذ خفض النهائي. وترد ثم الجانبين من شق إلى ساترة مع أكثر الغراء ، لنشر بلطف الشقة الجنين. الأعضاء الداخلية بما في ذلك في الأمعاء ، والهيئات والدهون ، اختياريا ، ثم تتم إزالة القصبة الهوائية عن طريق الشفط باستخدام ماصة الزجاج المرفقة أنابيب مطاطية (Broadie وباتي 1993a ، ج). وينبغي الآن أن يرفق الجنين شقة للساترة ، البشرة أسفل بطني مع نظام العصبي المركزي والأعصاب الطرفية ، وعضلات جسدية تتعرض للتجريب. </li></ol>

التدريج الدقيق للأجنة غير الحاسمة نظرا لنضوج السريع للخصائص الفنية على مدار الساعة لعدة ساعات فقط. العديد من القضايا من تعقيد هذا التدريج. أولا ، معظم الباحثين استخدام بويضة لأجنة يضع توقيت المرحلة ، ولكن في المرة البيض يمكن أن تتفاوت كثيرا من الحيوان إلى الحيوان في ...

<table><tbody><tr><td>Embryo Collection Cages</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-100 (for 60 mm dish; other sizes available)</td><td>Cages can also be home made using punctured tri-pour beakers, as shown in video</td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>Available from various companies</td><td>Surgical glue adheres better to sylgard-coated coverslips</td></tr><tr><td>Fine glass tubing, outer diameter 1.0-1.5 mm</td><td>Various</td><td></td><td>For pulling into fine glass needles for dissection and tubes for glue delivery</td></tr><tr><td>Plastic tubing, to attach to glass pipette for mouth suction and glue application</td><td>Tygon</td><td></td><td>Tubing inner diameter needs to match glass outer diameter.</td></tr></tbody></table>

harvesting and preparing drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures

ذبابة الفاكهة نموذجا رئيس الوزراء الجينية لدراسة كل من التطور الجنيني وعلم الأعصاب وظيفية. تقليديا ، لا بأس هذه الحقول المعزولة عن بعضها البعض ، مع تواريخ مستقلة إلى حد كبير والمجتمعات العلمية. ومع ذلك ، فإن التفاعل بين هذه المجالات المتباينة عادة البرامج التنموية الكامنة وراء اكتساب الخصائص الكهربائية وتمايز وظيفي الإشارات الكيميائية من نقاط الاشتباك العصبي وظيفية خلال المراحل النهائية لتشكيل الدوائر العصبية. هذه الواجهة هي منطقة ذات أهمية حاسمة للتحقيق فيها. في ذبابة الفاكهة ، وهذه مراحل التطوير الوظيفي يحدث خلال الفترة من 8 ساعات &lt;(عند درجة 25) خلال الثلث الأخير من مرحلة التطور الجنيني. واعتبر هذه الفترة الطويلة في وقت متأخر نظرا لالتنموية المستعصية التحقيق إلى ترسب من إهاب صعبة ، والبشرة غير منفذة. وكان مقدما اختراق تطبيق المياه البلمرة الغراء الجراحية التي يمكن تطبيقها محليا لإهاب لتمكين تشريح للرقابة في وقت متأخر من مرحلة الأجنة. مع شق طولي ظهري ، يمكن وضع الجنين شقة ، وكشف الحبل البطني العصب وعضلات الجسم الحائط لتحقيق التجريبية. وقد تم استخدام هذا النظام بشكل كبير لعزل وتوصيف طفرات جينية الجنينية التي تعوق تشكيل المشبك ، وبالتالي تكشف عن الآليات الجزيئية التي تحكم مواصفات وتمايز الاتصالات المشبك والوظيفية خصائص متشابك الإشارة.

Watch this Scientific Journal Video about Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures at JoVE.com

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

هذا الأسلوب يعرض neuromusculature الجنينية لذبابة الفاكهة المناعية أو تسجيل الكهربية. ومن المفيد لدراسة الأحداث المبكرة في التنمية العصبية والعضلية أو أداء الكهربية في المسوخ التي لا يفقس.

الحصاد وإعداد ذبابة الفاكهة الأجنة لتسجيل الكهربية وغيرها من الإجراءات

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

harvesting-preparing-drosophila-embryos-for-electrophysiological

Research

JoVE Journal

Biology

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

13.3K Views.  University of Illinois. هذا الأسلوب يعرض neuromusculature الجنينية لذبابة الفاكهة المناعية أو تسجيل الكهربية. ومن المفيد لدراسة الأحداث المبكرة في التنمية العصبية والعضلية أو أداء الكهربية في المسوخ التي لا يفقس.

Video: Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

التحضير للثقافات متعلق بالخلايا العصبية من أجنة ذبابة الفاكهة المرحلة Midgastrula

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a protocol for performing the chromatin conformation capture technique in situ Hi-C on staged Drosophila melanogaster embryo populations. The result is a sequencing library that allows the mapping of all chromatin interactions that occur in the nucleus in a single experiment. Embryo sorting is done manually using a fluorescent stereo microscope and a transgenic fly line containing a nuclear marker. Using this technique, embryo populations from each nuclear division cycle, and with defined cell cycle status, can be obtained with very high purity. The protocol may also be adapted to sort older embryos beyond gastrulation. Sorted embryos are used as inputs for in situ Hi-C. All experiments, including sequencing library preparation, can be completed in five days. The protocol has low input requirements and works reliably using 20 blastoderm stage embryos as input material. The end result is a sequencing library for next generation sequencing. After sequencing, the data can be processed into genome-wide chromatin interaction maps that can be analyzed using a wide range of available tools to gain information about topologically associating domain (TAD) structure, chromatin loops, and chromatin compartments during Drosophila development.

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

This work describes a protocol for the generation of high resolution in situ Hi-C libraries from tightly staged pre-gastrulation Drosophila melanogaster embryos.

جيل من الكروماتين على نطاق الجينوم تكيف التقاط المكتبات من الأجنة المورفولوجية محكم نظموا في وقت مبكر

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Genetics

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, organism development, and disease. It is often desirable to obtain PPI information using in vivo material, to gain the most natural and unbiased view of the interaction networks. The fruit fly Drosophila melanogaster is an excellent platform to study PPIs in vivo, and lends itself to straightforward approaches to isolating material for biochemical experiments. In particular, fruit fly embryos represent a convenient type of tissue to study PPIs, due to the ease of collecting animals at this developmental stage and the fact that the majority of proteins are expressed in embryogenesis, thus providing a relevant environment to reveal most PPIs. Here we present a protocol for collection of Drosophila embryos at medium scale (0.5-1 g), which is an ideal amount for a wide range of proteomic applications, including analysis of PPIs by affinity purification-mass spectrometry (AP-MS). We describe our designs for 1 L and 5 L cages for embryo collections that can be easily and inexpensively set up in any laboratory. We also provide a general protocol for embryo collection and protein extraction to generate lysates that can be directly used in downstream applications such as AP-MS. Our goal is to provide an accessible means for all researchers to carry out the analyses of PPIs in vivo.

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

The goal of this protocol is to provide a straightforward and inexpensive approach to collecting Drosophila embryos at medium scale (0.5-1 g) and preparing protein extracts that can be used in downstream proteomic applications, such as affinity purification-mass spectrometry (AP-MS).

إعداد على نطاق متوسط ​​من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; مقتطفات الجنين للتجارب بروتيوميك

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, ...

Developmental Biology

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

لإعداد ذبابة الفاكهة الأجنة لايف التصوير باستخدام بروتوكول إسقاط الشنق

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. Whole-cell patch-clamp techniques can then be employed to record from individually-identifiable neurons and somatic muscles. These recording configurations have been used to track the appearance and maturation of ionic currents and action potential propagation in both neurons and muscles. Genetic mutants affecting these electrical properties have been characterized to reveal the molecular composition of ion channels and associated signaling complexes, and to begin exploration of the molecular mechanisms of functional differentiation. A particular focus has been the assembly of synaptic connections, both in the central nervous system and periphery. The glutamatergic neuromuscular junction (NMJ) is most accessible to a combination of optical imaging and electrophysiological recording. A glass suction electrode is used to stimulate the peripheral nerve, with excitatory junction current (EJC) recordings made in the voltage-clamped muscle. This recording configuration has been used to chart the functional differentiation of the synapse, and track the appearance and maturation of presynaptic glutamate release properties. In addition, postsynaptic properties can be assayed independently via iontophoretic or pressure application of glutamate directly to the muscle surface, to measure the appearance and maturation of the glutamate receptor fields. Thus, both pre- and postsynaptic elements can be monitored separately or in combination during embryonic synaptogenesis. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Electrophysiological recordings from Drosophila embryos allow analyses of developing muscle and neuron electrical properties, as well as characterization of functional synaptogenesis at the glutamatergic neuromuscular junction and central cholinergic and GABAergic synapses.

الكهربية في تسجيل ذبابة الفاكهة الأجنة

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an embryonic fillet preparation by a microinjector. Each motor neuron whose membrane is contacted by the droplet can then be rapidly labeled. Individual motor neurons are continuously labeled, enabling fine structural details to be clearly visualized. Given that lipophilic dyes come in various colors, the technique also provides a means to get adjacent neurons labeled in multicolor. This tracing technique is therefore useful for studying neuronal morphogenesis and synaptic connectivity in the motor neuron system of Drosophila.

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a method for retrograde tracing of the Drosophila embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes.

التتبع العكسي للخلايا العصبية للمحركات الجنينية باستخدام الاصباغ الفلورية الليبوهيلليك

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...

Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer

Modern approaches in quantitative live cell imaging have become an essential tool for exploring cell biology, by enabling the use of statistics and computational modeling to classify and compare biological processes. Although cell culture model systems are great for high content imaging, high throughput studies of cell morphology suggest that ex vivo cultures are limited in recapitulating the morphological complexity found in cells within living organisms. As such, there is a need for a scalable high throughput model system to image living cells within an intact organism. Described here is a protocol for using a high content image analyzer to simultaneously acquire multiple time-lapse videos of embryonic Drosophila melanogaster development during the syncytial blastoderm stage. The syncytial blastoderm has traditionally served as a great in vivo model for imaging biological events; however, obtaining a significant number of experimental replicates for quantitative and high-throughput approaches has been labor intensive and limited by the imaging of a single embryo per experimental repeat. Presented here is a method to adapt imaging and microinjection approaches to suit a high content imaging system, or any inverted microscope capable of automated multipoint acquisition. This approach enables the simultaneous acquisition of 6-12 embryos, depending on desired acquisition factors, within a single imaging session.

Presented here is a protocol to microinject and simultaneously image multiple Drosophila embryos during embryonic development using a plate-based, high content imager.

Drosophila إعداد الجنين و Microinjection لالمجهر الخلية لايف تنفيذها باستخدام محلل المحتوى العالي الآلي

Modern approaches in quantitative live cell imaging have become an essential tool for exploring cell biology, by enabling the use of statistics and ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

الخلية الأولية من الثقافات ذبابة الفاكهة الأجنة المعيدة

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

تثبيط البصريات الوراثية لانقباض أكتوميوسين بوساطة Rho1 في ذبابة الفاكهة

Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos

Contractile forces generated by actin and non-muscle myosin II ("actomyosin contractility") are critical for morphological changes of cells and tissues at multiple length scales, such as cell division, cell migration, epithelial folding, and branching morphogenesis. An in-depth understanding of the role of actomyosin contractility in morphogenesis requires approaches that allow the rapid inactivation of actomyosin, which is difficult to achieve using conventional genetic or pharmacological approaches. The presented protocol demonstrates the use of a CRY2-CIBN based optogenetic dimerization system, Opto-Rho1DN, to inhibit actomyosin contractility in Drosophila embryos with precise temporal and spatial controls. In this system, CRY2 is fused to the dominant negative form of Rho1 (Rho1DN), whereas CIBN is anchored to the plasma membrane. Blue light-mediated dimerization of CRY2 and CIBN results in rapid translocation of Rho1DN from the cytoplasm to the plasma membrane, where it inactivates actomyosin by inhibiting endogenous Rho1. In addition, this article presents a detailed protocol for coupling Opto-Rho1DN-mediated inactivation of actomyosin with laser ablation to investigate the role of actomyosin in generating epithelial tension during Drosophila ventral furrow formation. This protocol can be applied to many other morphological processes that involve actomyosin contractility in Drosophila embryos with minimal modifications. Overall, this optogenetic tool is a powerful approach to dissect the function of actomyosin contractility in controlling tissue mechanics during dynamic tissue remodeling.

تسليط الضوء على المؤلف: تثبيط البصريات الوراثية لانقباض الأكتوميوسين بوساطة Rho1 إلى جانب قياس التوتر الظهاري في أجنة ذبابة الفاكهة  

Actomyosin contractility plays an important role in cell and tissue morphogenesis. However, it is challenging to manipulate actomyosin contractility in vivo acutely. This protocol describes an optogenetic system that rapidly inhibits Rho1-mediated actomyosin contractility in Drosophila embryos, revealing the immediate loss of epithelial tension after the inactivation of actomyosin in vivo.

تثبيط البصريات الوراثية لانقباض أكتوميوسين بوساطة Rho1 إلى جانب قياس التوتر الظهاري في أجنة ذبابة الفاكهة

Contractile forces generated by actin and non-muscle myosin II ("actomyosin contractility") are critical for morphological changes of cells and tissues at ...

الحصاد وإعداد ذبابة الفاكهة الأجنة لتسجيل الكهربية وغيرها من الإجراءات

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

التحضير للثقافات متعلق بالخلايا العصبية من أجنة ذبابة الفاكهة المرحلة Midgastrula

جيل من الكروماتين على نطاق الجينوم تكيف التقاط المكتبات من الأجنة المورفولوجية محكم نظموا في وقت مبكر

إعداد على نطاق متوسط من

لإعداد ذبابة الفاكهة الأجنة لايف التصوير باستخدام بروتوكول إسقاط الشنق

الكهربية في تسجيل ذبابة الفاكهة الأجنة

التتبع العكسي للخلايا العصبية للمحركات الجنينية باستخدام الاصباغ الفلورية الليبوهيلليك

Drosophila إعداد الجنين و Microinjection لالمجهر الخلية لايف تنفيذها باستخدام محلل المحتوى العالي الآلي

الخلية الأولية من الثقافات ذبابة الفاكهة الأجنة المعيدة

تثبيط البصريات الوراثية لانقباض أكتوميوسين بوساطة Rho1 إلى جانب قياس التوتر الظهاري في أجنة ذبابة الفاكهة

تثبيط البصريات الوراثية لانقباض أكتوميوسين بوساطة Rho1 إلى جانب قياس التوتر الظهاري في أجنة ذبابة الفاكهة

الحصاد وإعداد ذبابة الفاكهة الأجنة لتسجيل الكهربية وغيرها من الإجراءات

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

التحضير للثقافات متعلق بالخلايا العصبية من أجنة ذبابة الفاكهة المرحلة Midgastrula

جيل من الكروماتين على نطاق الجينوم تكيف التقاط المكتبات من الأجنة المورفولوجية محكم نظموا في وقت مبكر

إعداد على نطاق متوسط ​​من

لإعداد ذبابة الفاكهة الأجنة لايف التصوير باستخدام بروتوكول إسقاط الشنق

الكهربية في تسجيل ذبابة الفاكهة الأجنة

التتبع العكسي للخلايا العصبية للمحركات الجنينية باستخدام الاصباغ الفلورية الليبوهيلليك

Drosophila إعداد الجنين و Microinjection لالمجهر الخلية لايف تنفيذها باستخدام محلل المحتوى العالي الآلي

الخلية الأولية من الثقافات ذبابة الفاكهة الأجنة المعيدة

تثبيط البصريات الوراثية لانقباض أكتوميوسين بوساطة Rho1 إلى جانب قياس التوتر الظهاري في أجنة ذبابة الفاكهة

تثبيط البصريات الوراثية لانقباض أكتوميوسين بوساطة Rho1 إلى جانب قياس التوتر الظهاري في أجنة ذبابة الفاكهة

إعداد على نطاق متوسط من