KB הוא נתמך על ידי NIH מענק GM54544.

חלק 1: ציוד ואספקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרוסקופ לנתיחה טוב נדרש והניתוחים העובר; הגדלה 40X הוא הציע, עם עיניים חתיכות 25X כדי להגדיל הגדלה מקסימלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלקחיים פיין (מספר 5) נדרשים עבור בחירה ידנית של עוברים devitellinization של עוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציוד ליצור ולשנות מחטים זכוכית עדין נדרשת. משך זכוכית מחטים נדרשים עבור הניתוח. אנחנו מעדיפים זכוכית מוצקה לנתיחה (האחרון יותר), אבל צינורות תקן קירות זכוכית עבה (קוטר חיצוני 1-1.5 מ&quot;מ) עובד גם כן. כמה אנשים משתמשים במחטים טונגסטן בסדר, electrolyzed כדי החדות הרצוי באמבט של 1M NaOH באמצעות סוללה 10 + Amp autotransformer. חידד לנתיחה מחטים טונגסטן נהנים כי הם עמידים יחסית לטווח ארוך. מחטים זכוכית חלולים (בדומה נוצר כתם אלקטרודות מהדק) מחוברים צינורות פלסטיק המשמשים במהלך לנתיחה עבור יניקה גירוש מלוחים, כמו גם במסירה מבוקרת של דבק. מגוון מושכי זכוכית זמינים עבור ייצור זכוכית מחטים. המחשב מתוכנתים מראש מושכי ניתן למשוך מגוון רחב של צורות וגדלים. בראון-Flaming מודלים (סאטר Instrument ושות) הם העדיפו נרחב. מיקרוסקופ המתחם (20-40X המטרה) צריכים להיות זמינים כדי לבדוק ולשנות אלקטרודות לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שני סוגים של פתרונות נפוצים אמבטיה הרקמות עובריים במהלך דיסקציה: 1) &quot;רגילה&quot; (יאן יאן, 1976a) או &quot;תקן שונה&quot; (Broadie, 2000) salines, המבוססת על פתרונות נפוץ במערכות הקלטה חוליות אחרים , ו 2) &quot;haemolymph דמוי&quot; (HL) salines (סטיוארט et al 1994), פשרה בין מלח רגיל הריכוזים יוניים נמדד haemolymph תסיסנית. יצוין, כי אף אחד salines אלה לחקות במדויק את ההרכב הכימי של haemolymph in vivo (Broadie, 2000). התקן מכיל מלח (מ&quot;מ): 135 NaCl, KCl 5, 4 MgCl 2, 1.8 CaCl 2, 72 סוכרוז, 5 TES, pH 7.2. הניסויים מומלץ גם לשקול מלוחים חרקים מוכן מסחרית (Media חרקים למשל של שניידר), אשר אינו מתאים הקלטה אלקטרו אבל הסיכוי הטוב ביותר להגן על בריאות רקמות חשוף. </li></ol> חלק 2: קביעת העובר Dissection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור אוסף ביצה אופטימלי, לשמור על הצעירים (&lt;7 ימים), זכר בריא זבובים הנקבה (20-40) על סירים הנחת טרי במשך 2-3 ימים. סירים הנחת כלל מורכב 100 מ&quot;ל כוסות פלסטיק (Tri-יוצקים) מחורר כדי לספק זרימת אוויר נאותה, המשתרעים על צלחת אגר 60 מ&quot;מ. צלחות אגר להכיל תפוחים או מיץ ענבים מוקשה עם אגר. קיימים מספר מתכונים, אך דוגמה אחת היא כדלקמן: 700 מ&quot;ל מים, 25-30 גרם אגר, 300 מ&quot;ל של מיץ להתרכז (ענבים או תפוח), 0.5g מתיל paraben (p-hydroxymethylbenzoate), סוכר 30G. החיטוי המים אגר, ובנפרד לרתיחה p-hydroxymethylbenzoate עם הסוכר ומיץ. מערבבים את אגר פתרונות מיץ במהירות לשפוך לתוך צלחות 60 מ&quot;מ, הסרת בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני איסוף ביצים, זבובים ניזונים עם הדבק שמרים (7 גרם שמרים האופה ב 9 מ&quot;ל מים המאוחסן ב 4 ° C) על צלחות טריים, השתנה לפחות פעמיים ביום במשך לפחות יומיים. ביום 3, סיר טוב צריך לייצר 100-200 ביצים לשעה. הנחת ביצה טובה יותר היא נצפתה על סיר שמרו על צידו עם אגר בצלחת שרוט. עוברים רבים יהיה מונח בתוך או ליד שריטות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאסוף מספר גדול של עוברים, בעדינות העברת עוברים מצלחת אגר לתוך סל באמצעות מכחול. סל יכול להתבצע עם צינור 15 מ&quot;ל או 50 צנטריפוגות. חותכים את תחתית עוזב פני השטח מספיק כדי ללכוד מסך (70 מיקרומטר רשת) בין המכסה העליון של הצינור. שוטפים את העוברים עם DH 2 0 והכניסו בצלחת פטרי של אקונומיקה 50% עד 100% טרי להסיר את סיסית החיצונית. לחלופין, ניתן לאסוף ביצים בנפרד באמצעות מלקחיים בסדר, dechorionated ידי הצבת אותם באופן ידני לתוך ירידה של אקונומיקה. De-chorionation יכול לקחת בין 30 שניות עד 2 דקות (אקונומיקה טרי הוא הרבה יותר מהר), ואת צריכה להיות במעקב תחת מיקרוסקופ לנתיחה. הסרת סיסית חושף את מבריק, שקוף קרום vitelline. ביצים Dechorionated יש לשטוף קצר, או להציב מלוחים, כמו אקונומיקה במהירות הורס רקמות devitellinized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זה קריטי כדי בזהירות בשלב עוברי לגיל ההתפתחותי הרצוי. הגדיר תסיסנית בשלבים עובריים (1-17; קמפוס, אורטגה Hartenstein, 1985) אינם מועילים, כמו כל פיתוח neuromuscular תפקודית מתרחשת בשלב מאוחר או 16 שלב 17. כך, עוברים הם מבוימים על ידי שעות התפתחותי של 25 מעלות צלזיוס חממה humidified, שעות לאחר ההפריה או, בדרך כלל, לאחר הנחת ביצה (AEL). בתנאים אלה, embryogenesis נמשך 21 + / - 1 שעה בשעה 25 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצים מתוזמן הביצה שכבה (1-2 שעותים) כי הם בני כראוי נתפסים הבא קריטריונים מורפולוגיים. אחרי כביסה נרחב DH 2 O, הביצים dechorionated ממוקמות בצלחת תרבות פלסטיק (תחת DH 2 O) לצורך צפייה. בימוי נכון ניתן לאשר קריטריונים מורפולוגיים באמצעות האור המוחזר עם מיקרוסקופ דיסקציה (קמפוס, אורטגה Hartenstein, 1985). בוגר בשלב מאוחר עוברי (22-24h AEL) על סף הבקיעה מוכרים בדרך כלל על ידי פילוח לציפורן, קנה הנשימה מנופח. עוברים יכול להיות גם genotyped באמצעות GFP balancers ו מיקרוסקופ פלואורסצנטי דיסקציה עם מסננים מתאימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור לנתיחה, עוברים dechorionated ו התפתחותית מבוים מחוברים (צד הגב למעלה) על coverslip תחת טיפת מלח (ראה שלב 1.5). עוברים יוסרו מן הקרום vitelline על ידי ניקוב הממברנה סמוך לקצה הקדמי או האחורי עם micropipette כוס או מחט טונגסטן, ולאחר מכן לשחרר בעדינות את העובר מן הממברנה. לקראת לנתיחה, העובר צריך להיות ממוקם על coverslip עם את פני השטח הגבי (צד הגב עד לנתיחה יחשוף את מערכת העצבים ואת הגחון neuromusculature לניסויים. עם זאת, ברור העובר יכול להיות ממוקם בדרכים אחרות כדי להקל את הגישה אחרים רקמות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברים בשלב מוקדם (&lt;16 שעות AEL) לצרף ישירות לנקות זכוכית או זכוכית מצופה polylysine (poly-L-ליזין hydrobromide; Broadie ו בייט, 1993a, b). עוברים מבוגרים יותר (&gt; 16 שעות AEL), לאחר היווצרות לציפורן, חייב להיות דבוק, באופן אידיאלי Sylgard מצופה (Dow Corning) coverslips. דבק מים polymerizing כירורגי או וטרינרי cyanoacrylate משמש (Broadie ו בייט, 1993c, ד). דבק מועברת באמצעות פיפטה אלקטרודה זכוכית קטנה (10-20 קצה הפנימי מיקרומטר קוטר) מחוברת צינורית גומי עם הזרם דבק בשליטת לחץ פה. יש להקפיד במהלך הלידה דבק, כמו דבק polymerizes במהירות על קשר עם מי מלח. שים לב גם כי הדבקה לא יכול להתבצע ללא מלח או נמוך ריכוזי יון divalent, כמו דבק דורש יונים divalent כדי לפלמר. כמויות קטנות של דבק משמשים הראשון בתוקף לצרף את הראש והזנב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר סיום של העובר מודבקות coverslip, מבצעים חתך לאורך קו האמצע הגב עם אלקטרודות זכוכית או מחט טונגסטן חידד. זה נעשה קל יותר בעדינות על ידי ניקוב את קו החתך לפני ביצוע החתך הסופי. הצדדים של החתך מחוברים אז coverslip עם דבק יותר, בעדינות כדי להפיץ את שטוח העובר. איברים פנימיים, כולל המעי, גופים שומן, אופציונלי, קנה הנשימה יוסרו מכן על ידי יניקה בעזרת פיפטה זכוכית המחובר בצינור גומי (Broadie בייט ו 1993a-c). העובר כעת אמור להיות מצורף שטוח coverslip, האפידרמיס למטה עם הגחון מערכת העצבים המרכזית, העצבים ההיקפיים, השרירים ואת סומטיים חשוף לניסויים. </li></ol>

בימוי מדויק של עוברים הוא קריטי עקב ההבשלה המהירה של מאפיינים פונקציונליים במשך תקופה של רק כמה שעות. מספר נושאים לסבך זה הזמני. ראשית, רוב החוקרים להשתמש ביצה מתוזמן מטילה על עוברי הבמה, אבל הפעם ההטלה יכול להשתנות מאוד מן החי חיים בתנאים שונים (Broadie et al. 1992). בפרט, נשים...

<table><tbody><tr><td>Embryo Collection Cages</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-100 (for 60 mm dish; other sizes available)</td><td>Cages can also be home made using punctured tri-pour beakers, as shown in video</td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>Available from various companies</td><td>Surgical glue adheres better to sylgard-coated coverslips</td></tr><tr><td>Fine glass tubing, outer diameter 1.0-1.5 mm</td><td>Various</td><td></td><td>For pulling into fine glass needles for dissection and tubes for glue delivery</td></tr><tr><td>Plastic tubing, to attach to glass pipette for mouth suction and glue application</td><td>Tygon</td><td></td><td>Tubing inner diameter needs to match glass outer diameter.</td></tr></tbody></table>

harvesting and preparing drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures

תסיסנית הוא מודל גנטי המוביל במחקר של פיתוח הן עובריים המוח תפקודית. באופן מסורתי, בתחומים אלה הם די מבודדים אחד מהשני, עם היסטוריה עצמאית במידה רבה קהילות מדעיות. עם זאת, הממשק בין שדות אלה נבדלים בדרך כלל התוכניות התפתחותית תפקודית הבסיסית רכישת נכסים איתות חשמלי הבחנה של סינפסות כימיות תפקודית במהלך השלבים האחרונים של הקמת מעגל עצבי. ממשק זה הוא אזור חשוב ביותר לחקירה. ב תסיסנית, אלה שלבים של התפתחות תפקודי להתרחש בתקופה של &lt;8 שעות (במהירות של 25 ° C) במהלך השליש האחרון של העובר. תקופה זו התפתחותי מאוחר נחשב ארוך סורר אל בשל חקירה בתצהיר של הציפורן, קשה אפידרמיס חדיר. מראש היה פריצת דרך ביישום של דבק מים polymerizing כירורגית כי ניתן להחיל באופן מקומי כדי לאפשר לציפורן לנתיחה מבוקר של עוברים בשלב מאוחר. עם חתך אורכי הגבי, העובר יכול להיות מונח שטוח, חשיפת עצבים בחוט הגחון ועל קיר שרירי הגוף חקירה ניסויית. מערכת זו הייתה בשימוש רב לבודד ולאפיין מוטציות גנטיות הפוגעות במבנה סינפסה העוברית, וכך לגלות את המנגנונים המולקולריים השולטים מפרט והבחנה של קשרים סינפסה ופונקציונלי תכונות האיתות הסינפטי.

Watch this Scientific Journal Video about Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures at JoVE.com

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

טכניקה זו חושפת את neuromusculature עובריים תסיסנית עבור אימונוהיסטוכימיה או הקלטה אלקטרו. זה שימושי לחקר אירועי מוקדם בהתפתחות neuromuscular או ביצוע electrophysiology ב מוטנטים שאינם יכולים לבקוע.

מסיק והכנת תסיסנית עוברים הקלטה אלקטרו ונהלים אחרים

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

harvesting-preparing-drosophila-embryos-for-electrophysiological

Research

JoVE Journal

Biology

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

13.3K Views.  University of Illinois. טכניקה זו חושפת את neuromusculature עובריים תסיסנית עבור אימונוהיסטוכימיה או הקלטה אלקטרו. זה שימושי לחקר אירועי מוקדם בהתפתחות neuromuscular או ביצוע electrophysiology ב מוטנטים שאינם יכולים לבקוע.

Video: Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

הכנת תרבויות העצבית מ Midgastrula עוברים שלב תסיסנית

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a protocol for performing the chromatin conformation capture technique in situ Hi-C on staged Drosophila melanogaster embryo populations. The result is a sequencing library that allows the mapping of all chromatin interactions that occur in the nucleus in a single experiment. Embryo sorting is done manually using a fluorescent stereo microscope and a transgenic fly line containing a nuclear marker. Using this technique, embryo populations from each nuclear division cycle, and with defined cell cycle status, can be obtained with very high purity. The protocol may also be adapted to sort older embryos beyond gastrulation. Sorted embryos are used as inputs for in situ Hi-C. All experiments, including sequencing library preparation, can be completed in five days. The protocol has low input requirements and works reliably using 20 blastoderm stage embryos as input material. The end result is a sequencing library for next generation sequencing. After sequencing, the data can be processed into genome-wide chromatin interaction maps that can be analyzed using a wide range of available tools to gain information about topologically associating domain (TAD) structure, chromatin loops, and chromatin compartments during Drosophila development.

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

This work describes a protocol for the generation of high resolution in situ Hi-C libraries from tightly staged pre-gastrulation Drosophila melanogaster embryos.

הדור של הגנום כולו כרומטין קונפורמציה לכידת ספריות מעוברים דרוזופילה בחוזקה בשלבים המוקדמים

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Genetics

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, organism development, and disease. It is often desirable to obtain PPI information using in vivo material, to gain the most natural and unbiased view of the interaction networks. The fruit fly Drosophila melanogaster is an excellent platform to study PPIs in vivo, and lends itself to straightforward approaches to isolating material for biochemical experiments. In particular, fruit fly embryos represent a convenient type of tissue to study PPIs, due to the ease of collecting animals at this developmental stage and the fact that the majority of proteins are expressed in embryogenesis, thus providing a relevant environment to reveal most PPIs. Here we present a protocol for collection of Drosophila embryos at medium scale (0.5-1 g), which is an ideal amount for a wide range of proteomic applications, including analysis of PPIs by affinity purification-mass spectrometry (AP-MS). We describe our designs for 1 L and 5 L cages for embryo collections that can be easily and inexpensively set up in any laboratory. We also provide a general protocol for embryo collection and protein extraction to generate lysates that can be directly used in downstream applications such as AP-MS. Our goal is to provide an accessible means for all researchers to carry out the analyses of PPIs in vivo.

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

The goal of this protocol is to provide a straightforward and inexpensive approach to collecting Drosophila embryos at medium scale (0.5-1 g) and preparing protein extracts that can be used in downstream proteomic applications, such as affinity purification-mass spectrometry (AP-MS).

הכנה בינונית של<em&gt; תסיסנית</em&gt; עוברי תמציות עבור ניסויים פרוטאומיים

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, ...

Developmental Biology

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

הכנת תסיסנית עוברים Live-הדמיה באמצעות פרוטוקול Drop Hanging

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. Whole-cell patch-clamp techniques can then be employed to record from individually-identifiable neurons and somatic muscles. These recording configurations have been used to track the appearance and maturation of ionic currents and action potential propagation in both neurons and muscles. Genetic mutants affecting these electrical properties have been characterized to reveal the molecular composition of ion channels and associated signaling complexes, and to begin exploration of the molecular mechanisms of functional differentiation. A particular focus has been the assembly of synaptic connections, both in the central nervous system and periphery. The glutamatergic neuromuscular junction (NMJ) is most accessible to a combination of optical imaging and electrophysiological recording. A glass suction electrode is used to stimulate the peripheral nerve, with excitatory junction current (EJC) recordings made in the voltage-clamped muscle. This recording configuration has been used to chart the functional differentiation of the synapse, and track the appearance and maturation of presynaptic glutamate release properties. In addition, postsynaptic properties can be assayed independently via iontophoretic or pressure application of glutamate directly to the muscle surface, to measure the appearance and maturation of the glutamate receptor fields. Thus, both pre- and postsynaptic elements can be monitored separately or in combination during embryonic synaptogenesis. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Electrophysiological recordings from Drosophila embryos allow analyses of developing muscle and neuron electrical properties, as well as characterization of functional synaptogenesis at the glutamatergic neuromuscular junction and central cholinergic and GABAergic synapses.

הקלטה של ​​אלקטרו תסיסנית עובריים

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an embryonic fillet preparation by a microinjector. Each motor neuron whose membrane is contacted by the droplet can then be rapidly labeled. Individual motor neurons are continuously labeled, enabling fine structural details to be clearly visualized. Given that lipophilic dyes come in various colors, the technique also provides a means to get adjacent neurons labeled in multicolor. This tracing technique is therefore useful for studying neuronal morphogenesis and synaptic connectivity in the motor neuron system of Drosophila.

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a method for retrograde tracing of the Drosophila embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes.

מעקב רטרוגרדי של דרוזופילה ממונע נוירונים מוטוריים שימוש בצבעי פלורסנט

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...

Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer

Modern approaches in quantitative live cell imaging have become an essential tool for exploring cell biology, by enabling the use of statistics and computational modeling to classify and compare biological processes. Although cell culture model systems are great for high content imaging, high throughput studies of cell morphology suggest that ex vivo cultures are limited in recapitulating the morphological complexity found in cells within living organisms. As such, there is a need for a scalable high throughput model system to image living cells within an intact organism. Described here is a protocol for using a high content image analyzer to simultaneously acquire multiple time-lapse videos of embryonic Drosophila melanogaster development during the syncytial blastoderm stage. The syncytial blastoderm has traditionally served as a great in vivo model for imaging biological events; however, obtaining a significant number of experimental replicates for quantitative and high-throughput approaches has been labor intensive and limited by the imaging of a single embryo per experimental repeat. Presented here is a method to adapt imaging and microinjection approaches to suit a high content imaging system, or any inverted microscope capable of automated multipoint acquisition. This approach enables the simultaneous acquisition of 6-12 embryos, depending on desired acquisition factors, within a single imaging session.

Presented here is a protocol to microinject and simultaneously image multiple Drosophila embryos during embryonic development using a plate-based, high content imager.

הכנת עובר Drosophila ומיקרו-היתוך למיקרוסקופיה של תאים חיים שבוצעו באמצעות מנתח תוכן גבוה אוטומטי

Modern approaches in quantitative live cell imaging have become an essential tool for exploring cell biology, by enabling the use of statistics and ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

תא תרבויות ראשי מ תסיסנית Gastrula עוברים

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

עיכוב אופטוגנטי של התכווצות אקטומיוזין בתיווך Rho1 בדרוזופילה

Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos

Contractile forces generated by actin and non-muscle myosin II ("actomyosin contractility") are critical for morphological changes of cells and tissues at multiple length scales, such as cell division, cell migration, epithelial folding, and branching morphogenesis. An in-depth understanding of the role of actomyosin contractility in morphogenesis requires approaches that allow the rapid inactivation of actomyosin, which is difficult to achieve using conventional genetic or pharmacological approaches. The presented protocol demonstrates the use of a CRY2-CIBN based optogenetic dimerization system, Opto-Rho1DN, to inhibit actomyosin contractility in Drosophila embryos with precise temporal and spatial controls. In this system, CRY2 is fused to the dominant negative form of Rho1 (Rho1DN), whereas CIBN is anchored to the plasma membrane. Blue light-mediated dimerization of CRY2 and CIBN results in rapid translocation of Rho1DN from the cytoplasm to the plasma membrane, where it inactivates actomyosin by inhibiting endogenous Rho1. In addition, this article presents a detailed protocol for coupling Opto-Rho1DN-mediated inactivation of actomyosin with laser ablation to investigate the role of actomyosin in generating epithelial tension during Drosophila ventral furrow formation. This protocol can be applied to many other morphological processes that involve actomyosin contractility in Drosophila embryos with minimal modifications. Overall, this optogenetic tool is a powerful approach to dissect the function of actomyosin contractility in controlling tissue mechanics during dynamic tissue remodeling.

מחבר זרקור: עיכוב אופטוגנטי של התכווצות אקטומיוזין בתיווך Rho1 יחד עם מדידת מתח אפיתל בעוברי דרוזופילה  

Actomyosin contractility plays an important role in cell and tissue morphogenesis. However, it is challenging to manipulate actomyosin contractility in vivo acutely. This protocol describes an optogenetic system that rapidly inhibits Rho1-mediated actomyosin contractility in Drosophila embryos, revealing the immediate loss of epithelial tension after the inactivation of actomyosin in vivo.

עיכוב אופטוגנטי של התכווצות אקטומיוזין בתיווך Rho1 יחד עם מדידת מתח אפיתל בעוברי דרוזופילה

Contractile forces generated by actin and non-muscle myosin II ("actomyosin contractility") are critical for morphological changes of cells and tissues at ...

מסיק והכנת תסיסנית עוברים הקלטה אלקטרו ונהלים אחרים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הכנת תרבויות העצבית מ Midgastrula עוברים שלב תסיסנית

הדור של הגנום כולו כרומטין קונפורמציה לכידת ספריות מעוברים דרוזופילה בחוזקה בשלבים המוקדמים

הכנה בינונית של

הכנת תסיסנית עוברים Live-הדמיה באמצעות פרוטוקול Drop Hanging

הקלטה של אלקטרו תסיסנית עובריים

מעקב רטרוגרדי של דרוזופילה ממונע נוירונים מוטוריים שימוש בצבעי פלורסנט

הכנת עובר Drosophila ומיקרו-היתוך למיקרוסקופיה של תאים חיים שבוצעו באמצעות מנתח תוכן גבוה אוטומטי

תא תרבויות ראשי מ תסיסנית Gastrula עוברים

עיכוב אופטוגנטי של התכווצות אקטומיוזין בתיווך Rho1 יחד עם מדידת מתח אפיתל בעוברי דרוזופילה

עיכוב אופטוגנטי של התכווצות אקטומיוזין בתיווך Rho1 יחד עם מדידת מתח אפיתל בעוברי דרוזופילה

מסיק והכנת תסיסנית עוברים הקלטה אלקטרו ונהלים אחרים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הכנת תרבויות העצבית מ Midgastrula עוברים שלב תסיסנית

הדור של הגנום כולו כרומטין קונפורמציה לכידת ספריות מעוברים דרוזופילה בחוזקה בשלבים המוקדמים

הכנה בינונית של

הכנת תסיסנית עוברים Live-הדמיה באמצעות פרוטוקול Drop Hanging

הקלטה של ​​אלקטרו תסיסנית עובריים

מעקב רטרוגרדי של דרוזופילה ממונע נוירונים מוטוריים שימוש בצבעי פלורסנט

הכנת עובר Drosophila ומיקרו-היתוך למיקרוסקופיה של תאים חיים שבוצעו באמצעות מנתח תוכן גבוה אוטומטי

תא תרבויות ראשי מ תסיסנית Gastrula עוברים

עיכוב אופטוגנטי של התכווצות אקטומיוזין בתיווך Rho1 יחד עם מדידת מתח אפיתל בעוברי דרוזופילה

עיכוב אופטוגנטי של התכווצות אקטומיוזין בתיווך Rho1 יחד עם מדידת מתח אפיתל בעוברי דרוזופילה

הקלטה של אלקטרו תסיסנית עובריים