<p class="jove_content"> KB é suportado pelo NIH conceder GM54544. </p>

<p class="jove_title"> Parte 1: Equipamentos e Suprimentos </p><ol><li> Um microscópio de dissecção bom é necessário para dissecção embrião; aumento de 40 vezes é sugerido, com 25X de olhos pedaços ao máximo aumentar a ampliação. </li><li> Forceps multa (número 5) são necessários para a seleção manual de embriões e devitellinization de embriões. </li><li> Equipamentos para fazer e modificar agulhas finas de vidro é necessário. Puxado vidro agulhas são necessários para a dissecção. Nós preferimos vidro sólido para dissecção (duram mais), mas tubos de vidro padrão de paredes espessas (diâmetro externo 1-1,5 mm) funciona tão bem. Algumas pessoas usam agulhas de tungstênio fino, eletrolítica para a nitidez desejada em um banho de 1M NaOH utilizando uma bateria de 10 + autotransformador Amp. Agulhas dissecção afiada de tungstênio têm o benefício que eles são relativamente resistentes e de longa duração. Agulhas de vidro oco (formada semelhante a correção eletrodos grampo) estão ligados a tubos de plástico e usado durante a dissecção para sucção e expulsão de solução salina, bem como a liberação controlada de cola. Uma variedade de puxadores de vidro estão disponíveis para a fabricação de agulhas de vidro. Computador programado extratores podem ser predefinidos para puxar uma variedade de formas e tamanhos. A Brown-Flaming modelos (Sutter Instrument Co.) são amplamente favorecidos. Um microscópio composto (20-40X objetivo) deve estar disponível para inspecionar e modificar eletrodos antes do uso. </li><li> Dois tipos de soluções são comumente usados ​​para o banho de tecidos embrionários durante a dissecção: 1) &quot;standard&quot; (Jan e Jan, 1976a) ou &quot;padrão modificado&quot; (Broadie, 2000) salinas, com base em soluções comumente utilizadas para a gravação em outros sistemas de invertebrados e 2) &quot;hemolinfa-like&quot; (HL) salinas (Stewart et al 1994), um compromisso entre a solução salina padrão e as concentrações iónicas medidas na hemolinfa <em>Drosophila.</em> Note-se que nenhuma dessas salinas imitar com precisão a composição química da hemolinfa in vivo (Broadie, 2000). Padrão de solução salina contém (em mM): 135 NaCl, KCl 5, 4 MgCl <sub>2,</sub> CaCl <sub>2</sub> 1,8, 72 de sacarose, 5 TES, pH 7.2. Experimentadores também pode querer considerar salina inseto comercialmente preparado (Media Insect por exemplo Schneider), que é inadequado para a gravação eletrofisiológicas mas muito provavelmente para proteger a saúde dos tecidos expostos. </li></ol><p class="jove_title"> Parte 2: Estadiamento Embrião e Dissection </p><ol><li> Para coleta de ovos ideal, manter jovens (&lt;7 dias), do sexo masculino saudáveis ​​e moscas fêmeas (20-40) em potes de doce, que por 2-3 dias. Deitado potes comumente consistem em copos de 100 ml de plástico (Tri-Pour) perfurada para proporcionar a circulação de ar adequada, cobrindo uma placa de agar 60 mm. Placas de ágar contém maçã ou suco de uva temperado com agar. Existem várias receitas, mas um exemplo é a seguinte: 700 ml de água, 25-30 agar gramas, 300 ml de suco concentrado (uva ou maçã), 0,5 g metil paraben (p-hydroxymethylbenzoate), e 30g de açúcar. Autoclave da água e ágar, e, separadamente, ferver a p-hydroxymethylbenzoate com o açúcar e suco. Misture o suco de agar e soluções e rapidamente despeje em placas de 60 mm, removendo as bolhas. </li><li> Antes da coleta de ovos, as moscas são alimentados com pasta de levedura (7 gramas de fermento de padeiro em 9 ml de água armazenada a 4 ° C) em placas fresca, trocada pelo menos duas vezes por dia durante pelo menos dois dias. De dia 3, um bom vaso deve produzir 100-200 ovos por hora. Postura melhor ovo é observado em um pote mantido em seu lado com o agar na placa riscada. Muitos embriões serão colocados dentro ou ao lado da arranhões. </li><li> Para coletar um grande número de embriões, delicadamente a transferência dos embriões a partir da placa de ágar em uma cesta usando um pincel. A cesta pode ser feita com um tubo de centrífuga de 15 ou 50 ml. Cortar o fundo deixando área de superfície suficiente para prender uma tela (70 mesh mm) entre a tampa ea parte superior do tubo. Enxágüe os embriões com dH <sub>2</sub> 0 e colocar em uma placa de Petri de lixívia 50% a 100% fresca para remover o córion exterior. Alternativamente, os ovos podem ser recolhidos individualmente usando uma pinça fina, e dechorionated, colocando-os manualmente em uma gota de água sanitária. De-chorionation pode levar de 30 segundos a dois minutos (lixívia fresca é muito mais rápido), e devem ser monitorizados sob o microscópio de dissecação. Remoção do córion expõe a brilhante, membrana vitelina transparente. Dechorionated ovos deverão ser lavados brevemente, ou colocados em solução salina, como alvejantes destrói rapidamente os tecidos devitellinized. </li><li> É fundamental cuidadosamente estágio embriões para a idade desejada de desenvolvimento. Os estágios definidos <em>Drosophila</em> embrionárias (1-17; Campos-Ortega e Hartenstein, 1985) não são úteis, como todo o desenvolvimento funcional neuromuscular ocorre em 16 fase tardia ou estágio 17. Assim, os embriões são encenadas por hora de desenvolvimento a 25 ° C em uma incubadora umidificada, em horas após a fecundação ou, mais comumente, após a postura de ovos (AEL). Sob essas condições, a embriogênese dura 21 + / - 1 hr a 25 ° C. </li><li> Ovos de uma cronometrado ovo-lay (1-2 hrs) que estão devidamente idosos são vistas próximas de critérios morfológicos. Após a lavagem extensiva em dH <sub>2</sub> O, os ovos dechorionated são colocados em uma placa de cultura de plástico (sob dH <sub>2</sub> O) para visualização. Preparação correta pode ser confirmada com a critérios morfológicos usando luz refletida com um microscópio de dissecção (Campos-Ortega e Hartenstein, 1985). Madura fase final de embriões (22-24h AEL) à beira de incubação são geralmente reconhecidos pela segmentação da cutícula e traquéia inflado. Embriões também podem ser genotipados utilizando GFP balanceadores e um microscópio de fluorescência dissecção com filtros adequados. </li><li> Para dissecção, embriões e dechorionated developmentally encenado estão ligados (lado dorsal para cima) em uma lamela em uma gota de solução salina (veja o passo 1.5). Embriões são retirados da membrana vitelina por punção da membrana perto da extremidade anterior ou posterior com uma micropipeta de vidro ou a agulha de tungstênio, e, em seguida, suavemente libertando o embrião da membrana. Em preparação para a dissecação, o embrião deve ser posicionado sobre a lamela com a superfície até dorsal (face dorsal até dissecção irá expor o sistema nervoso e ventral neuromusculature para experimentos. No entanto, o embrião pode, obviamente, ser posicionados em outras maneiras de facilitar o acesso a outros tecidos.) </li><li> Embriões em estágio precoce (&lt;16 hrs AEL) atribuem directamente para limpar o vidro ou o vidro revestido com polilisina (poli-L-lisina hydrobromide; Broadie e Bate, 1993a, b). Embriões mais velhos (&gt; 16 hrs AEL), após a formação da cutícula, deve ser colado, de preferência para Sylgard revestido (Dow Corning) lamínulas. A água-polimerização cola de cianoacrilato cirúrgicos ou veterinários é usado (Broadie e Bate, 1993c, d). A cola é entregue através de uma pipeta de vidro pequeno eletrodo (10-20 micrômetros ponta diâmetro interno) anexado a um tubo de borracha com o fluxo de cola controlado por pressão na boca. Cuidados devem ser tomados durante a entrega de cola, como a cola polimeriza rapidamente, ao contatar a solução salina. Note também que a colagem não pode ser realizada em solução salina sem ou com baixas concentrações de íons bivalentes, como a cola exige íons divalentes para polimerizar. Pequenas quantidades de cola são utilizados pela primeira vez para anexar firmemente a cabeça ea cauda. </li><li> Uma vez que as extremidades do embrião são colados à lamela, uma incisão é feita no dorso com um eletrodo de vidro ou a agulha de tungstênio afiadas. Isso é facilitado pelo cuidado perfurantes da linha de incisão antes de fazer o corte final. Os lados da incisão são, então, ligado à lamela com mais cola, para delicadamente espalhar o apartamento embrião. Os órgãos internos, incluindo o intestino, órgãos de gordura e, opcionalmente, traquéia são então removidas por sucção usando uma pipeta de vidro ligado a tubos de borracha (Broadie eo Bate 1993a-c). O embrião agora deve ser anexado plana para as lamelas, epiderme para baixo com o sistema central nervoso ventral, nervos periféricos, e somáticas musculatura expostos para a experimentação. </li></ol>

<p class="jove_content"> Encenação precisa de embriões é crítica devido à maturação rápida de propriedades funcionais ao longo do tempo de apenas algumas horas. Várias questões complicar este teste. Primeiro, a maioria dos pesquisadores usa ovo cronometrado estabelece a fase de embriões, mas o tempo de postura pode variar enormemente de animal para animal em diferentes condições (Broadie et al. 1992). Em particular, as fêmeas em uma dieta limitada tendem a reter ovos fertilizados por períodos prolongados antes do assentamento. P...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Embryo Collection Cages</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genesee Scientific (www.flystuff.com)</td>
<td>59-100 (for 60 mm dish; other sizes available)</td>
<td>Cages can also be home made using punctured tri-pour beakers, as shown in video</td>
</tr>
<tr>
<td>Sylgard 184</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>Available from various companies</td>
<td>Surgical glue adheres better to sylgard-coated coverslips</td>
</tr>
<tr>
<td>Fine glass tubing, outer diameter 1.0-1.5 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>various</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>For pulling into fine glass needles for dissection and tubes for glue delivery</td>
</tr>
<tr>
<td>Plastic tubing, to attach to glass pipette for mouth suction and glue application</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Tygon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Tubing inner diameter needs to match glass outer diameter.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

harvesting and preparing <em>drosophila</em> embryos for electrophysiological recording and other procedures

<p class="jove_content"><em>Drosophila</em> é um modelo premier genética para o estudo de ambos o desenvolvimento embrionário e neurociência funcional. Tradicionalmente, esses campos são muito afastadas umas das outras, com histórias em grande parte independentes e comunidades científicas. No entanto, a interface entre esses campos normalmente díspares são os programas de desenvolvimento subjacente aquisição de propriedades funcionais elétricos de sinalização e diferenciação das sinapses químicas funcionais durante as fases finais da formação de circuitos neurais. Esta interface é uma área extremamente importante para a investigação. Em <em>Drosophila,</em> estas fases de desenvolvimento funcional ocorrem durante um período de &lt;8 horas (a 25 ° C) durante o último terço da embriogênese. Este período final de desenvolvimento foi considerado por muito tempo intratáveis ​​devido a investigação para a deposição de um resistente, impermeável cutícula epidérmica. Um avanço de avanço foi a aplicação de cola de água polimerização cirúrgica que pode ser aplicado localmente para a cutícula para que a dissecção controlada de embriões em estágio avançado. Com uma incisão dorsal longitudinal, o embrião pode ser deitadas, expondo o cordão nervoso ventral e musculatura da parede do corpo à investigação experimental. Este sistema tem sido fortemente usada para isolar e caracterizar mutantes genéticos que impedem a formação da sinapse embrionárias e, assim, revelar os mecanismos moleculares que regem a especificação e diferenciação das conexões sinápticas funcionais sinapse e propriedades de sinalização.</p>

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Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

<p class="jove_content">Esta técnica expõe a Drosophila neuromusculature embrionárias para imuno-histoquímica ou gravação eletrofisiológico. É útil para o estudo de eventos no início do desenvolvimento neuromuscular ou a realização de eletrofisiologia em mutantes que não podem eclodir.</p>

Colheita e Preparação<em> Drosophila</em> Os embriões para Gravação eletrofisiológicos e outros procedimentos

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Harvesting and Preparing <em>Drosophila</em> Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

13.3K visualizações.  University of Illinois. Esta técnica expõe a Drosophila neuromusculature embrionárias para imuno-histoquímica ou gravação eletrofisiológico. É útil para o estudo de eventos no início do desenvolvimento neuromuscular ou a realização de eletrofisiologia em mutantes que não podem eclodir.

Colheita e Preparação Drosophila Os embriões para Gravação eletrofisiológicos e outros procedimentos