المؤلفان بالشكر SI برنشتاين (جامعة ولاية سان دييغو) لقراءة نقدية واقتراحات مفيدة بشأن إعداد هذه المخطوطة. وأيد هذا العمل عن طريق منح المعاهد الوطنية للصحة لبرنشتاين SI ، SDSU ، ور بودمر ، BIMR ؛ وزمالة في مرحلة ما بعد الدكتوراه من الدول الغربية التابعة لرابطة القلب الأميركية إلى Vogler زاي وألف Cammarato.

<html> قبل أن تبدأ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحلول التالية : <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاسترخاء العازلة (ذبابة الفاكهة الاصطناعي الدملمف (ADH) (انظر &quot;تصور القلب النابض في ذبابة الفاكهة&quot;) الذي يحتوي على 10 EGTA ملم) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تثبيتي (4 ٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني 1X) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PBSTx (PBS تحتوي على 0.1 ٪ تريتون - X - 100) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المخفف مناسب الابتدائية والأنواع المحددة الأجسام المضادة الثانوية fluorescently المسمى في PBSTx </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح ذبابة الفاكهة لفضح أنابيب القلب (من الذباب الكبار و / أو اليرقات) التالي <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذبابة الفاكهة في قلب شبه سليمة في إعداد بروتوكول &quot;تصور القلب النابض في ذبابة الفاكهة&quot; ، أو </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الاوكسيجين ADH أثناء تشريح اليرقات وتهجير دبوس الخلفي قليلا من المنتصف بطني : ذبابة الفاكهة تشريح NMJ اليرقات بروتوكول 1 مع التعديلات التالية. يتم قطع اليرقات على طول خط الوسط البطني. لا تقم بإزالة أي نوع من الأنسجة قبل التثبيت. </li></ol></li></ol> تلوين تألقي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من أن كل القلوب هي ضرب إيقاعي في ADH الاوكسيجين. استبدال بسرعة ADH مع الاسترخاء العازلة. فحص كل أنبوب القلب لضمان تحول دون انكماش. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح القلوب بالاستعاضة عن العازلة الاسترخاء مع مثبت. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة مع اهتزاز لطيف. (للحصول على هز إعداد اليرقات ليس من الضروري في أي خطوة ، ويمكن اعتبار تضر سلامة نسيج القلب). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل العينات ثلاث مرات لمدة عشر دقائق مع PBSTx في درجة حرارة الغرفة مع الهز المستمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بالنسبة للبالغين ، وتقليم مرة أخرى بعناية حواف البطني للبشرة البطن مثل هذا أن ما تبقى هو أكثر بيضاوي الشكل وتقريبه أقل. بالإضافة إلى ذلك ، مع خفض واحدة بين البطن والصدر ، بعناية ونظافة الجسم شرائح منفصلة على حد سواء ، وضمان الحد الأدنى من الضرر على المنطقة الأمامية من القلب. لقلوب اليرقات ، وإزالة الدهون في الجسم بعناية باستخدام ملقط الغرامة. يجب أن يتم تنفيذ إزالة الدهون بحذر شديد ، لأن القلب لا يزال هشا اليرقات خاصة وتحظى بتأييد كبير جدا من العضلات أو غيرها من النسيج الضام. لا تقم بإزالة فروع القصبة الهوائية وهذا قد يؤدي إلى تلف القلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل المنطقة الظهرية قلصت من بشرة البطن من الحواف ، وتجنب الاتصال مع أنبوب القلب موقعا مركزيا ، في 96 لوحة جيدا مع الآبار التي تحتوي على 5-10 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية مخففة في PBSTx. المكان لا يزيد على 12 عينة لكل بئر. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة مع التحريض المستمر. ويمكن أيضا أن يتم بين عشية وضحاها حضانة في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الابتدائي حل الأضداد. غسل قلوب ثلاث مرات لمدة عشر دقائق مع 100 ميكرولتر PBSTx في درجة حرارة الغرفة مع الهز المستمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد إزالة العازلة غسل النهائي ، إضافة 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية في PBSTx ، على أن تستكمل مع Alexa594 - phalloidin (1:1000). احتضان لمدة ساعة مع الهز المستمر في درجة حرارة الغرفة. الاحتفاظ بعينات مغطاة لمنع fluorophore التبييض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التالية حضانة الثانوية ، وغسل قلوب ثلاث مرات لمدة عشر دقائق مع 100 ميكرولتر من PBSTx في درجة حرارة الغرفة مع الهز المستمر. الحفاظ على عينات غطت جميع أنحاء خطوات الغسيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإزالة تريتون 100 - X ، شطف قلوب مرة أخيرة في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة. ويمكن تخزين العينات في الظلام في 4 درجات مئوية لعدة أيام قبل التركيب. </li></ol> تصاعد لهارتس الكبار <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يلتزم كل منهما 18 X 18 مم غطاء ينزلق إلى شريحة المجهر مع 10 ميكرولتر من Vectashield المتوسطة المتزايدة. وينبغي متباعدة في coverslips ~ 10-15 ملم إربا. وضع قطرة صغيرة الثالث من تصاعد في والمتوسطة بين coverslips اثنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان ميكرولتر من 20 Vectashield في وسط ساترة الثالثة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية كل من قلوب من محلول الغسيل PBS من الحواف الشديد للبشرة ، وبلطف مكان لهم للقلب الجانب السلبي على انخفاض المتوسط ​​متزايدة على ساترة الثالثة. مكان لا يزيد عن خمس قلوب كل قطرة ماء على ساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاختيار تحت المجهر للتأكد من كل قلوبهم لأسفل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عكس بعناية ساترة تحتوي على قلوب والمكان بسرعة على الشريحة التي تحتوي على زوج من coverslips بحيث الحبرية بصمامات القلب أنابيب مع قطيرة Vectashield بين الزوج ساترة. ينبغي تشكيل &quot;جسر&quot; من قبل coverslips. وسيتم تعليق قلوب ساترة وبين الشريحة المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاختيار تحت المجهر للتأكد من أن قلوب تواجه الآن التصاعدي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإصلاح coverslips في حوافها مع طلاء الأظافر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قلوب هي الآن جاهزة للتصوير المجهري الفلورسنت أو عبر مبائر. </li></ol>معشوقة = &quot;jove_title&quot;&gt; تركيب لهارتس اليرقات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قطرة (~ 20 ميكرولتر) Vectashield على شريحة المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل بدقة تصل إلى عينتين اليرقات الى الجانب لهم وتوجيه Vectashield الظهرية أسفل باستخدام الإبر التنغستن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب العينات بشكل فردي بعيدا عن تصاعد المتوسطة وربط كل وبالتوازي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان ساترة على طرفي نقيض من العينة. باستخدام الملقط ، وضع ساترة الثالث على أعلى ، أول من زرع جانب واحد على ساترة الخلفي وخفضه وصولا الى ساترة الأمامي وبالتالي تشكيل جسر. وستقوم قوات الشعرية يسبب تدفق Vectashield الخلفي من لالأمامية والتي تساعد المحاذاة الصحيحة للقلب اليرقات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح كافة coverslips في مكان ، في حوافها ، مع طلاء الأظافر بعناية وملء الفراغ بين 20-30 coverslips مع Vectashield ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الختم مع طلاء الأظافر وتخزينها في 4 درجات مئوية ، أو للتخزين الطويل الأجل في -20 درجة مئوية. </li></ol> ممثل النتائج عندما أعدم بشكل صحيح ، وينبغي لجميع مكونات والأنسجة المرتبطة السفينة الظهرية تبقى سليمة ويمكن تصور بسهولة. ينبغي أن يكون الحد الأدنى مضان الخلفية. بالنسبة للبالغين ، وطبقة العضلات البطنية الطولي البقع بشكل جيد للغاية ويعطي إشارة كبيرة (الشكل 1 والشكل 2). والعضلية الدائرية الأساسية ومع ذلك ، لا تميل الى انتاج ما يشير الى كثافة كما ان من الطبقة الفوقية البطني. وmyocytes من &quot;غرفة المخروطية&quot; الأمامي للقلب الكبار تحتوي على كمية كبيرة من المواد مقلص ، وبالتالي ، فإن هذه المنطقة كما يبدو النسبي الأكثر قوة في التعامل مع ما تبقى من أنبوب القلب. قلب اليرقات يبين ترتيب myofibrillar المتصاعد مماثلة لتلك الخلايا العضلية ومقلص الكبار (الشكل 3). <img src="/files/ftp_upload/1423/1423fig1atmb.jpg" alt="الشكل 1A" border="0" /> <img src="/files/ftp_upload/1423/1423fig1btmb.jpg" border="0" alt="الرقم 1B" /> الشكل 1 : أعلى. وتظهر صورة مجهرية الفلورية أنبوب القلب بأكمله من melanogaster ذبابة الفاكهة التي تعبر عن البالغين ، الميوسين GFP. لقد التقطت الصورة مع مجهر زايس Z1 تصوير فلوري وحدة مجهزة Apotome الانزلاق. هو المسمى هو مبين في الميوسين ، GFP الخضراء ، ملطخة أكتين مع 594 AlexaFluor phalloidin ® (الحمراء) ، وα actinin - المضادة للα - actinin الأضداد (الأزرق). علما الإجراء التحضيرية تصاريح استخراج العينات القلب مع هياكل المحفوظة جيدا. CC = المخروطية الغرفة ؛ AM العضلات alary = ؛ V = الداخلية صمام ؛ VLL = طبقة العضلات البطنية الطولية. القاع. منطقة أنبوب القلب للبالغين من خلال الجزء CC البطن 3 من القلب فقط تحت طبقة الطولي بطني يبين ترتيب myofibril المتصاعد من العضلية مقلص. الرجاء <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1423/1423fig1a.jpg">النقر هنا</a> لنسخة أكبر من الشكل 1A ، و <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1423/1423fig1b.jpg">هنا</a> لنسخة أكبر من الرقم 1B <img border="0" src="/files/ftp_upload/1423/1423fig2tmb.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2 : مداخن مبائر الممثل للجزء الأمامي من القلب للبالغين ملطخة 594 AlexaFluor phalloidin ® (الحمراء) ، ومضاد للPericardin (الكولاجين النوع الرابع) (الأخضر) الأجسام المضادة. ويرتبط Pericardin مع القلب على طول السطح البطني ، والتي تنشأ على الأرجح من اللييفات العضلية الموجهة طوليا من طبقة العضلات البطنية. الرجاء <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1423/1423fig2.jpg">النقر هنا</a> لنسخة أكبر من الشكل 2. <img border="0" src="/files/ftp_upload/1423/1423fig3tmb.jpg" alt="الشكل 3" /> الرقم 3 : صورة مجهرية من الفلورسنت A7 قطعة من القلب السليم ليرقة ذبابة الفاكهة مرحلة الثلاث. لقد التقطت الصورة مع مجهر زايس Z1 تصوير فلوري وحدة مجهزة Apotome الانزلاق. اتسخت يسمى الأكتين مع 594 AlexaFluor phalloidin ® (الخضراء) وα actinin - المضادة للα - actinin الأضداد (الحمراء). الرجاء <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1423/1423fig3.jpg">النقر هنا</a> لنسخة أكبر من الرقم 3.

<ol>
	<li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+NMJ+dissection.">Drosophila larval NMJ dissection.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Molina, M. R., Cripps, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ostia,+the+inflow+tracts+of+the+Drosophila+heart,+develop+from+a+genetically+distinct+subset+of+cardial+cells.">Ostia, the inflow tracts of the Drosophila heart, develop from a genetically distinct subset of cardial cells.</a> Mech Dev. 1, 51-59 (2001).</li><li>Dulcis, D., Levine, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamatergic+innervation+of+the+heart+initiates+retrograde+contractions+in+adult+Drosophila+melanogaster.">Glutamatergic innervation of the heart initiates retrograde contractions in adult Drosophila melanogaster.</a> J Neurosci. 2, 271-280 (2005).</li><li>Zeitouni, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+pathways+involved+in+adult+heart+formation+revealed+by+gene+expression+profiling+in+Drosophila.">Signalling pathways involved in adult heart formation revealed by gene expression profiling in Drosophila.</a> PLoS Genet. 10, 1907-1921 (2007).</li><li>Robertson, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster,+including+an+accurately+timed+account+of+the+principal+morphological+change.">The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological change.</a> J. Morphol. 2, 351-399 (1936).</li><li>Miller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. , (1950).</li><li>Rizki, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+circulatory+system+and+associated+cells+and+tissues.">The circulatory system and associated cells and tissues.</a> , (1978).</li><li>Cammarato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+transducer+mutations+differentially+affect+motor+function,+myofibril+structure,+and+the+performance+of+skeletal+and+cardiac+muscles.">Myosin transducer mutations differentially affect motor function, myofibril structure, and the performance of skeletal and cardiac muscles.</a> Mol Biol Cell. 2, 553-562 (2008).</li><li>Taghli-Lamallem, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+deficiency+in+Drosophila+reduces+lifespan+and+causes+a+dilated+cardiomyopathy+phenotype.">Dystrophin deficiency in Drosophila reduces lifespan and causes a dilated cardiomyopathy phenotype.</a> Aging Cell. 2, 237-249 (2008).</li><li>Kelso, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+database+documenting+a+GFP+protein-trap+insertion+screen+in+Drosophila+melanogaster.">a database documenting a GFP protein-trap insertion screen in Drosophila melanogaster.</a> Nucleic Acids Res. 32, D418-D420 (2004).</li><li>Dietzl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+transgenic+RNAi+library+for+conditional+gene+inactivation+in+Drosophila.">A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila.</a> Nature. 7150, 151-156 (2007).</li><li>Mery, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+muscle+LIM+protein,+Mlp84B,+is+essential+for+cardiac+function.">The Drosophila muscle LIM protein, Mlp84B, is essential for cardiac function.</a> J Exp Biol. 211, 15-23 (2008).</li></ol>

هنا نقدم بروتوكول مفيدة لإعداد وتلطيخ الظهرية melanogaster ذبابة الفاكهة السفن والأنسجة المرتبطة بها عن طريق التصوير المجهري أو مبائر الفلورسنت. ونحن نقدم سردا موجزا للخطوات التي المكرر واستخداما في مختبرنا للتلوين الفعالة التي تسمح جيدا حلها في الموقع من التص...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Ethylene glycol-bis (2-amino-ethylether) -N,N,N&#x2019;,N&#x2019;-tetra-acetic acid (EGTA)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich&reg;</td>
<td>E4378</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure</td>
<td>Reagent</td>
<td>Polysciences Inc.</td>
<td>50-00-0</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton-X-100</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich&reg;</td>
<td>9002-93-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Alexa Fluor&reg; 594 phalloidin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen&trade;</td>
<td>A12381</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vectashield&reg; Mounting Medium for Fluorescence with DAPI</td>
<td>Reagent</td>
<td>Vector Laboratories, Inc.</td>
<td>H-1200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tungsten pins</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>26002-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pin holder</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>26018-17</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

fluorescent labeling of drosophila heart structures

و<em&gt; ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em&gt; سفينة الظهرية ، أو القلب ، هو بنية أنبوبية تتألف من طبقة واحدة من مقلص العضلية ، والخلايا التي تأموري محاذاة على طول كل جانب من جدار القلب والعضلات alary داعمة ، ولدى البالغين ، وهي طبقة من خلايا العضلات البطنية الطولية. البيت ألياف مقلص الحفظ المكونة من التهندس الخلوي بما في ذلك العضلات حزم المكتظ اللييفات العضلية ومجمعات البروتين هيكل الخلية / غشائي جزئيا ، والتي تتفاعل مع المكونات مثلي من المصفوفة خارج الخلية. نحن هنا وصف بروتوكول لتثبيت ووضع العلامات الفلورية عضلة القلب من العناصر ولا سيما من قلوب الكبار واليرقات تشريح شبه سليمة<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt;. تحديدا ، علينا أن نظهر للتوسيم sarcomeric F - أكتين وα - actinin في قلوب اليرقات. بالإضافة إلى ذلك ، نقوم بوضع العلامات على F - أكتين وα actinin في الميوسين ، معربا عن GFP الذباب الكبار وα - actinin وpericardin ، وهو نوع الكولاجين الرابع المصفوفة خارج الخلية ، في قلوب الكبار البرية النوع. ويولى اهتمام خاص لوضع استراتيجية متزايدة لقلوب الكبار شبه سليمة تقلل إلى أدنى حد ويحسن التعامل مع الفرصة للحفاظ على سلامة القلب والأنابيب الأنسجة المرتبطة بها. هذه الاستعدادات هي مناسبة للتصوير المجهري عبر الفلورسنت ومبائر. عموما ، هذا الإجراء يسمح لتحليل دقيق ومفصل من الخصائص الهيكلية للقلب قوي وراثيا من النظام النموذجي لين العريكة.

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures at JoVE.com

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

نحن هنا وصف بروتوكول الأساسية لوصفها الفلورسنت من عناصر مختلفة من الأنابيب القلب من اليرقة وتعليم الكبار<em&gt; ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em&gt;. وهذه عينات مناسبة تماما للتصوير المجهري الفلورسنت أو عبر مبائر. هذا الأسلوب يسمح التحليل البنيوي مفصلا لملامح قلوب من كائن نموذج قوية.

بطاقات المواد الفلورية ذبابة الفاكهة</emهياكل القلب>

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells ...

fluorescent-labeling-of-drosophila-heart-structures

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

13.6K Views.  San Diego State University. نحن هنا وصف بروتوكول الأساسية لوصفها الفلورسنت من عناصر مختلفة من الأنابيب القلب من اليرقة وتعليم الكبار ذبابة الفاكهة السوداء البطن. وهذه عينات مناسبة تماما للتصوير المجهري الفلورسنت أو عبر مبائر. هذا الأسلوب يسمح التحليل البنيوي مفصلا لملامح قلوب من...

Video: Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

وسم الخلايا الجذعية مع الأصباغ نيون للمنظمات غير الغازية مع الكشف عن التصوير الضوئي

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle synapses, we developed a larval tissue preparation that had features of live intact larvae, but also had good optical properties.  This new preparation also allowed for access of perfusates to the synapse.  We used fly larvae, immersed them in artificial hemolymph, and relaxed their normal rhythmic body contractions by chilling them. Next we dissected off the posterior segments of each animal and with a blunt insect pin pushed the mouth parts backward through the body cavity.  This everted the larval body wall, like turning a sock inside-out.  We completed the dissection with ultra-fine dissection scissors and thus exposed the visceral side of the body wall muscles. The glial structures at the NMJ expressed membrane targeted GFP under the control of glial specific promoters. The post-synaptic membrane, the SSR (Subsynaptic Reticula) in muscle expressed synaptically targeted dsRed. We needed to acutely label the motor neuron terminals, the third part of the synapse. To do this we applied primary antibodies to HRP, conjugated to a far-red emitting flurophore.  To test for dye diffusion properties into the perisynaptic space between the motor neuron terminals and the SSR, we applied a solution of large Dextran molecules conjugated to far-red emitting flurophore and collected images.

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

We described structural features of the Glia-neuromuscular synapses in a novel Inside-out tissue preparation of live fly larvae using fluorescent dyes with confocal microscopy. We labeled live neuron terminals with fluorescent primary antibodies to HRP, and also visualized the perisynaptic space with fluorescent Dextrans.

تصور لايف ذبابة الفاكهة الدبقية العصبية والعضلية ، تقاطع مع الأصباغ نيون

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle ...

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in myogenic hearts. A key step in examining heart function in the fly is finding a way to access the heart in a manner that preserves its myogenic function while still allowing the beating heart organ to be observed and recorded. Two different methods for observing and recording the beating heart in both larva and adult Drosophila are described here. Our semi-intact preparation using adult flies allows clear visualization of the abdominal heart without interference from the pigmented cuticle and overlying fat bodies. To record larval heart beats it is necessary to immobilize the larva, which minimizes body wall movements thereby reducing heart movements that are not associated with myocardial contractions. Our methodologies produce stable adult and larval heart preparations that can beat for hours at rates of 1-3 Hz.

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Technique required for visualizing the beating heart in larval and adult Drosophila are presented. Each life stage requires a different methodology.

تصور القلب النابض في ذبابة الفاكهة</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained and restrained whole larvae. For direct control of the environment around the heart another approach utilizes the dissected larvae and removal of the internal organs in order to bathe the heart in desired compounds. The exposed heart also allows membrane potentials to be monitored which can give insight of the ionic currents generated by the myocytes and for electrical conduction along the heart tube. These approaches have various advantages and disadvantages for future experiments that are discussed. The larval heart preparation provides an additional model besides the Drosophila skeletal NMJ to investigate the role of intracellular calcium regulation on cellular function. Learning more about the underlying ionic currents that shape the action potentials in myocytes in various species, one can hope to get a handle on the known ionic dysfunctions associated to specific genes responsible for various diseases in mammals.

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various ways to monitor heart function in the larva of Drosophila for assessing questions dealing with the function of gap junctions, ion channel mutations, modulation of pacemaker activity and pharmacological studies.

رصد وظيفة القلب في اليرقات ذبابة الفاكهة السوداء البطن للدراسات فسيولوجية

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

إعداد الأجنة المجهري للإلكترون من ذبابة الفاكهة أنبوب القلب الجنينية

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological advantages provided by the giant salivary gland polytene chromosomes of third instar larvae.  In this tissue the chromosomes undergo many rounds of replication in the absence of cell division giving rise to approximately 1000 copies.  The DNA remains aligned after each replicative cycle resulting in greatly enlarged chromosomes that provide a unique opportunity to correlate chromatin morphology with the localization of specific proteins.  Consequently, there has been a high level of interest in defining the epigenetic modifications present at different genes and at different stages of the transcription process. An important tool for such studies is the labeling of polytene chromosomes with antibodies to the enzyme, transcription factor, or histone modification of interest. This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

إعداد يسحق ذبابة الفاكهة كروموسوم كثور الخيوط الصبغية للجسم وصفها

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. These systems offer a broad selection of fluorescent substrates optimized for a range of imaging instrumentation. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again. There are two steps to using this system: cloning and expression of the protein of interest as a SNAP-tag fusion, and labeling of the fusion with the SNAP-tag substrate of choice. The SNAP-tag is a small protein based on human O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), a DNA repair protein. SNAP-tag labels are dyes conjugated to guanine or chloropyrimidine leaving groups via a benzyl linker. In the labeling reaction, the substituted benzyl group of the substrate is covalently attached to the SNAP-tag. CLIP-tag is a modified version of SNAP-tag, engineered to react with benzylcytosine rather than benzylguanine derivatives. When used in conjunction with SNAP-tag, CLIP-tag enables the orthogonal and complementary labeling of two proteins simultaneously in the same cells.

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again.

الفلورسنت وصفها من COS - 7 تعرب عن البروتينات الانصهار SNAP - شعارا لتصوير الخلايا الحية

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

كله جبل RNA نيون<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأجنة

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

حيوي داخلي المجهري للهياكل التصوير التحت خلوية في الفئران لايف تعرب عن البروتينات الفلورية

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical coherence microscopy (OCM) has been demonstrated to be capable of imaging small animal hearts with high spatial resolution and ultrahigh imaging speed. The high image contrast and noninvasive properties make OCM ideal for performing longitudinal studies without requiring tissue dissections or staining. Drosophila has been widely used as a model organism in cardiac developmental studies due to its high number of orthologous human disease genes, its similarity of molecular mechanisms and genetic pathways with vertebrates, its short life cycle, and its low culture cost. Here, the experimental protocols are described for the preparation of Drosophila and optical imaging of the heartbeat with a custom OCM system throughout the life cycle of the specimen. By following the steps provided in this report, transverse M-mode and 3D OCM images can be acquired to conduct longitudinal studies of the Drosophila cardiac morphology and function. The en face and axial sectional OCM images and the heart rate (HR) and cardiac activity period (CAP) histograms, were also shown to analyze the heart structural changes and to quantify the heart dynamics during Drosophila metamorphosis, combined with the videos constructed with M-mode images to trace cardiac activity intuitively. Due to the genetic similarity between Drosophila and vertebrates, longitudinal study of heart morphology and dynamics in fruit flies could help reveal the origins of human heart diseases. The protocol here would provide an effective method to perform a wide range of studies to understand the mechanisms of cardiac diseases in humans.

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy OCM

Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.

إعداد ذبابة الفاكهة والتصوير الطولي من وظيفة القلب في فيفو باستخدام البصرية بالاتساق المجهري (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical ...