저자는이 원고의 준비에 관한 중요 읽고 도움이 제안 SI 번스타인 (샌디에고 주립 대학)을 주셔서 감사합니다. 이 작품은 SI 번스타인, SDSU,와 R. Bodmer, BIMR에 NIH 교부금에 의해 지원되었다;와 미국 심장 협회의 미국 서부 제휴에서 G. 포글러와 A. Cammarato에 박사후 교제로.

당신이 시작하기 전에 <ol><li> 다음과 같은 솔루션을 준비 : <ol class="lalpha"><li> 편안한 버퍼 (10 MM EGTA을 포함 인공 Drosophila hemolymph (ADH) ( &quot;Drosophila에서 뛰는 심장을 떠올리&quot;참조)) </li><li> 정착액 (1X PBS 4 %의 포름 알데히드) </li><li> PBSTx (PBS는 0.1 % 트리톤 - X - 100을 포함) </li><li> PBSTx에 적절하게 희석 주와 종 특정 찬란 분류 이차 항체 </li></ol></li><li> 다음과 같은 심장병 튜브 (성인 파리 및 / 또는 애벌레의) 노출 Drosophila를 해부하다 <ol class="lalpha"><li> 반 그대로 Drosophila의 심장 준비 &quot;Drosophila에서 뛰는 심장을 떠올리&quot;에서 프로토콜, 또는 </li><li> 다음과 같은 수정 Drosophila 애벌레 NMJ 해부 프로토콜 1 : 사용 애벌레 해부 동안 ADH를 산소와 복부 정중선에서 약간 뒷부분 핀을 치환. 유충은 복부 정중선을 따라 절단됩니다. 전에 고정 어떤 조직을 제거하지 마십시오. </li></ol></li></ol> 형광 스테 이닝 <ol><li> 모든 마음은 리드미컬 산소 ADH에 뛰는 것을 확인하십시오. 빨리 버퍼 휴식과 ADH를 교체하십시오. 수축을 저해되도록 각 심장병 튜브를 검사합니다. </li><li> 정착액으로 편안한 버퍼를 교체하여 마음을 고쳐. 부드러운 잡고 20 분 실온에서 알을 품다. (애벌레 준비 흔들어 어느 단계에서 필요하지 않습니다, 그리고 심장 조직 무결성에 해로운 것으로 간주됩니다.) </li><li> 지속 잡고 실온에서 PBSTx와 십분 표본 세 번 씻으십시오. </li><li> 성인, 신중하게 어떤 것이 더 남아 타원형 이하 반올림되어 같은 복부 표피의 복부 가장자리를 다시 잘라. 또한 복부와 흉부 사이에 싱글 컷, 신중하게 그리고 깔끔하게 별도의 신체 세그먼트 모두와 함께 심장의 앞쪽에 영역에 최소한의 손상을 보장합니다. 애벌레의 마음을 위해, 신중하게 잘 집게를 사용하여 지방 시신을 제거합니다. 애벌레 마음이 특히 연약하고 다른 근육이나 결합 조직에서 거의 지원을했기 때문에 지방 제거가 극단주의와 함께 실행해야합니다. 이것은 심장 손상을 수 있으므로 tracheal 가지를 제거하지 마십시오. </li><li> PBSTx에 희석 일차 항체의 50-100 μl를 포함 우물과 96 잘 접시로, 중앙에 위치한 심장 튜브와 접촉을 피하기 위해, 가장자리에 의해 복부 표피의 손질 등의 지역을 전송합니다. 물론 당 더 이상 12 이상의 표본을 넣으십시오. 지속적인 교반과 함께 2 시간 동안 실온에서 알을 품다. 부화도 4 밤새 할 수 있습니다 ° C. </li><li> 기본 항체 솔루션을 제거합니다. 지속 잡고 상온 100 μl PBSTx와 십분 마음을 세 번 씻으십시오. </li><li> 최종 세척 버퍼의 제거에 따라, Alexa594 - phalloidin (1:1000)와 보충 PBSTx에서 이차 항체 100 μl를 추가합니다. 상온에서 지속적으로 흔들어 한 시간 동안 부화. 표백 형광단을 방지하기 위해 적용 샘플을 보관. </li><li> 보조 부화 후, 지속적인 흔들림과 함께 실온에서 PBSTx 100 μl와 십분 마음을 세 번 씻으십시오. 세척 단계에 걸쳐 적용 샘플을 보관. </li><li> 트리톤 - X - 100의 제거를위한 10 분 동안 PBS 100 μl의 마음에게 마지막 시간을 씻어. 표본은 설치하기 전에 며칠 동안 4 ° C에서 어둠에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 성인 하츠 장착 <ol><li> Vectashield 설치 매체의 10 μl와 현미경 슬라이드에 두 18 X 18mm 커버 전표를 준수합니다. coverslips는 ~ 10~15밀리미터 분리 간격해야합니다. 두 coverslips 사이에 매체를 장착의 작은 제 3 방울을 넣으십시오. </li><li> 삼분의 일 coverslip의 중심에 Vectashield 20 μl를 놓습니다. </li><li> 조심스럽게 표피의 극단적인 가장자리 PBS 세척 솔루션의 마음을 각각 제거하고 부드럽게 세 번째 coverslip에 장착 매체의 드롭에 그들 가슴 쪽을 놓으십시오. coverslip에 드롭 당 채 5 마음을 놓으십시오. </li><li> 모든 마음은 아래로 향하게 수 있도록하기 위해 현미경으로 확인합니다. </li><li> 조심스럽게 마음을 포함하는 coverslip을 반전하고 신속하게 coverslips의 쌍을 포함하는 등 그 coverslip 쌍 사이의 Vectashield의 ​​비말과 심장 튜브의 퓨즈로 비말. 슬라이드에 배치 &quot;다리&quot;가 coverslips에 의해 형성되어야합니다. 마음은 coverslip과 현미경 슬라이드 사이에 일시 중지됩니다. </li><li> 그 마음은 지금 상승세를 직면하기 위해 현미경으로 확인합니다. </li><li> 매니큐어 그들의 가장자리에 coverslips을 수정. </li><li> 마음은 이제 형광등이나 공촛점 현미경을 통해 몇 군데 준비하고 있습니다. </li></ol><ol><li> 현미경 슬라이드에 한 방울 (~ 20 μl) Vectashield를 놓습니다. </li><li> 조심스럽게 텅스텐 바늘을 사용하여 다운 Vectashield과 동양들을 등의 측면 두개의 애벌레 표본까지 전송할 수 있습니다. </li><li> 개별적으로 설치 매체의 표본을 드래그 병렬로 각각 정렬합니다. </li><li> 표본의 측면에 반대에 coverslip 놓으십시오. 포셉를 사용하여 사후 coverslip에 한쪽을 세우고 있으므로 다리를 형성 앞쪽에 coverslip에 아래로 낮추는 방법으로 먼저, 상단에 삼분의 일 coverslip을 놓으십시오. 모세관 세력은 애벌레 마음의 적절한 정렬을하는 데 도움이 앞쪽이 후부에서 Vectashield의 ​​흐름을 발생합니다. </li><li> 매니큐어와, 그들의 가장자리에서, 장소에있는 모든 coverslips를 수정하고 조심스럽게 20-30 μl Vectashield와 coverslips 사이의 공간을 채우십시오. </li><li> 4 매니큐어 및 저장과 인감 ° C 또는 -20 ° C.에 장기 저장을 위해 </li></ol> 대표 결과 제대로 실행되면, 모든 구성 요소와 지느러미 선박의 관련 조직은 그대로 유지하고 쉽게 시각되어야합니다. 배경 형광을 최소화해야합니다. 잘 성인, 복부 세로 근육 계층 얼룩과 상당한 신호 (그림 1 및 그림 2)을 생산하고 있습니다. 기본 원형 cardiomyocytes 그러나, overlying 복부 레이어의 같은 강한 신호로 생성하지 않는 경향이 있습니다. 성인 심장의 앞쪽에 &quot;원뿔 회의소&quot;의 myocytes는 수축성 물질의 상당한 금액을 포함하고, 그 결과,이 지역은 심장 튜브의 나머지 부분에 가장 강력한 상대으로 나타납니다. 애벌레 심장은 성인 수축성 cardiomyocytes (그림 3)의 비슷한 나선형 myofibrillar 배치를 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/1423/1423fig1atmb.jpg" alt="그림 1A" border="0" /> <img src="/files/ftp_upload/1423/1423fig1btmb.jpg" border="0" alt="그림 1B" /> 그림 1 : 탑. 마이 오신 - GFP를 표현 성인 Drosophila melanogaster의 전체 심장병 튜브를 보여주는 형광 현미경. 이미지가 Apotome 슬라이딩 모듈이 장착된 자이스 혈구 영상기 Z1 형광 현미경으로 찍은. 마이 오신 - GFP는 녹색으로 표시됩니다, 굴지이 AlexaFluor ® 594 phalloidin (적색)과 α - actinin 물들일있다는 반 α - actinin 항체 (파란색)으로 표시됩니다. 예비 절차가 잘 보존된 구조 심장 샘플 복구를 허용합니다. CC = 원뿔 챔버, AM = alary 근육, V = 내부 밸브; VLL = 복부 세로 근육 층. 바텀. 단지 수축성 cardiomyocytes의 나선형 myofibril 배치를 보여주는 배면의 길이 레이어 아래의 중심부에 3 복부 세그먼트를 통해 CC에서 성인 심장병 튜브의 영역입니다. 하시기 바랍니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1423/1423fig1a.jpg">여기를 클릭</a> 그림 1A의 더 큰 버전을 위해, 그리고 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1423/1423fig1b.jpg">여기에</a> 그림 1B의 큰 버전에 대한 <img border="0" src="/files/ftp_upload/1423/1423fig2tmb.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2 : AlexaFluor ® 594 phalloidin (적색)과 안티 Pericardin (콜라겐 유형 IV) (녹색) 항체 물들일 성인 심장의 앞쪽에 부분을 대표 공촛점 스택. Pericardin 가능성이 복부 근육 계층의 길이 방향 중심 myofibrils에서 발생, 복부 표면을 따라 마음으로 연결됩니다. 하시기 바랍니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1423/1423fig2.jpg">여기를 클릭</a> 그림 2의 더 큰 버전을 위해. <img border="0" src="/files/ftp_upload/1423/1423fig3tmb.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3 : 무대 세 Drosophila의 유충의 적절한 마음의 세그먼트 A7의 형광 현미경. 이미지가 Apotome 슬라이딩 모듈이 장착된 자이스 혈구 영상기 Z1 형광 현미경으로 찍은. 굴지이 AlexaFluor ® 594 phalloidin (녹색)과 α - actinin과 함께 표시됩니다은 안티 - α - actinin 항체 (적색) 물들일 것입니다. 하시기 바랍니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1423/1423fig3.jpg">여기를 클릭</a> 그림 3의 더 큰 버전을 위해.

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여기서 우리는 Drosophila melanogaster의 지느러미 선박 및 형광 또는 공촛점 현미경을 통해 이미지를위한 관련 조직을 준비하고 얼룩을위한 유용한 프로토콜을 제시한다. 우리도 세련되고 일반적으로 애벌레와 어른 Drosophila의 심장 튜브의 현장 이미지에 잘 해결을 허용 효과적으로 얼룩을 위해 우리가 실험실에서 고용 단계 간결한 계정을 제공합니다. 기타 약식 형태로 2, 3, 4?...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Ethylene glycol-bis (2-amino-ethylether) -N,N,N&#x2019;,N&#x2019;-tetra-acetic acid (EGTA)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich&reg;</td>
<td>E4378</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure</td>
<td>Reagent</td>
<td>Polysciences Inc.</td>
<td>50-00-0</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton-X-100</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich&reg;</td>
<td>9002-93-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Alexa Fluor&reg; 594 phalloidin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen&trade;</td>
<td>A12381</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vectashield&reg; Mounting Medium for Fluorescence with DAPI</td>
<td>Reagent</td>
<td>Vector Laboratories, Inc.</td>
<td>H-1200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tungsten pins</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>26002-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pin holder</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>26018-17</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

fluorescent labeling of drosophila heart structures

<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; 등의 혈관이나 심장 수축성 cardiomyocytes, 성인에서 심장 벽, 지원 alary의 근육과, 복부 세로 근육 세포의 레이어의 각 측면을 따라 정렬 pericardial 세포의 단일 레이어로 구성된 관형 구조입니다. 수축성 섬유의 집 myofibrils과 세포외 기질의 구성 요소와 상호 작용하는 동종 cytoskeletal / submembranous 단백질 단지의 밀도가 높은 포장 번들을 포함하여 근육 cytoarchitecture의 성분을 보존. 여기를 해부 애벌레와 준 그대로 성인의 마음에서 고정 특히 심근 원소의 형광 라벨을위한 프로토콜을 설명<em&gt; Drosophila</em&gt;. 특히, 우리는 애벌레 마음에 F - 굴지 sarcomeric 및 α - actinin의 라벨을 보여줍니다. 또한, 우리는 야생의 유형 성인의 마음에 성인 파리를 표현하고 α - actinin과 pericardin, 유형 IV 세포외 기질의 콜라겐 마이 오신 - GFP에서 F - 굴지과 α - actinin의 라벨 수행합니다. 특히주의는 취급을 최소화하고 심장병 튜브 및 관련 조직의 무결성을 유지하기위한 기회를 최적화 세미 그대로 성인의 마음에 마운트 전략에 주어집니다. 이러한 준비는 형광 및 공촛점 현미경을 통해 이미지에 적합합니다. 전반적으로,이 절차는 강력한 유전자 다루기 쉬운 모델 시스템에서 심장의 구조적 특성주의하고 자세한 분석을 위해 수 있습니다.

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Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

여기 우리는 유충과 성인에서 심장 튜브의 다양한 요소의 형광 라벨을위한 기본 프로토콜을 설명<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;. 이러한 표본은 형광등이나 공촛점 현미경을 통해 이미지에 적합합니다. 이 기술은 강력한 모델 유기체에서 마음의 기능의 세부 구조 분석을 수 있습니다.

의 형광 라벨링 Drosophila 심장 구조

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

13.6K 조회수.  San Diego State University. 여기 우리는 유충과 성인에서 심장 튜브의 다양한 요소의 형광 라벨을위한 기본 프로토콜을 설명 Drosophila melanogaster. 이러한 표본은 형광등이나 공촛점 현미경을 통해 이미지에 적합합니다. 이 기술은 강력한 모델 유기체에서 마음의 기능의 세부 구조 분석을 수 있습니다.

비디오: Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

광학 이미징과 비침습 감지를위한 형광 염료와 함께 줄기 세포를 라벨링

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

연구

생물학

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle synapses, we developed a larval tissue preparation that had features of live intact larvae, but also had good optical properties.  This new preparation also allowed for access of perfusates to the synapse.  We used fly larvae, immersed them in artificial hemolymph, and relaxed their normal rhythmic body contractions by chilling them. Next we dissected off the posterior segments of each animal and with a blunt insect pin pushed the mouth parts backward through the body cavity.  This everted the larval body wall, like turning a sock inside-out.  We completed the dissection with ultra-fine dissection scissors and thus exposed the visceral side of the body wall muscles. The glial structures at the NMJ expressed membrane targeted GFP under the control of glial specific promoters. The post-synaptic membrane, the SSR (Subsynaptic Reticula) in muscle expressed synaptically targeted dsRed. We needed to acutely label the motor neuron terminals, the third part of the synapse. To do this we applied primary antibodies to HRP, conjugated to a far-red emitting flurophore.  To test for dye diffusion properties into the perisynaptic space between the motor neuron terminals and the SSR, we applied a solution of large Dextran molecules conjugated to far-red emitting flurophore and collected images.

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

We described structural features of the Glia-neuromuscular synapses in a novel Inside-out tissue preparation of live fly larvae using fluorescent dyes with confocal microscopy. We labeled live neuron terminals with fluorescent primary antibodies to HRP, and also visualized the perisynaptic space with fluorescent Dextrans.

라이브를 떠올리 Drosophila</em형광 염료와 함께> Glial - 신경근육학 융티온

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle ...

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in myogenic hearts. A key step in examining heart function in the fly is finding a way to access the heart in a manner that preserves its myogenic function while still allowing the beating heart organ to be observed and recorded. Two different methods for observing and recording the beating heart in both larva and adult Drosophila are described here. Our semi-intact preparation using adult flies allows clear visualization of the abdominal heart without interference from the pigmented cuticle and overlying fat bodies. To record larval heart beats it is necessary to immobilize the larva, which minimizes body wall movements thereby reducing heart movements that are not associated with myocardial contractions. Our methodologies produce stable adult and larval heart preparations that can beat for hours at rates of 1-3 Hz.

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Technique required for visualizing the beating heart in larval and adult Drosophila are presented. Each life stage requires a different methodology.

에 잔 심장을 떠올리 Drosophila</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained and restrained whole larvae. For direct control of the environment around the heart another approach utilizes the dissected larvae and removal of the internal organs in order to bathe the heart in desired compounds. The exposed heart also allows membrane potentials to be monitored which can give insight of the ionic currents generated by the myocytes and for electrical conduction along the heart tube. These approaches have various advantages and disadvantages for future experiments that are discussed. The larval heart preparation provides an additional model besides the Drosophila skeletal NMJ to investigate the role of intracellular calcium regulation on cellular function. Learning more about the underlying ionic currents that shape the action potentials in myocytes in various species, one can hope to get a handle on the known ionic dysfunctions associated to specific genes responsible for various diseases in mammals.

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various ways to monitor heart function in the larva of Drosophila for assessing questions dealing with the function of gap junctions, ion channel mutations, modulation of pacemaker activity and pharmacological studies.

애벌레의 모니터링 심장​​ 기능 Drosophila melanogaster 생리 연구

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

의 전자 현미경을위한 배아의 준비 Drosophila 태아의 심장 관

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological advantages provided by the giant salivary gland polytene chromosomes of third instar larvae.  In this tissue the chromosomes undergo many rounds of replication in the absence of cell division giving rise to approximately 1000 copies.  The DNA remains aligned after each replicative cycle resulting in greatly enlarged chromosomes that provide a unique opportunity to correlate chromatin morphology with the localization of specific proteins.  Consequently, there has been a high level of interest in defining the epigenetic modifications present at different genes and at different stages of the transcription process. An important tool for such studies is the labeling of polytene chromosomes with antibodies to the enzyme, transcription factor, or histone modification of interest. This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

항체 라벨링에 대한 Drosophila Polytene의 염색체 Squashes의 준비

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. These systems offer a broad selection of fluorescent substrates optimized for a range of imaging instrumentation. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again. There are two steps to using this system: cloning and expression of the protein of interest as a SNAP-tag fusion, and labeling of the fusion with the SNAP-tag substrate of choice. The SNAP-tag is a small protein based on human O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), a DNA repair protein. SNAP-tag labels are dyes conjugated to guanine or chloropyrimidine leaving groups via a benzyl linker. In the labeling reaction, the substituted benzyl group of the substrate is covalently attached to the SNAP-tag. CLIP-tag is a modified version of SNAP-tag, engineered to react with benzylcytosine rather than benzylguanine derivatives. When used in conjunction with SNAP-tag, CLIP-tag enables the orthogonal and complementary labeling of two proteins simultaneously in the same cells.

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again.

COS - 7 형광 라벨링는 라이브 셀 이미징에 대한 SNAP - 태그 퓨전 단백질 표현

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

전체 마운트 RNA 형광<em&gt; 현장에서</em의&gt; 하이브리드<em&gt; Drosophila</em&gt; 태아

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

형광 단백질을 표현 라이브 마우스의 이미징 세포 이하의 구조물의 intravital 현미경

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical coherence microscopy (OCM) has been demonstrated to be capable of imaging small animal hearts with high spatial resolution and ultrahigh imaging speed. The high image contrast and noninvasive properties make OCM ideal for performing longitudinal studies without requiring tissue dissections or staining. Drosophila has been widely used as a model organism in cardiac developmental studies due to its high number of orthologous human disease genes, its similarity of molecular mechanisms and genetic pathways with vertebrates, its short life cycle, and its low culture cost. Here, the experimental protocols are described for the preparation of Drosophila and optical imaging of the heartbeat with a custom OCM system throughout the life cycle of the specimen. By following the steps provided in this report, transverse M-mode and 3D OCM images can be acquired to conduct longitudinal studies of the Drosophila cardiac morphology and function. The en face and axial sectional OCM images and the heart rate (HR) and cardiac activity period (CAP) histograms, were also shown to analyze the heart structural changes and to quantify the heart dynamics during Drosophila metamorphosis, combined with the videos constructed with M-mode images to trace cardiac activity intuitively. Due to the genetic similarity between Drosophila and vertebrates, longitudinal study of heart morphology and dynamics in fruit flies could help reveal the origins of human heart diseases. The protocol here would provide an effective method to perform a wide range of studies to understand the mechanisms of cardiac diseases in humans.

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy OCM

Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.

초파리 준비 및 빛 간섭 현미경을 사용하여 생체 내에서 심장 기능의 세로 이미징 (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical ...