המחברים מודים SI ברנשטיין (סן דייגו סטייט) לקריאה ביקורתית הצעות מועילות לגבי הכנת כתב היד הזה. עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקים SI ברנשטיין, SDSU, וכן ר בודמר, BIMR, ועל ידי אחווה פוסט דוקטורט מ שותפים המערבי הברית של איגוד הלב האמריקני אל G. Vogler ו א Cammarato.

<html> לפני שתתחיל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרונות הבאים: <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיץ מרגיע (מלאכותי תסיסנית hemolymph (ADH) (ראה &quot;לדמיין את הלב הפועם תסיסנית&quot;) המכיל 10 mM EGTA) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקבע (פורמלין 4% 1x PBS) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PBSTx (PBS המכיל 0.1% Triton-X-100) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל כראוי נוגדנים ראשוניים מינים ספציפיים משני שכותרתו fluorescently ב PBSTx </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח תסיסנית לחשוף את צינורות הלב (של זבובים בוגרים ו / או זחלים) הבא <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חצי שלם הכנה תסיסנית לב פרוטוקול &quot;לדמיין את הלב הפועם תסיסנית&quot;, או </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תסיסנית הזחל NMJ Dissection פרוטוקול 1 בשינויים הבאים: השתמש מחומצן ADH במהלך דיסקציה הזחל וכן לעקור את הסיכה האחורי מעט קו האמצע הגחון. הזחלים נחתכים לאורך קו האמצע הגחון. אין להסיר את כל רקמת לפני קיבעון. </li></ol></li></ol> פלורסנט מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק כי כל הלבבות הם בקצב פועם ADH מחומצן. מהר להחליף ADH עם מרגיעה חיץ. לבחון כל צינור לב כדי להבטיח התכווצויות מעוכבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את ליבם על ידי החלפת חיץ מרגיע עם מקבע. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות עם רעד עדין. (לקבלת לוחץ הכנה הזחל אין צורך בשלב כלשהו, ​​יכולה להיחשב מזיק שלמות רקמת לב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף דגימות שלוש פעמים במשך עשר דקות עם PBSTx בטמפרטורת החדר עם רעד מתמשך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למבוגרים, בזהירות לקצץ שוב את הקצוות הגחון של לציפורן בטן כזאת מה שנותר הוא אליפטי יותר מעוגל פחות. בנוסף, עם חתך בודד בין הבטן לבין בית החזה, בזהירות למשעי נפרדים בשני מגזרים הגוף להבטיח נזק מינימלי באזור הקדמי של הלב. עבור לבבות הזחל, בזהירות להסיר את השומן בגוף באמצעות מלקחיים בסדר. הסרת שומן חייב להתבצע בזהירות רבה, שכן לב הזחל הוא שברירי במיוחד ויש לו תמיכה מועטה מאוד שרירים אחרים או רקמת חיבור. אין להסיר את הענפים קנה הנשימה כמו זה עלול לגרום נזק ללב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את אזור הגב גזוז לציפורן של הבטן על ידי הקצוות, הימנעות ממגע עם הצינור לב במיקום מרכזי, לתוך צלחת 96 היטב עם בארות המכילים 50-100 μl של נוגדן ראשוני מדולל PBSTx. המקום לא יותר מ 12 דגימות בכל טוב. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות עם תסיסה מתמדת. דגירה יכול להיעשות גם בין לילה ב -4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון נוגדן ראשוני. לשטוף את הלבבות שלוש פעמים במשך עשר דקות עם PBSTx 100 μl בטמפרטורת החדר עם רעד מתמשך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות הסרת החיץ לשטוף הסופי, להוסיף 100 μl של נוגדנים משני PBSTx, בתוספת Alexa594-phalloidin (1:1000). דגירה במשך שעה אחת עם רעד מתמשך בטמפרטורת החדר. שמור דגימות מכוסה כדי למנוע הלבנת fluorophore. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה משנית, לשטוף את הלבבות שלוש פעמים במשך עשר דקות עם 100 μl של PBSTx בטמפרטורת החדר עם רעד מתמשך. שמור את דגימות מכוסה בכל הצעדים כביסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למען הסר של טריטון-X-100, יש לשטוף את ליבם בפעם האחרונה בשנת 100 μl של PBS למשך 10 דקות. דגימות ניתן לאחסן בחושך על 4 מעלות צלזיוס במשך כמה ימים לפני הרכבה. </li></ol> הרכבה של לבבות למבוגרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציית two 18 x 18 מ&quot;מ מכסה מחליק כדי להחליק מיקרוסקופ עם 10 μl של המדיום Vectashield גובר. Coverslips צריכה להיות מחולקת ~ 10-15 מ&quot;מ זה מזה. המקום טיפה קטנה של third הרכבה בינונית, בין שתי coverslips. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 20 μl של Vectashield במרכז coverslip שלישי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להסיר כל הלבבות מפתרון לשטוף PBS על ידי הקצוות הקיצוניים של לציפורן, ומניחים בעדינות להם לב בצד למטה על ירידה של המדיום גובר על coverslip השלישי. המקום לא יותר מחמישה לבבות לכל טיפה על coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח לבבות כל פונה כלפי מטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להפוך את coverslip המכיל את הלבבות במהירות למקם אותו על השקופית המכילה את צמד coverslips כזה אגל עם נתיכים צינורות לב עם אגל Vectashield בין זוג coverslip. &quot;גשר&quot; צריך להיות שנוצר על ידי coverslips. לבבות יושעה בין coverslip לבין שקופיות מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח ליבם כי הם עכשיו פונה כלפי מעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן coverslips בקצוות שלהם עם לק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבבות מוכנים כעת להיות צילמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי או confocal. </li></ol>ילדה = &quot;jove_title&quot;&gt; הרכבה עבור לבבות הזחל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום טיפה (~ 20 μl) Vectashield בשקופית מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר בזהירות עד שתי דגימות הזחל אל צד להם Vectashield ו להתמצא הגב למטה באמצעות מחטים טונגסטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנפרד לגרור את דגימות מתוך המדיום הרכבה וליישר כל במקביל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים coverslip על צדדים מנוגדים של הדגימה. בעזרת מלקחיים, במקום השלישי coverslip העליון, תחילה על ידי הנחת צד אחד על coverslip האחורי והורדת אותו עד coverslip הקדמי ובכך ליצור גשר. כוחות נימי יגרום לזרימת Vectashield מן האחורי אל הקדמי אשר מסייע יישור תקין של הלב הזחל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן כל coverslips במקום, בקצוות שלהם, עם לק בזהירות למלא את החלל בין coverslips עם Vectashield 20-30 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם עם לק ולאחסן ב 4 ° C, או לצורך אחסון לטווח ארוך ב -20 ° C. </li></ol> נציג תוצאות כאשר מבוצע כראוי, את כל המרכיבים והרקמות הקשורים כלי הגבי צריך להישאר שלם להיות דמיינו בקלות. הקרינה רקע צריך להיות מינימלי. למבוגרים, הגחון האורך שכבת השריר כתמים היטב מייצר אות ממשי (איור 1 ואיור 2). Cardiomyocytes מעגלי הבסיסית לעומת זאת, נוטים שלא להפיק אות אינטנסיבי כמו זה של השכבה שמעליה הגחון. Myocytes של &quot;תא חרוטי&quot; הקדמי של הלב למבוגרים מכילים כמות משמעותית של חומר כויץ, וכתוצאה מכך, האזור הזה מופיע ביחס החזקה ביותר שארית הצינור לב. הלב הזחל מראה ההסדר מתפתלת myofibrillar דומה לזה של cardiomyocytes כויץ מבוגר (איור 3). <img src="/files/ftp_upload/1423/1423fig1atmb.jpg" alt="איור 1a" border="0" /> <img src="/files/ftp_upload/1423/1423fig1btmb.jpg" border="0" alt="איור 1b" /> איור 1: למעלה. מיקרוסקופ פלואורסצנטי מראה את הצינור כולו לב של מבוגר תסיסנית melanogaster המבטא שרירן-GFP. התמונה צולמה עם מיקרוסקופ Imager Z1 Zeiss פלורסנט מצויד מודול הזזה Apotome. שרירן-GFP מוצג בירוק, אקטין הוא מוכתם AlexaFluor ® 594 phalloidin (אדום) α-actinin מתויג עם נוגדן אנטי-α actinin (כחול). הערה הליך preparative היתרי התאוששות של דגימות לב עם המבנים השתמרו היטב. CC = חרוטי קאמרית: AM = שריר כנפי: V = שסתום פנימי; VLL = שריר הגחון שכבת האורך. בוטום. באזור של הצינור לב מבוגר מ CC דרך קטע הבטן 3 הלב פשוט מתחת לשכבת אורך הגחון מראה את ההסדר מתפתלת myofibril של cardiomyocytes התכווצות. אנא <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1423/1423fig1a.jpg">לחץ כאן</a> עבור גרסה גדולה יותר של איור 1a ו <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1423/1423fig1b.jpg">כאן</a> עבור גרסה גדולה יותר של דמות 1b <img border="0" src="/files/ftp_upload/1423/1423fig2tmb.jpg" alt="איור 2" /> איור 2: ערימות confocal נציג החלק הקדמי של הלב המבוגר מוכתם AlexaFluor ® 594 phalloidin (אדום) אנטי Pericardin (קולגן מסוג IV) (ירוק) נוגדן. Pericardin קשורה בלב פני השטח הגחון, סביר להניח שמקורו myofibrils אוריינטציה longitudinally של שכבת השריר הגחון. אנא <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1423/1423fig2.jpg">לחץ כאן</a> עבור גרסה גדולה יותר של הדמות 2. <img border="0" src="/files/ftp_upload/1423/1423fig3tmb.jpg" alt="איור 3" /> איור 3: מיקרוסקופ פלואורסצנטי של קטע A7 הלב התקין של הזחל שלושה שלבים תסיסנית. התמונה צולמה עם מיקרוסקופ Imager Z1 Zeiss פלורסנט מצויד מודול הזזה Apotome. אקטין התווית AlexaFluor ® 594 phalloidin (ירוק) ו α-actinin הוא מוכתם נוגדן אנטי-α actinin (אדום). אנא <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1423/1423fig3.jpg">לחץ כאן</a> עבור גרסה גדולה יותר של הדמות 3.

<ol>
	<li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+NMJ+dissection.">Drosophila larval NMJ dissection.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Molina, M. R., Cripps, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ostia,+the+inflow+tracts+of+the+Drosophila+heart,+develop+from+a+genetically+distinct+subset+of+cardial+cells.">Ostia, the inflow tracts of the Drosophila heart, develop from a genetically distinct subset of cardial cells.</a> Mech Dev. 1, 51-59 (2001).</li><li>Dulcis, D., Levine, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamatergic+innervation+of+the+heart+initiates+retrograde+contractions+in+adult+Drosophila+melanogaster.">Glutamatergic innervation of the heart initiates retrograde contractions in adult Drosophila melanogaster.</a> J Neurosci. 2, 271-280 (2005).</li><li>Zeitouni, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+pathways+involved+in+adult+heart+formation+revealed+by+gene+expression+profiling+in+Drosophila.">Signalling pathways involved in adult heart formation revealed by gene expression profiling in Drosophila.</a> PLoS Genet. 10, 1907-1921 (2007).</li><li>Robertson, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster,+including+an+accurately+timed+account+of+the+principal+morphological+change.">The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological change.</a> J. Morphol. 2, 351-399 (1936).</li><li>Miller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. , (1950).</li><li>Rizki, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+circulatory+system+and+associated+cells+and+tissues.">The circulatory system and associated cells and tissues.</a> , (1978).</li><li>Cammarato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+transducer+mutations+differentially+affect+motor+function,+myofibril+structure,+and+the+performance+of+skeletal+and+cardiac+muscles.">Myosin transducer mutations differentially affect motor function, myofibril structure, and the performance of skeletal and cardiac muscles.</a> Mol Biol Cell. 2, 553-562 (2008).</li><li>Taghli-Lamallem, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+deficiency+in+Drosophila+reduces+lifespan+and+causes+a+dilated+cardiomyopathy+phenotype.">Dystrophin deficiency in Drosophila reduces lifespan and causes a dilated cardiomyopathy phenotype.</a> Aging Cell. 2, 237-249 (2008).</li><li>Kelso, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+database+documenting+a+GFP+protein-trap+insertion+screen+in+Drosophila+melanogaster.">a database documenting a GFP protein-trap insertion screen in Drosophila melanogaster.</a> Nucleic Acids Res. 32, D418-D420 (2004).</li><li>Dietzl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+transgenic+RNAi+library+for+conditional+gene+inactivation+in+Drosophila.">A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila.</a> Nature. 7150, 151-156 (2007).</li><li>Mery, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+muscle+LIM+protein,+Mlp84B,+is+essential+for+cardiac+function.">The Drosophila muscle LIM protein, Mlp84B, is essential for cardiac function.</a> J Exp Biol. 211, 15-23 (2008).</li></ol>

כאן אנו מציגים פרוטוקול שימושי עבור הכנת מכתים את כלי melanogaster תסיסנית הגב ורקמות הקשורים עבור דימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי או confocal. אנו מספקים דיווח תמציתי על הפעולות מעודן על ידי והעסיק נפוץ מכתים יעיל המאפשר היטב נפתרה הדמיה באתרו של הזחל והמ?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Ethylene glycol-bis (2-amino-ethylether) -N,N,N&#x2019;,N&#x2019;-tetra-acetic acid (EGTA)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich&reg;</td>
<td>E4378</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure</td>
<td>Reagent</td>
<td>Polysciences Inc.</td>
<td>50-00-0</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton-X-100</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich&reg;</td>
<td>9002-93-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Alexa Fluor&reg; 594 phalloidin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen&trade;</td>
<td>A12381</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vectashield&reg; Mounting Medium for Fluorescence with DAPI</td>
<td>Reagent</td>
<td>Vector Laboratories, Inc.</td>
<td>H-1200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tungsten pins</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>26002-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pin holder</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>26018-17</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

fluorescent labeling of drosophila heart structures

<em&gt; תסיסנית melanogaster</em&gt; כלי הגבי, או לב, הוא מבנה צינורי מורכבת בשכבה אחת של cardiomyocytes כויץ, תאים קרום הלב כי ליישר משני צדי הקיר הלב, השרירים כנפי תומכת, אצל מבוגרים, שכבת הגחון לתאי שריר האורך. בית סיבי התכווצות שימור מרכיבי cytoarchitecture השריר כולל חבילות בצפיפות של myofibrils ו קומפלקסים חלבונים cytoskeletal / submembranous, אשר אינטראקציה עם הומולוגיים הרכיבים של המטריצה ​​תאיים. כאן אנו מתארים פרוטוקול קיבעון ואת תיוג פלורסנט של אלמנטים שריר הלב בפרט מלב הזחלים גזור למחצה שלם מבוגר<em&gt; תסיסנית</em&gt;. באופן ספציפי, אנחנו מדגימים את התיוג של sarcomeric F-אקטין של α-actinin בלב הזחל. בנוסף, אנו מבצעים תיוג של ה-F-אקטין α-actinin שרירן ב-GFP להביע זבובים בוגרים של α ו-actinin pericardin, סוג IV תאי מטריקס קולגן, בלב מבוגר בר סוג. תשומת לב מיוחדת ניתנת אסטרטגיה הרכבה למחצה שלם לבבות מבוגר זה ממזער טיפול מייעל את ההזדמנות לשמירה על שלמות הצינורות לב הרקמות קשור. תכשירים אלה מתאימים עבור דימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal. ככלל, הליך זה מאפשר ניתוח זהיר ומפורט של מאפיינים מבניים של הלב ממערכת מודל גנטי חזק צייתן.

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures at JoVE.com

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

כאן אנו מתארים פרוטוקול בסיסי תיוג הניאון של אלמנטים שונים של צינורות הלב של הזחל והמבוגר<em&gt; תסיסנית melanogaster</em&gt;. דגימות אלו הן היטב מתאים דימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי או confocal. טכניקה זו מאפשרת ניתוח מבני מפורט של התכונות של לבבות מן אורגניזם מודל עוצמה.

תיוג של פלורסנט תסיסנית לב מבנים

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells ...

fluorescent-labeling-of-drosophila-heart-structures

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

13.6K Views.  San Diego State University. כאן אנו מתארים פרוטוקול בסיסי תיוג הניאון של אלמנטים שונים של צינורות הלב של הזחל והמבוגר תסיסנית melanogaster. דגימות אלו הן היטב מתאים דימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי או confocal. טכניקה זו מאפשרת ניתוח מבני מפורט של התכונות של לבבות מן אורגניזם מודל עוצמה....

Video: Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

תיוג בתאי גזע עם צבעי ניאון על איתור פולשני עם דימות אופטי

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle synapses, we developed a larval tissue preparation that had features of live intact larvae, but also had good optical properties.  This new preparation also allowed for access of perfusates to the synapse.  We used fly larvae, immersed them in artificial hemolymph, and relaxed their normal rhythmic body contractions by chilling them. Next we dissected off the posterior segments of each animal and with a blunt insect pin pushed the mouth parts backward through the body cavity.  This everted the larval body wall, like turning a sock inside-out.  We completed the dissection with ultra-fine dissection scissors and thus exposed the visceral side of the body wall muscles. The glial structures at the NMJ expressed membrane targeted GFP under the control of glial specific promoters. The post-synaptic membrane, the SSR (Subsynaptic Reticula) in muscle expressed synaptically targeted dsRed. We needed to acutely label the motor neuron terminals, the third part of the synapse. To do this we applied primary antibodies to HRP, conjugated to a far-red emitting flurophore.  To test for dye diffusion properties into the perisynaptic space between the motor neuron terminals and the SSR, we applied a solution of large Dextran molecules conjugated to far-red emitting flurophore and collected images.

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

We described structural features of the Glia-neuromuscular synapses in a novel Inside-out tissue preparation of live fly larvae using fluorescent dyes with confocal microscopy. We labeled live neuron terminals with fluorescent primary antibodies to HRP, and also visualized the perisynaptic space with fluorescent Dextrans.

לדמיין את חיים תסיסנית גליה-neuromuscular צומת עם צבעי ניאון

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle ...

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in myogenic hearts. A key step in examining heart function in the fly is finding a way to access the heart in a manner that preserves its myogenic function while still allowing the beating heart organ to be observed and recorded. Two different methods for observing and recording the beating heart in both larva and adult Drosophila are described here. Our semi-intact preparation using adult flies allows clear visualization of the abdominal heart without interference from the pigmented cuticle and overlying fat bodies. To record larval heart beats it is necessary to immobilize the larva, which minimizes body wall movements thereby reducing heart movements that are not associated with myocardial contractions. Our methodologies produce stable adult and larval heart preparations that can beat for hours at rates of 1-3 Hz.

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Technique required for visualizing the beating heart in larval and adult Drosophila are presented. Each life stage requires a different methodology.

לדמיין את הלב הפועם תסיסנית</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained and restrained whole larvae. For direct control of the environment around the heart another approach utilizes the dissected larvae and removal of the internal organs in order to bathe the heart in desired compounds. The exposed heart also allows membrane potentials to be monitored which can give insight of the ionic currents generated by the myocytes and for electrical conduction along the heart tube. These approaches have various advantages and disadvantages for future experiments that are discussed. The larval heart preparation provides an additional model besides the Drosophila skeletal NMJ to investigate the role of intracellular calcium regulation on cellular function. Learning more about the underlying ionic currents that shape the action potentials in myocytes in various species, one can hope to get a handle on the known ionic dysfunctions associated to specific genes responsible for various diseases in mammals.

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various ways to monitor heart function in the larva of Drosophila for assessing questions dealing with the function of gap junctions, ion channel mutations, modulation of pacemaker activity and pharmacological studies.

ניטור הלב לתפקד הזחל תסיסנית melanogaster ללימודים פיזיולוגיים

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

הכנת עוברים אלקטרונים מיקרוסקופית של תסיסנית לב עוברי צינור

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological advantages provided by the giant salivary gland polytene chromosomes of third instar larvae.  In this tissue the chromosomes undergo many rounds of replication in the absence of cell division giving rise to approximately 1000 copies.  The DNA remains aligned after each replicative cycle resulting in greatly enlarged chromosomes that provide a unique opportunity to correlate chromatin morphology with the localization of specific proteins.  Consequently, there has been a high level of interest in defining the epigenetic modifications present at different genes and at different stages of the transcription process. An important tool for such studies is the labeling of polytene chromosomes with antibodies to the enzyme, transcription factor, or histone modification of interest. This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

הכנת מועכת תסיסנית Polytene כרומוזום עבור סימון נוגדן

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. These systems offer a broad selection of fluorescent substrates optimized for a range of imaging instrumentation. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again. There are two steps to using this system: cloning and expression of the protein of interest as a SNAP-tag fusion, and labeling of the fusion with the SNAP-tag substrate of choice. The SNAP-tag is a small protein based on human O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), a DNA repair protein. SNAP-tag labels are dyes conjugated to guanine or chloropyrimidine leaving groups via a benzyl linker. In the labeling reaction, the substituted benzyl group of the substrate is covalently attached to the SNAP-tag. CLIP-tag is a modified version of SNAP-tag, engineered to react with benzylcytosine rather than benzylguanine derivatives. When used in conjunction with SNAP-tag, CLIP-tag enables the orthogonal and complementary labeling of two proteins simultaneously in the same cells.

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again.

תיוג פלורסנט של COS-7-SNAP הבעת תג חלבונים Fusion עבור דימות תא חי

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

הר כולו RNA פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

מיקרוסקופית Intravital למבני ההדמיה subcellular בעכברים חיים לבטא חלבוני פלורסנט

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical coherence microscopy (OCM) has been demonstrated to be capable of imaging small animal hearts with high spatial resolution and ultrahigh imaging speed. The high image contrast and noninvasive properties make OCM ideal for performing longitudinal studies without requiring tissue dissections or staining. Drosophila has been widely used as a model organism in cardiac developmental studies due to its high number of orthologous human disease genes, its similarity of molecular mechanisms and genetic pathways with vertebrates, its short life cycle, and its low culture cost. Here, the experimental protocols are described for the preparation of Drosophila and optical imaging of the heartbeat with a custom OCM system throughout the life cycle of the specimen. By following the steps provided in this report, transverse M-mode and 3D OCM images can be acquired to conduct longitudinal studies of the Drosophila cardiac morphology and function. The en face and axial sectional OCM images and the heart rate (HR) and cardiac activity period (CAP) histograms, were also shown to analyze the heart structural changes and to quantify the heart dynamics during Drosophila metamorphosis, combined with the videos constructed with M-mode images to trace cardiac activity intuitively. Due to the genetic similarity between Drosophila and vertebrates, longitudinal study of heart morphology and dynamics in fruit flies could help reveal the origins of human heart diseases. The protocol here would provide an effective method to perform a wide range of studies to understand the mechanisms of cardiac diseases in humans.

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy OCM

Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.

הכנת תסיסנית והדמיה אורכית תפקוד הלב in vivo באמצעות מיקרוסקופית קוהרנטיות אופטית (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical ...