نشكر الدكتور نقولا Wiethölter لإعداد وتلون 1 مد المواد الهلامية. وقد تم تمويل هذا العمل عن طريق منحة مقدمة من جمعية الألمانية للبحوث (GRK 1089/project 5 إلى ND وSM) وبدعم من منحة بحثية من Manchot يورغن شتيفتونغ لND.

الجزء 1 : ثنائي الأبعاد الكهربائي للهلام (2 - D) باستخدام كوب التحميل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> IPG - الشريط الإماهة والتركيز كهرساوي (IEF) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترطيب المواد الهلامية DryStrip Immobiline ، ودرجة الحموضة 6-11 (7 سم) في 125 حل الإماهة ميكرولتر [7 M اليوريا ، 2 M ثيويوريا ، الفصلان 4 ٪ ، و 50 ملم وhydroxyethyldisulfide 2 ٪ IPG الحموضة الاحتياطي 11/06] باستخدام Immobiline صينية لDryStrip Reswelling لا يقل عن 10 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل عجل عينة البروتين في عينة العازلة IEF [7 M اليوريا ، 2 M ثيويوريا ، الفصلان 2 ٪ و 2 ٪ ASB - 14 ، hydroxyethyldisulfide 50 ملم و 2 ٪ IPG الحموضة الاحتياطي 11/06] بروتين الموافق 6-10 ميكروغرام لكل 100 ميكرولتر . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد solubilization (على الأقل 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة) ، وتطبيق نموذج البروتين عبر انوديك كأس الكؤوس التحميل باستخدام عينة. حجم الكوب هو 100 ميكرولتر (كوب المنوع سماح تصل إلى 150 ميكرولتر). ملاحظة : يمكنك تحميل كميات أكبر عينة إذا قمت بإدراج خطوة ذات الجهد المنخفض في بداية البروتوكول التركيز وإعادة ملء أكواب في حين لا يزال هناك فيلم السائل في الكوب! </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التركيز على أداء كهرساوي kVh 11.1 في وضع التدرج في الكهربائي Multiphor الوحدة الثانية. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> موازنة وSDS PAGE - <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد IEF ، تعرض شرائط IPG للحد من وألكلة ، في كل مرة 15 دقيقة على شاكر ، وذلك باستخدام dithiothreitol 1 ٪ و 2.5 ٪ على التوالي iodoacetamide في حل موازنة [50 ملي Tris-HCl/pH 8.8 ، 6 M اليوريا والجلسرين 30 ٪ و 2 ٪ SDS]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف شرائح معايرتها مع H 2 O وصمة عار لهم على الورق لإزالة الزائدة whatman موازنة العازلة. بعد ذلك تراجع الشرائط في SDS الامد العازلة (1X). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تنفيذ البعد الثاني بواسطة SDS - PAGE على النظم العمودي الكهربائي مع تركيز مادة الأكريلاميد ما مجموعه 12 ٪. وضعت شرائط IPG معايرتها على الجزء العلوي من المواد الهلامية التي تفصل وثابتة مع الحل agarose الساخنة [agarose 0.5 ٪ في تشغيل العازلة التي تحتوي على الأزرق bromophenol]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تم فصل البروتينات لمدة 2.5 ساعة ، ابتداء من الساعة 80 V لمدة 15 دقيقة تليها حتى 120 فولت الجبهة صبغ يصل الجزء السفلي من الكاسيت هلام. </li></ul></li></ol> الجزء 2 : صمغي Coomassie تلطيخ مع المصرف المركزي G - 250 1. تلطيخ حلول ملاحظة : لإعداد الحلول التلوين ، واستخدام المواد الكيميائية ذات جودة عالية مثل الصف تحليلية (سنويا) والمياه عالية النقاء كما تحصل من أنظمة ميليبور (الملة - Q الماء). <table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> Coomassie الحل : </td><td> 2000 م مل H 2 O </td></tr><tr><td> 0.02 ٪ ث (/ V) </td><td> المصرف المركزي G - 250 </td><td> 0،4 ز </td></tr><tr><td> 5 ٪ (W / V) </td><td> كبريتات الالومنيوم (14-18) هيدرات </td><td> 100 غرام </td></tr><tr><td> 10 ٪ (V / V) </td><td> الإيثانول (96 ٪) </td><td> 200 مل </td></tr><tr><td> 2 ٪ (V / V) </td><td> حمض orthophosphoric (85 ٪) </td><td> 47 مل </td></tr></tbody></table> ملاحظة : لإعداد الحل تلوين ، إضافة متسلسلة من المكونات الموجودة في الترتيب التالي لابد من المحافظة : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل first كبريتات الألمنيوم في الملة - Q المياه </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ذلك إضافة الإيثانول ، التجانس ، ومزيج المصرف المركزي G - 250 إلى الحل </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الآونة الأخيرة كما يذوب تماما الحل ، إضافة حامض الفوسفوريك (دمج الحامض إلى وسائل الإعلام الكحولية يتيح للجزيئات Coomassie الكلي في دولتهم الغروية) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شغل أخيرا مع الملة - Q المياه </li></ol> ملاحظة : الحل النهائي وتلطيخ مظلم الاخضر المزرق ومظهر ممتلئ من الجسيمات السباحة حول ما يلي : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لا رشاحة هذا الحل! </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا قمت بتغيير النظام من الإعداد ، سوف تحصل على حل أكثر البنفسجي المزرق الذي هو أقل حساسية. </li></ul><table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> Destaining الحل : </td><td> 2000 م مل H 2 O </td></tr><tr><td> 10 ٪ (V / V) </td><td> الإيثانول (96 ٪) </td><td> 200 مل </td></tr><tr><td> 2 ٪ (V / V) </td><td> حمض orthophosphoric (85 ٪) </td><td> 47 مل </td></tr></tbody></table> 2. تلطيخ الداخلي <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد انفصال البعد الثاني ، وإزالة المواد الهلامية بعناية من لوحات الزجاج ونقلها الى صحن مليء تلطيخ الملة - Q المياه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل المواد الهلامية ثلاث مرات مع الملة - Q الماء لمدة 10 دقيقة على شاكر الأفقي (غسل أسباب حساسية كافية لأن الفقراء SDS المتبقية على المواد الهلامية يزعج المحيط للصبغ للبروتين). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هزة الحل Coomassie قبل الاستخدام لتفريق الجسيمات الغروية بالتساوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان والمواد الهلامية بتغطية جيدة مع الحل Coomassie بواسطة التحريض على شاكر ل12/02 ساعة. هذا يولد تلوين الخلفية الهامشية بحيث يمكنك مراقبة التقدم المحرز في تلطيخ بينهما. ملاحظة : بعد 10 دقيقة يمكن أن تشاهد بقع البروتين تظهر للمرة الاولى ، في حدود 2 ساعة من الحضانة حوالي 80 ٪ تلطيخ إليهااكتمال ق أقصى مستوى. لتلطيخ ما يقرب من 100 ٪ ، فمن المستحسن الحضانة بين عشية وضحاها. في بعض الحالات ، عندما كمية من البروتين ليكون ملون ضخم والحل يتحول إلى زرقاء لامعة ، والتحديث من الحل تلطيخ ضروري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد هذا الإجراء إزالة البقع الحل Coomassie وشطف الهلام مرتين مع الملة - Q المياه. ملاحظة : يمكنك إعادة تلوين الحل طالما الجزيئات التي لا تزال قائمة ، وإلا فإنه تجاهل (نضع في اعتبارنا أن المختبر الخاص قد يكون لها لوائح خاصة للتخلص من النفايات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الجسيمات العالقة صبغة تلوين من الطبق مع خالية من الوبر منشفة ورقية ويزيل اللون لمدة 10 -- 60 دقيقة. ملاحظة : يمكنك أيضا غسل المواد الهلامية فقط مع الملة - Q المياه ولكن هذا نوصي فقط عن المواد الهلامية التحضيرية سوف تستمر لأن هناك غير منتظمة ، والأفلام Coomassie ضعيف على المواد الهلامية التي سوف تنشأ أثناء إجراء المسح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أخيرا شطف الهلام مرتين مع الملة - Q المياه : سوف يصل سمك الهلام الأصلي (وسائل الإعلام الكحول والحامض يجعل تقلص المواد الهلامية) ، وتحييد في المياه بالإضافة إلى ذلك يعزز من كثافة Coomassie اللون. </li></ul> الجزء 3 : نتائج الممثل اذا كنت تتبع البروتوكول المذكورة أعلاه سوف تحصل على جهاز D - 2 الجل الملون وكذلك حل الظلام المميزة البقع الزرقاء البروتين. حتى بالمقارنة مع هلام 2 - D ملطخة الفضة وفقا لآخرون شيفتشينكو 5 ، بروتوكول يدعي حساسية جيدة والتوافق مع مطياف الكتلة ، أن نحقق نتائج تلطيخ متساوية. <img src="/files/ftp_upload/1431/fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1 : النتائج النهائية للتجارب المذكورة أعلاه. كانغ Coomassie البروتوكول (أ) ينفذ بقوة مثل الفضة وفقا لتلطيخ آخرون شيفتشينكو (B) في الكشف عن البروتينات بعد 2 - D هلام إستشراد. الجزء 4 : نصائح والخدع <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء بعض stainings اختبار قبل معالجة العينات الخاصة بك. غير قابل للتفسير لأسباب ذكرت في بعض الأحيان نحن لا يمكن أن بروتين يتم الكشف عن الاهتمام بنجاح حتى عندما طبقت ملليغرام. في هذه الحالة نوصي لإعداد سلسلة تخفيف بعض لاختبار الحساسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان لديك منخفضة في جل اكتشاف بروتين (ق) في نقل عامة ناجحة من التراص إلى هلام خلال فصل SDS - PAGE ربما يكون السبب. يمكنك الاختيار لزجة مثل البروتينات التي تلطيخ الجل كاملة بما في ذلك منطقة التراص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عن التحقق من النتائج بسرعة تساوي الكهربية الخاص مع التركيز ، يمكنك صمة مباشرة شرائط IPG من دون أي فصل البعد الثاني أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره أحيانا المواد الهلامية أثناء الإجراء بحيث يتم تلوين ملطخة أنها بالتساوي من كلا الجانبين (إذا كنت تحتفظ المواد الهلامية غير متأثر ، وصبغ يربط فقط لجانب واحد من هلام). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شهدنا أن تخزين الحل تلطيخ في زجاجة داكنة يزيد من عمر البطارية (في زجاجات شفافة تصل إلى 4 أشهر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التلوين وتوثيق تتمكن من الحفاظ على المواد الهلامية في الثلاجة لعدة سنوات (إذا قمت بإضافة المحاليل الحمضية يمكنك تجنب التلوث بواسطة الفطريات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن التعجيل Destaining من المقابس هلام لهضم تريبسيني عن الاحترار في سخان كتلة. </li></ul>

<ol>
	<li>Fazekas de St Groth, S., Webster, S. R. G., Datyner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+new+staining+procedures+for+quantitative+estimation+of+proteins+on+electrophoretic+strips.">Two new staining procedures for quantitative estimation of proteins on electrophoretic strips.</a> Biochim. Biophys. Acta. 71, 377-391 (1963).</li><li>Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels+including+isoelectric+focusing+gels+with+clear+background+at+nanogram+sensitivity+using+Coomassie+Brilliant+Blue+G-250+and+R-250.">Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250.</a> Electrophoresis. 9, 255-262 (1988).</li><li>Candiano, G., Bruschi, M., Musante, L., Santucci, L., Ghiggeri, G. M., Carnemolla, B., Orecchia, P., Zardi, L., Rigetti, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+Silver:+A+very+sensitive+colloidal+Coomassie+G-250+staining+for+proteome+analysis.">Blue Silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis.</a> Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).</li><li>Kang, D., Gho, S. G., Suh, M., Kang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Sensitive+and+Fast+Protein+Detection+with+Coomassie+Brilliant+Blue+in+Sodium+Dodecyl+Sulfate-Polyacrylamide+Gel+Electrophoresis.">Highly Sensitive and Fast Protein Detection with Coomassie Brilliant Blue in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis.</a> Bull. Korean Chem. Soc. 11, 1511-1512 (2002).</li><li>Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+sequencing+of+proteins+silver-stained+polyacrylamide+gels.">Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels.</a> Anal. Chem. 68, 850-858 (1996).</li></ol>

ليس لدي أي شيء في الكشف عنها.

الابتكارية أو مجرد بروتوكول Coomassie؟ في هذه اللحظة توجد بروتوكولات متعددة لتلطيخ الاجراءات مع Coomassie بريليانت الأزرق. معظمهم نتيجة تعديلات طفيفة أو كبيرة واحدة من البروتوكولات الأكثر استخداما من قبل الزملاء وNeuhoff 2. أيضا بروت?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> اسم المنتج </td><td> شركة </td><td> رقم كتالوج </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> لمنتدى الطاقة الدولي وSDS PAGE - : </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Immobiline DryStrip المواد الهلامية </td><td> جنرال إلكتريك للرعاية الصحية </td><td> 17-6001-94 </td><td> ويمكن أن تستخدم حتى 2 سنوات بعد تاريخ انتهاء صلاحية. </td></tr><tr><td> Immobiline صينية DryStrip Reswelling </td><td> جنرال إلكتريك للرعاية الصحية </td><td> 80-6371-84 </td><td> لا نظيفة مع المذيبات العضوية. المصممة لشرائح IPG 7-18 سم. </td></tr><tr><td> Immobiline DryStrip كيت </td><td> جنرال إلكتريك للرعاية الصحية </td><td> 18-1004-30 </td><td> وتشمل علبة ، حامل القطب ، الأنود والكاثود الأقطاب ، وعينة اليجنر شريط كأس الكؤوس والعينة. </td></tr><tr><td> EPS الطاقة XL 3501 التموين </td><td> جنرال إلكتريك للرعاية الصحية </td><td> 18-1130-05 </td><td> إمدادات التيار الكهربائي يصل الى 3500 V. </td></tr><tr><td> Multiphor الوحدة الثانية الكهربائي </td><td> جنرال إلكتريك للرعاية الصحية </td><td> 18-1018-06 </td><td> الأقطاب الكهربائية المنقولة IEF في تمكين جميع شرائح IPG طول (24/07 سم IPG شرائط) </td></tr><tr><td> PerfectBlue هلام نظام التوأم S </td><td> Peqlab </td><td> 45-1010 - C </td><td> SDS - PAGE في تنسيق مصغرة 10x10 سم هلام. هلام غرفة يتضمن نظام التبريد. </td></tr><tr><td> لتلطيخ الغروية Coomassie G - 250 : </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> تلوين الأطباق مع اغطية </td><td> VWR </td><td> 216-3412 </td><td> ليناسب مصغرة المواد الهلامية. تكويم على شاكر. </td></tr><tr><td> كبريتات الالومنيوم - 18 - هيدرات </td><td> ميرك </td><td> 1.01102.5000 </td><td> قدمنا ​​أفضل تجربة مع شركة ميرك. متاح فقط في حزمة 5 كغم. </td></tr><tr><td> orthophosphoric حمض </td><td> Prolabo </td><td> 20 624.295 </td><td> تباع في قوارير زجاجية. </td></tr></table>

fast and sensitive colloidal coomassie g-250 staining for proteins in polyacrylamide gels

Coomassie بريليانت الأزرق (المصرف المركزي) هو صبغ يشيع استخدامها لتصور للبروتينات مفصولة SDS - PAGE ، وتقدم على إجراء تلوين بسيطة والكميات العالية. وعلاوة على ذلك ، وهو متوافق تماما مع الكتلة الطيفي تحديد البروتين. لكن على الرغم من هذه المزايا ، يعتبر المصرف المركزي إلى أن تكون أقل حساسية من الفضة أو stainings مضان ، وبالتالي نادرا ما تستخدم للكشف عن البروتينات في النهج التحليلي القائم على البروتين هلام. أدخلت تحسينات عديدة من 1 أصلية Coomassie بروتوكول لزيادة حساسية المصرف المركزي. تطبيق Neuhoff وزملاؤه في عام 1988 ، والميثانول بنسبة 20 ٪ وتركيزات أعلى من كبريتات الامونيوم في G - 250 المصرف المركزي حل يستند تلطيخ 2 : أدخلت تعديلين رئيسية لتعزيز الكشف عن البروتينات المنخفضة وفيرة عن طريق تحويل الجزيئات إلى جزيئات صبغة الغروية وفي عام 2004 آخرون Candiano. أنشئ المصرف المركزي باستخدام الأزرق الفضي G - 250 مع حامض الفوسفوريك في وجود كبريتات الامونيوم والميثانول 3. ومع ذلك ، فإن جميع هذه التعديلات تسمح فقط للكشف عن البروتين حوالي 10 نانوغرام. ونشرت على نطاق واسع لبروتوكول fameless تلطيخ Coomassie الغروية التي كانغ وآخرون في عام 2002 حيث تعديل Neuhoff تلوين المصرف المركزي الغروية بروتوكول بشأن المواد complexing. بدلا من كبريتات الامونيوم سلفات الألمنيوم استخدامها واستعيض الميثانول من 4 الإيثانول أقل سمية. وأظهرت القائمة على الألمنيوم في دراسة الرواية تلوين كانغ الحساسية الفائقة التي يكشف منخفضة مثل 1 نانوغرام / فرقة (فسفوريلاز ب) مع قليل من الاختلاف حساسية اعتمادا على البروتينات. هنا ، علينا أن نظهر تطبيق بروتوكول كانغ لسريع وحساسة تلطيخ Coomassie الغروية من البروتينات في أغراض التحليلية. وسوف نوضح بروتوكول سريعة وسهلة باستخدام ثنائية الأبعاد المواد الهلامية بصورة روتينية في مجموعتنا العمل.

Watch this Scientific Journal Video about Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in Polyacrylamide Gels at JoVE.com

Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in Polyacrylamide Gels

يجب نشر هذا الفيديو الغروية Coomassie a G - 250 وفقا لبروتوكول تلطيخ كانغ<em&gt; وآخرون.</em&gt; للكشف عن البروتين متوسط ​​4 نانوغرام في المواد الهلامية. اكتمال التلوين في حدود 2 ساعة ، ودون أي جهد. نستخدم عادة بروتوكول كانغ للأغراض التحليلية في جل المستندة البروتيوميات.

سريع والحساسة صمغي Coomassie G - 250 لتلطيخ البروتينات في الهلام بولي أكريلاميد

Coomassie Brilliant Blue (CBB) is a dye commonly used for the visualization of proteins separated by SDS-PAGE, offering a simple staining procedure and ...

fast-sensitive-colloidal-coomassie-g-250-staining-for-proteins

Research

JoVE Journal

Biology

40.0K Views.  University Duesseldorf. يجب نشر هذا الفيديو الغروية Coomassie a G - 250 وفقا لبروتوكول تلطيخ كانغ وآخرون. للكشف عن البروتين متوسط ​​4 نانوغرام في المواد الهلامية. اكتمال التلوين في حدود 2 ساعة ، ودون أي جهد. نستخدم عادة بروتوكول كانغ للأغراض التحليلية في جل المستندة البروتيوميات.

Video: Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in Polyacrylamide Gels

Staining Proteins in Gels

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for detecting proteins by four popular methods. Coomassie blue staining is an easy and rapid method. Silver staining, while more time consuming, is considerably more sensitive and can thus be used to detect smaller amounts of protein. Fluorescent staining is a popular alternative to traditional staining procedures, mainly because it is more sensitive than Coomassie staining, and is often as sensitive as silver staining. Staining of proteins with SYPRO Orange and SYPRO Ruby are also demonstrated here.

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. Staining of proteins with Coomassie Blue, Silver Staining, SYPRO Orange, SYPRO Ruby are demonstrated in this video.

تلطيخ البروتينات في الهلام

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for ...

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

طريقة لتلطيخ جسم الجامع في جبل الفرخ

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

تلطيخ من البروتينات في الهلام مع Coomassie G - 250 دون عضوي حمض الخليك والمذيبات

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their separation in a polyacrylamide gel matrix based on the molecular weight. Fragments between 2 to 500 bases, with length differences as small as a single nucleotide, can be separated using this method1. The migration of the sample is dependent on the chosen acrylamide concentration. A higher percentage of polyacrylamide resolves lower molecular weight fragments. The combination of urea and temperatures of 45-55 &deg;C during the gel run allows for the separation of unstructured DNA or RNA molecules.
In general this method is required to analyze or purify single stranded DNA or RNA fragments, such as synthesized or labeled oligonucleotides or products from enzymatic cleavage reactions.
In this video article we show how to prepare and run the denaturing urea polyacrylamide gels. Technical tips are included, in addition to the original protocol 1,2.

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis Urea PAGE

Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis is used to separate single-stranded DNA or RNA up to a limit of 500 nucleotides. Urea in combination with heat denatures samples and unstructured single strands migrate within the gel matrix according to their molecular weight.

تغيير طبيعة جل بولي أكريلاميد الكهربائي اليوريا (PAGE اليوريا)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their ...

Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to extracellular agents is predominantly regulated by the phospholipase C&beta;- G&alpha;q pathway localized on the plasma membrane which is stimulated by agents such as acetylcholine 3,4. We have recently found that plasma membrane protein domains called caveolae5,6 can entrap activated G&alpha;q 7. This entrapment has the effect of stabilizing the activated state of G&alpha;q and resulting in prolonged Ca2+ signals in cardiomyocytes and other cell types8. We uncovered this surprising result by measuring dynamic calcium responses on a fast scale in living cardiomyocytes. Briefly, cells are loaded with a fluorescent Ca2+ indicator. In our studies, we used Ca2+ Green (Invitrogen, Inc.) which exhibits an increase in fluorescence emission intensity upon binding of calcium ions. The fluorescence intensity is then recorded for using a line-scan mode of a laser scanning confocal microscope. This method allows rapid acquisition of the time course of fluorescence intensity in pixels along a selected line, producing several hundreds of time traces on the microsecond time scale. These very fast traces are transferred into excel and then into Sigmaplot for analysis, and are compared to traces obtained for electronic noise, free dye, and other controls. To dissect Ca2+ responses of different flux rates, we performed a histogram analysis that binned pixel intensities with time. Binning allows us to group over 500 traces of scans and visualize the compiled results spatially and temporally on a single plot. Thus, the slow Ca2+ waves that are difficult to discern when the scans are overlaid due to different peak placement and noise, can be readily seen in the binned histograms. Very fast fluxes in the time scale of the measurement show a narrow distribution of intensities in the very short time bins whereas longer Ca2+ waves show binned data with a broad distribution over longer time bins. These different time distributions allow us to dissect the timing of Ca2+fluxes in the cells, and to determine their impact on various cellular events.

We present a method to isolate rapid (microsecond) calcium events from slower fluxes in living cells using laser scanning confocal microscopy. The method measures fluorescence intensity fluctuations of calcium indicators by recording line scans of several hundred pixels in a cell. Histogram analysis allows us to isolate the time scales of different calcium fluxes.

قياس الكالسيوم السريع في تدفقاتها العضلية

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting factors, such as labor intensive sample preparations, low detection limits, slow scan speeds, intensive method optimization for each metabolite, and the inability to measure both positively and negatively charged ions in single experiments. Therefore, a novel metabolomics protocol could advance metabolomics studies. Amide-based hydrophilic chromatography enables polar metabolite analysis without any chemical derivatization. High resolution MS using the Q-Exactive (QE-MS) has improved ion optics, increased scan speeds (256 msec at resolution 70,000), and has the capability of carrying out positive/negative switching. Using a cold methanol extraction strategy, and coupling an amide column with QE-MS enables robust detection of 168 targeted polar metabolites and thousands of additional features simultaneously.&#160; Data processing is carried out with commercially available software in a highly efficient way, and unknown features extracted from the mass spectra can be queried in databases.

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. Utilizing normal-phased liquid chromatography coupled to high-resolution mass spectrometry with polarity switching and a rapid duty cycle, we describe a protocol to analyze the polar metabolic composition of biological material with high sensitivity, accuracy, and resolution.

استراتيجية للحساسية، مقياس كبيرة الكمية الايض

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

Development of a Colloidal Gold-based Immunochromatographic Test Strip for Detection of Cetacean Myoglobin

This protocol describes the development of a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format that can be used to differentiate the myoglobin (Mb) of cetaceans from that of seals and other animals. The strip provides rapid and on-the-spot screening for cetacean meat, thereby restraining its illegal trade and consumption. Two monoclonal antibodies (mAbs) with reactivity toward the Mb of cetaceans were developed. The amino acid sequences of Mb antigenic reactive regions from various animals were analyzed in order to design two synthetic peptides (a general peptide and a specific peptide) and thereafter raise the mAbs (subclass IgG1). The mAbs were selected from hybridomas screened by indirect ELISA, western blot and dot blot. CGF5H9 was specific to the Mbs of rabbits, dogs, pigs, cows, goats, and cetaceans while it showed weak to no affinity to the Mbs of chickens, tuna and seals. CSF1H13 can bind seals and cetaceans with strong affinity but showed no affinity to other animals. Cetacean samples from four families (Balaenopteridae, Delphinidae, Phocoenidae and Kogiidae) were used in this study, and the results indicated that these two mAbs have broad binding ability to Mbs from different cetaceans. These mAbs were applied on a sandwich-type colloidal gold immunochromatographic test strip. CGF5H9, which recognizes many species, was colloid gold-labeled and used as the detection antibody. CSF1H13, which was coated on the test zone, detected the presence of cetacean and seal Mbs. Muscle samples from tuna, chicken, seal, five species of terrestrial mammals and 15 species of cetaceans were tested in triplicate. All cetacean samples showed positive results and all the other samples showed negative results.

This protocol describes the development of two IgG class monoclonal antibodies (mAbs) strongly reactive to myoglobin of cetaceans. These mAbs are applied on a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format to differentiate the Mb of cetaceans from seal and other animals.

تطوير المناعي اختبار قطاع تستند الذهب الغروية عن الكشف عن الحيتان الميوجلوبين

This protocol describes the development of a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format that can be used to ...

Detection of Modified Forms of Cytosine Using Sensitive Immunohistochemistry

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), and 5-carboxylcytosine (5caC) are the recently discovered modified cytosine bases produced by enzymatic oxidation of 5mC, whose biological functions remain relatively obscure. A number of approaches ranging from biochemical to antibody based techniques have been employed to study the genomic distribution and global content of these modifications in various biological systems. Although some of these approaches can be useful for quantitative assessment of these modified forms of 5mC, most of these methods do not provide any spatial information regarding the distribution of these DNA modifications in different cell types, required for correct understanding of their functional roles. Here we present a highly sensitive method for immunochemical detection of the modified forms of cytosine. This method permits co-detection of these epigenetic marks with protein lineage markers and can be employed to study their nuclear localization, thus, contributing to deciphering their potential biological roles in different experimental contexts.

Herein we describe a sensitive immunochemical method for mapping the spatial distribution of 5mC oxidation derivatives based on the use of peroxidase-conjugated secondary antibodies and tyramide signal amplification.

الكشف عن أشكال معدلة من السيتوزين عن طريق الحساسة المناعية

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. ...

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related disorders continue to be a major contributor of deaths around the world, necessitating the need for even greater understanding of their pathobiology. Traditional antibody-based techniques like western blotting or immunohistochemistry suffer from being low-throughput besides being labor-intensive and qualitative or semi-quantitative. Even conventional mass spectrometry-based shotgun approaches fail to provide conclusive evidence to support a certain hypothesis. Targeted proteomics approaches are largely hypothesis driven and differ from the conventional shotgun proteomics approaches that have been long in use. Multiple reaction monitoring is one such targeted approach that requires the use of a special mass spectrometer called the tandem quadrupole mass spectrometer or triple quadrupole mass spectrometer. In the current study, we have systematically highlighted the major steps involved in performing a successful tandem quadrupole mass spectrometry-based proteomics workflow using human brain tissue with an aim to introduce this workflow to a broader research community.

The protocol aims to introduce the use of a triple quadrupole mass spectrometer for Multiple Reaction Monitoring (MRM) of proteins from clinical samples. We have provided a systematic workflow starting from sample preparation to data analysis for clinical samples with all the necessary precautions to be taken.

سير العمل البروتيومي الكمي باستخدام رصد التفاعل المتعدد القائم على الكشف عن البروتينات من أنسجة الدماغ البشري

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...

Detection of Glycosaminoglycans by Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining

Sulfated glycosaminoglycans (GAGs) such as heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS) are ubiquitous in living organisms and play a critical role in a variety of basic biological structures and processes. As polymers, GAGs exist as a polydisperse mixture containing polysaccharide chains that can range from 4000 Da to well over 40,000 Da. Within these chains exists domains of sulfation, conferring a pattern of negative charge that facilitates interaction with positively charged residues of cognate protein ligands. Sulfated domains of GAGs must be of sufficient length to allow for these electrostatic interactions. To understand the function of GAGs in biological tissues, the investigator must be able to isolate, purify, and measure the size of GAGs. This report describes a practical and versatile polyacrylamide gel electrophoresis-based technique that can be leveraged to resolve relatively small differences in size between GAGs isolated from a variety of biological tissue types.

This report describes techniques to isolate and purify sulfated glycosaminoglycans (GAGs) from biological samples and a polyacrylamide gel electrophoresis approach to approximate their size. GAGs contribute to tissue structure and influence signaling processes via electrostatic interaction with proteins. GAG polymer length contributes to their binding affinity for cognate ligands.

الكشف عن الجليكوسامينوغليكان بواسطة البولي أكريلاميد جل إلكتروفورسيس وتلطيخ الفضة

Sulfated glycosaminoglycans (GAGs) such as heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS) are ubiquitous in living organisms and play a critical role ...