هذا هو أسلوب رواية هلام تلطيخ التي تستخدم مسابير الفضة الفلوروجينية لتحويل تلطيخ الفضة التقليدية إلى تلطيخ الفضة الفلورسنت. وأظهرت هذه الطريقة تحسن الأداء مقارنة مع تلطيخ نترات الفضة التقليدية و SYPRO روبي تلطيخ أثناء استخدام بروتوكول بسيط ومباشر دون الألدهيدات. إثبات الإجراء سيكون أليكس وونغ، مساعد باحث من مختبري.
لبدء هذا الإجراء، تمييع عينات البروتين مع محلول يحتوي على الماء المقطر، عازلة LDS، وعامل تقليل العينة. إعداد خزان هلام صغير مملوءة المخزن المؤقت MES لتنفيذ SDS-PAGE مع 4-12٪ البيس تريس هلام البروتين. قم بتحميل الآبار مع عينة البروتين المعدة، ثم قم بتشغيل الجل بجهد ثابت يبلغ 200 فولت لمدة 30 دقيقة.
بعد الكهرباء، غمر الجل في محلول 100 ملليلتر يحتوي على الإيثانول وحمض الخليك على شاكر مداري واحتضان مرتين لمدة 30 دقيقة لكل من درجة حرارة الغرفة بينما تهتز عند 50 دورة في الدقيقة. بعد ذلك، اغسل الجل ثلاث مرات بالماء فائق الخطورة في وعاء نظيف مع كل غسل يدوم 10 دقائق. أولا، حل 0.01 غرام من نترات الفضة في 10 ملليلتر من المياه فائقة الpure لإعداد محلول الأسهم مع تركيز 0.1٪ إضافة 100 ميكرولترات من محلول الأسهم إلى 100 ملليلتر من المياه فائقة الpure لجعل حل النترات الفضة العمل.
في غطاء الدخان، غمر الجل في 100 ملليلتر من محلول عمل نترات الفضة في غرفة زجاجية مختومة. استخدام رقائق الألومنيوم لحماية هلام من الضوء أثناء التشريب واحتضان لمدة ساعة واحدة في حين تهتز في 50 دورة في الدقيقة على شاكر المدارية. بعد ذلك، يغسل الجل مرتين بالماء فائق الخطورة في وعاء نظيف، مع كل غسل باستخدام ما يقرب من 100 ملليلتر من الماء وتستمر 60 ثانية.
من المهم استخدام المياه فائقة السخ لتنظيف هلام بعد خطوة التشريب الفضة لتقليل تلطيخ الخلفية. أولا، إضافة 50 ملليلتر من الماء فائقة الpure إلى ثلاثة ملليغرام من صبغة TPE-4TA. سونيكات الحل لمدة ثلاث دقائق وإضافة خمس ميكروليترات من محلول هيدروكسيد الصوديوم واحد المولار في ما بين كل جلسة sonication للمساعدة في حل الصبغة، وعادة ما تصل إلى ثلاث مرات.
ثم تحقق من الفلوريسين من الحل تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية 365 نانومتر للتأكد من أن يتم حل صبغة تماما. فقط الحلول الضعيفة أو غير المُفَيِّة تشير إلى الإنحلال الكامل. لإعداد محلول تطوير الفلوروجينيك، أضف 10 ملليلترات من محلول الأسهم TPE-4TA إلى 90 ملليلتر من الماء فائق السخاء.
استخدم مقياسًا للرُحَرِحِيّة لفحصِ مَحَرَقِلِ الحل. ضبط الحل إلى الأس هيدروكسيد الحموضة بين 7 و 9، وذلك باستخدام محلول هيدروكسيد الصوديوم المخفف أو حمض الخليك إذا كان الأس هيدروكسيد الحموضة خارج النطاق. بعد ذلك نقل الجل إلى وعاء نظيف وقابل للتسرب مع 100 ملليلتر من محلول تطوير الفلوروجيني وضمان أن الجل مغمور تمامًا.
ختم الحاوية وتغطية لحمايتها من الضوء. هز الحاوية بين عشية وضحاها على شاكر المدارية في 50 دورة في الدقيقة وفي درجة حرارة الغرفة. نقل هلام إلى وعاء نظيف وdestain في 100 ملليلتر من 10٪ الإيثانول لمدة 30 دقيقة.
ثم شطف الجل في الماء فائق الخطورة لمدة خمس دقائق. يمكن تصور الجل على مهاتر على مقاعد البدلاء أو صورة على آلة وثائق هلام في قناة 365 نانومتر أو قناة 302 نانومتر. في هذه الدراسة، يتم استخدام طريقة تلطيخ الفضة الفلورسنت رواية لطخة البروتينات في المواد الهلامية بوليكل.
تظهر أشرطة البروتين الملطخة ببقعة الفضة الفلورسنت خضراء شديدة تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية 365 نانومتر. جميع 14 نطاقات البروتين واضحة للعيان وترتبط بشكل جيد مع العصابات ذات اللون الأحمر الملطخة بصبغة روبي SYPRO. ويبدو أن هذا الأسلوب تلطيخ الفضة الفلورسنت لديها دقة عالية.
بالنسبة لبعض نطاقات البروتين، فإن حساسية البقعة الفضية الفلورية هي أيضا أفضل قليلا من تلك التي في وصمة عار الفلورسنت SYPRO روبي. على وجه الخصوص تحسين أداء هذه البقعة لنطاقات البروتين بين 10 و 40 كيلودالتون، مما يدل على أن الطريقة الجديدة مفيدة بشكل خاص للكشف عن البروتينات ذات الوزن الجزيئي المنخفض. وكما يمكن أن نرى، تشير البيانات أيضا إلى أن وصمة الفضة الفلورسنت يعطي خطية جيدة وموحدة لجميع البروتينات 14 على مدى نطاق واسع نسبيا من كمية البروتين.
في حين أن بقعة نترات الفضة أعطت مستوى عال من إشارة الخلفية والقمم المشوهة ، اكتشفت البقعة الفضية الفلورية النطاقات ذات التباين الجيد والتوزيع الموحد للكثافة مقارنة بصبغة SYPRO روبي عبر جميع البروتينات الـ 14. خطوات الغسيل مهمة لأنها تحد من حل التثبيت المتبقي من تعطيل التشريب الفضي أو التنمية الفلورية. عند استخدام نترات الفضة، تجنب ملامسة الجلد.
تنظيف أي انسكابات على الفور. ارتداء الملابس الواقية والقفازات والتخلص من النفايات الكيميائية.
