نحن نقدم مقايسة جزيء واحد لمراقبة الفصل الطوري لعوامل النسخ على الحمض النووي تسمح هذه التقنية بتحقيق العملية الديناميكية لعوامل النسخ في الوقت الفعلي التي يتم تجميعها كقطرة سائلة على الحمض النووي. EWS-FL1 هو أحد جينات الاندماج الأكثر مشاركة في تكوين ورم ساركوما إيوينغ. يمكن أن يحدد بحثنا العلاقة بين رقم شكل الحمض النووي وتكوين مكثفات EWS-FL1 المرتبطة بنسخ الجينات القاحلة في الخلايا السرطانية ، وربما تكون مفيدة للتشخيص.
يمكن تطبيق هذه الطريقة لدراسة أي مكثفات نسخ أو مجمعات في المختبر ، مثل P53 و MED1. لتحضير خلية تدفق بحواجز نانو متعرجة ملفقة لتجربة ستارة الحمض النووي ، قم بتوصيل أنابيب الإدخال والإخراج في الاتجاه الصحيح. ثم اغسل خلية التدفق ب 2.5 ملليلتر من المخزن المؤقت للدهون باستخدام حقنتين سعة ثلاثة ملليلتر ، مما يضمن عدم وجود فقاعة في خلية التدفق.
أخرج المحقنة من الإخراج وحقن ملليلتر واحد من محلول الجسيمات الشحمية ثلاث مرات مع حضانة لمدة خمس دقائق بين كل حقنة. للشفاء ، أعد غسل خلية التدفق ب 2.5 مل من المخزن المؤقت للدهون ببطء ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. أثناء الحضانة ، قم بإعداد مخزن BSA المؤقت كما هو مذكور في مخطوطة النص.
ثم بعد 30 دقيقة من الشفاء ، اغسل خلية التدفق ب 2.5 ملليلتر من المخزن المؤقت BSA من جانب الإخراج. بعد ذلك ، قم بحقن 800 ميكرولتر من مخزن الستربتافيدين في خلية التدفق من جانب الإدخال في خطوتين مع حضانة لمدة 10 دقائق بعد كل خطوة. ثم اغسل خلية التدفق ب 2.5 ملليلتر من محلول BSA لإزالة جميع جزيئات الستربتافيدين الحرة.
بعد ذلك ، قم بتخفيف الحمض النووي للبيوتين Lambda بزخارف مستنسخة باستخدام مخزن BSA المؤقت وحقنه أربع مرات ببطء كل خمس دقائق. أثناء الحقن ، قم بتشغيل المجهر في نظام أشباه الموصلات أكسيد المعادن العلمي المجاني. ثم اغسل الأنبوب ب 10 ملليلتر من الماء المقطر المزدوج واشطف المنشور وموصل الأنبوب بالماء ومنظف كوفيت سائل 2٪ و 99٪ إيثانول.
بعد ذلك ، ارسم ما لا يقل عن 20 ملليلتر من المخزن المؤقت للتصوير في حقنة سعة 30 ملليلتر. قم بإعداد خلية التدفق في مرحلة المجهر وقم بتوصيلها بنظام الموائع الدقيقة. باستخدام معدل تدفق 0.03 ملليلتر في الدقيقة ، اغسل جزيئات الحمض النووي إلى الحاجز لمدة 10 دقائق.
ثم قم بإيقاف تشغيل نظام الموائع الدقيقة واحتضانه لمدة 30 دقيقة. مع توقف التدفق ، مما يسمح للحمض النووي بالانتشار بشكل جانبي. لتصوير تكوين تكثيف EWS-FLI1 على ستائر الحمض النووي ، افتح برنامج التصوير وابحث عن مواضع الأنماط المتعرجة التسعة تحت المجال الساطع وقم بتمييزها.
ثم قم بتشغيل التدفق بمعدل 0.2 ملليلتر في الدقيقة لتلطيخ الحمض النووي بصبغة الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بها السبل لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، قم بتخفيف بروتين mCherry EWS-FLI1 باستخدام مخزن التصوير المؤقت بتركيز 100 نانومول في 100 ميكرولتر. ثم قم بتحميل عينة البروتين من خلال الصمام باستخدام حقنة زجاجية سعة 100 ميكرولتر وقم بتغيير معدل التدفق إلى 0.4 ملليلتر في الدقيقة.
بعد تشغيل الليزر 488 نانومتر ، قم بإجراء مسح مسبق لكل منطقة للتحقق من حالة توزيع الحمض النووي وتحديد المنطقة التي تتوزع فيها جزيئات الحمض النووي بالتساوي. ثم اضبط طاقة الليزر على 10٪ لليزر 488 نانومتر و 20٪ لليزر 561 نانومتر. وباستخدام مقياس الطاقة ، قم بقياس قوة الليزر الحقيقية بالقرب من المنشور.
ابدأ في الحصول على الصور على فترتين ثانيتين باستخدام كل من ليزر 488 و 561 نانومتر في وقت واحد. ثم قم بتغيير الصمام من الوضع اليدوي إلى وضع الحقن للسماح للمخزن المؤقت للتصوير بمسح عينة البروتين في خلية التدفق بعد 60 ثانية. لإزالة EWS-FLI1 المجاني ، استمر في غسل خلية التدفق باستخدام مخزن التصوير المؤقت لمدة خمس دقائق مع تشغيل الليزر 561 نانومتر فقط.
ثم أوقف التدفق واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد 10 دقائق ، قم بتشغيل التدفق بمعدل 0.4 ملليلتر في الدقيقة للسماح للحمض النووي بالتمدد والحصول على صور على فترتين ثانيتين بين إطارات مختلفة للحصول على بيانات إنتاجية عالية لتكوين مكثفات EWS-FLI1. تم تصور جزيئات EWS-FLI1 من خلال الكشف عن إشارات mCherry المسماة EWS-FLI1 التي تم الحصول عليها باستخدام ليزر 561 نانومتر.
يمكن تصور التكوين المختبري لمكثفات EWS-FLI1 في موقع 25 تكرارا GGAA في ركيزة الحمض النووي مباشرة. تم تأكيد خصوصية mCherry EWS-FLI1 المستخدمة في ستائر الحمض النووي من خلال مقايسة إزاحة الحركة الكهربائية باستخدام قالب الحمض النووي مع وبدون تكرار 25 GGAA بشكل منفصل. عندما تمت معايرة تركيز EWS-FLI1 من 20 إلى 500 نانومول ، زادت شدة EWS-FLI1 بشكل كبير.
في حين أن التغيير في شدة FLI واحد DBD كان ضئيلا عندما كانت البروتينات مشبعة لتغطية تكرارات GGAA ، مما يشير إلى أن EWS-FLI1 شكلت مكثفات على الحمض النووي. يجب أن يكون الحقن بطيئا جدا وناعما حتى يتمكن الليبوزوم والحمض النووي من التوزيع بالتساوي على خلية التدفق. من المهم إجراء MSA للتأكد من أن عامل النسخ المنقى يرتبط على وجه التحديد بالتسلسل المستهدف في المختبر.
تسمح هذه التقنية للأشخاص باستكشاف ما إذا كانت المكثفات ستسهل البحث المستهدف عن عوامل النسخ وتأثيرها على النسخ.
