EQUIPMENT <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نسيج الثقافة حاضنة و 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مجموعة من micropipettors (100 ، 100μL) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حمام المياه 37 درجة مئوية </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حمام المياه 90 درجة مئوية لتكون مصدرا لبخار الماء </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المرحلة النقيض المجهر </li></ul> الخطوة الأولى علاج الخلايا مع colcemid في هذا الإجراء استخدمنا خط hESC H9 مثقف على الخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEF) المعطل مع C mitomycin (سيغما) والاحتفاظ بها في DMEM/F12 (Invitrogen) تستكمل مع خروج المغلوب استبدال 20 ٪ المصل (KSR ، Gibco) و8ng/mL من عامل نمو الخلايا الليفية (جمعية جيل المستقبل - 2 ، R &amp; D). من أجل الحصول على عدد كبير من انتشار metaphases ، فمن المستحسن استخدام الثقافات مع مؤشر الإنقسامية العالية التي توجد فيها العديد من الخلايا المنقسمة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأخذ قارورة الثقافة من الحاضنة ، وتدفق الصفحي ، إضافة Colcemid بتركيز نهائي من 0،1 ميكروغرام / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عودة القارورة إلى حاضنة وانتظر 3 ساعات حتى يمكن أن يسبب المانع القبض على الإنقسامية الطورية ، عندما يتم مكثف جيدا الكروموسومات ويمكن تصور بسهولة تحت المجهر. </li></ol> تحديد الخلايا <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إخراج المتوسطة وإضافة tripsin / EDTA 0.05 ٪ تكفي لتغطية سطح الخلايا. السماح لاحتضان خلايا لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ثم تعطيل انزيم إما عن طريق إضافة مستنبت يحتوي المصل أو بإضافة فقط المصل إلى الخلايا. ملاحظة : من المهم للتأكد من أن يتم التوصل إلى وقف للحصول على خلية واحدة ينتشر الطورية جيدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل و 122 جهاز طرد مركزي في غرام لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف ، وترك حوالي 200 مل ، وresuspend الكرية بلطف من خلال الاستفادة من الأنبوب ، كما هو مبين في الفيديو. تأكد من أن الخلايا تنفصل بشكل جيد ، بحيث لا يمكن تصور أي كتل في الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> القادم سوف تحتاج إلى إضافة 5 مل من محلول ناقص التوتر (بوكل 75mM) قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية ، وببطء ، من قبل جدار الأنبوب كما في الوصف التالي. أولا إضافة 3 مل ، عكس الأنبوب إلى وضع أفقي تماما لمزج الخلايا التي تحتوي على حل ناقص التوتر ثم إضافة ما تبقى من 2 مل والدفء في 37 دقيقة لمدة 15 درجة مئوية. ملاحظة : عند هذه النقطة الحل ناقص التوتر وسوف يسبب زيادة في حجم الخلايا وتساعد على استجلاء الكروموسومات. الوقت من المهم الحضانة للحصول على كروموسوم ينتشر جيدة. إذا كان توقيت طويل جدا ، قد انفجر غشاء الخلية مبكرا وتفقد الكروموسومات. إذا كان قصيرا جدا ، قد يكون من الصعب الحصول على كروموسوم ينتشر لأن غشاء الخلية قد لا تخريبها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 3 قطرات من محلول تثبيتي (الميثانول / حامض الخليك الجليدي 3:1) ، قلب الأنبوب برفق لمزج الحل تثبيتي مع خلايا وأجهزة الطرد المركزي في 122 غ لمدة 5 دقائق من دون انقطاع. ملاحظة : يجب أن يكون الحل تثبيتي الطازجة. ملاحظة : من المهم استخدام الطرد المركزي من دون انقطاع لتجنب استنزاف الخلايا ، ومنع فقدان المادة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف ، وترك حوالي 200 مل ، وresuspend الكرية بلطف التنصت على الجزء السفلي من الأنبوب. ملاحظة : مرة أخرى ، تأكد من أن الخلايا تنفصل بشكل جيد ، بحيث لا يمكن تصور أي كتل في الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة أول 3 مل من محلول تثبيتي ، ببطء عن طريق أنبوب الجدار ، بينما تقوم بتدوير الأنبوب. عكس الأنبوب إلى وضع أفقي لمجرد مزج الخلايا ، ومن ثم إضافة المزيد 2 مل من محلول مثبت بواسطة الجدار أنبوب لتأخذ الخلايا إلى أسفل. الأسهم عند 4 درجات مئوية خلال الليل. ملاحظة : يمكن تخزين هذه الخلايا في محلول مثبت ثابت لعدة أشهر في 4 درجات مئوية. إلى جانب حماية الخلايا في دولتهم متورمة ، والحل تثبيتي ، يزيل الدهون والبروتينات يبدل طبيعة. هذه الأحداث تجعل من غشاء الخلية الهشة ، ونتيجة لذلك ، جعل كروموسوم ينتشر بسهولة. </li></ol> تنظيف الشرائح الزجاجية قبل البدء في اتخاذ ينتشر كروموسوم الخاص تأكد من أن يتم تنظيفها بشكل صحيح الشرائح أو قد تفقد بعض النوى وكذلك metaphases. هذه الخطوة بأنها مهمة بشكل جيد إذا كنت تريد أن تجرب أي أسلوب التهجين 9. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الشرائح في دورق يحتوي على حمض الهيدروكلوريك 6M مدة لا تقل عن 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد هذا الوقت ، وتغسل الشرائح في ادارة مياه الصنبور لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الشرائح في الماء المقطر ، واسمحوا أن تجف في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن الآن أن يتم تخزين الشرائح في الايثانول 96 ٪ والمجففة مع مباشرة قبل خالية من الوبر للاستخدام. </li></ol> ملاحظة : للحصول على طرق التهجين الموضع ، لا يمكن أن يتم تخزين الشرائح لأكثر من 2 في أيام الإيثانول 96 ٪ الخطوة الثانية غسل الخلايا <ol start="10" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي ، الطرد المركزي الخلايا في 122 غ لمدة 5 دقائق من دون انقطاع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dوطاف iscard ترك حوالي 200 مل. Resuspend الكرية بواسطة أنبوب عبها بلطف ثم يضاف 5 مل من محلول مثبت الطازجة (الميثانول / حامض الخليك الجليدي 3:1) ، وببطء من الجدار في حين تناوب أنبوب الأنبوب. كرر هذه الخطوة 2 غسل أكثر من مرة عن ما مجموعه ثلاثة يغسل. ملاحظة : يجب أن يكون الحل تثبيتي الطازجة. </li></ol> اعداد الشرائح <ol start="12" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في خطوة الطرد المركزي الماضي ترك كمية كافية من حل لتجانس بيليه الخلية والحصول على كثافة كافية من الخلايا في الشرائح (انظر الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 20-30 ميكرولتر من التعليق على شريحة خلية جافة ونظيفة عن طريق تحريك ماصة قريبة جدا وموازية لسطح الأرض. كما يتبخر الحل مثبت ، سطح الشريحة تصبح مشوشة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على الفور ، وتعريض الشريحة ، مواجهة ، في بخار الماء الساخن (90 درجة) لمدة 30 ثانية لتسبب خلايا تفجير. ملاحظة : في هذه اللحظة ، والميثانول من يتبخر الحل تثبيتي ، مما أدى إلى زيادة تركيز حامض الخليك ، والتي جنبا إلى جنب مع المياه يحفز كروموسوم الانتشار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نظرة على النقيض من المرحلة المجهر فقط لمعرفة ما اذا كان التركيز فضلا عن توزيع الخلية السليمة (انظر الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الآن الشرائح جاهزة لاستخدامها للتحقق من مجموعة من الكروموزومات التي مناهج علم الوراثة الخلوية كما G - النطاقات (بالغيمزا) ، السماء ، أو CGH السمكية. </li></ol> IMPORTANT تلوح كيفية اختيار الطورية كافية لتحليلها اختيار metaphases مستديرة ومعزولة (الشكل 2D) ، قد تجنب النظر [أنيوبلويدي] كاذبة عن المكسب من الكروموزومات التي تم إنشاؤها بواسطة اثنين أو أكثر ينتشر مختلطة مع بعضها البعض أو الخسارة من الكروموزومات التي تم إنشاؤها بواسطة كروموسوم إطلاقها. هكذا ، وتجنب اختيار metaphases قرب نوى لأن قد تكون مخفية بعض الكروموسومات بها (الشكل 2A و 2B). الى جانب ذلك ، نبحث عن metaphases المستديرة والتأكد من أن يتم فصل أي كروموسوم من الطورية (الشكل 2C). الخلايا المغذية والنمط النووي hESC G - لربط وتحليل SKY ، فإن وجود الخلايا المغذية في الثقافة hESC لا تتداخل مع النتائج ، وذلك لأن الخلايا المغذية ليست في ظل حالة الانقسام (المعطل بواسطة C mitomycin أو التشعيع) ، وسوف لا تكون جزءا من السكان الطورية. ومع ذلك ، لتطبيق تقنية FISH في نواة الطور البيني ، ويفضل أن تفصل بين السكان من الخلايا المغذية hESC عن طريق حصاد المستعمرات يدويا قبل trypsinization للتحليل السمكية. <img border="0" src="/files/ftp_upload/1512/1512fig1tmb.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1 : كيف تعرف كثافة الخلية المناسبة في الشرائح. صور المجهر النقيض من المرحلة في الهدف 10X. (A) وكثافة الخلايا عالية جدا. الأسهم تشير إلى الطورية ينتشر قريبة جدا من النوى. (ب) مع شريحة كثافة خلية جيدة. الدوائر تظهر metaphases ينتشر المعزولة من نوى أو metaphases الأخرى. الرجاء <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1512/1512fig1.jpg">انقر هنا</a> لرؤية نسخة أكبر من الرقم 1. <img border="0" src="/files/ftp_upload/1512/1512fig2tmb.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2 : كيفية اختيار الطورية كافية لتحليلها. هي ملطخة الكروموسومات مع دابي والصور التي حصلت عليها المجهر الفلورسنت في الهدف 100X. (أ) (ب) تجنب metaphases قرب نوى (المشار إليها بواسطة الأسهم) (C) وليس metaphases الجولة الحالية التي تفصل الصبغيات (دائرة). (د) الطورية الجولة هو الطورية جيدة ليتم تحليلها. الرجاء <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1512/1512fig2.jpg">انقر هنا</a> لرؤية نسخة أكبر من الشكل 2.

<ol>
	<li>Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1145 (1998).</li><li>Draper, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+gain+of+chromosomes+17q+and+12+in+cultured+human+embryonic+stem+cells.">Recurrent gain of chromosomes 17q and 12 in cultured human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 22 (1), 53-53 (2004).</li><li>Maitra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+alterations+in+cultured+human+embryonic+stem+cells.">Genomic alterations in cultured human embryonic stem cells.</a> Nat Genet. 37 (10), 1099-1099 (2005).</li><li>Mitalipova, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserving+the+genetic+integrity+of+human+embryonic+stem+cells.">Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 23 (1), 19-19 (2005).</li><li>Buzzard, J. J., Gough, N. M., Crook, J. M., Colman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Karyotype+of+human+ES+cells+during+extended+culture.">Karyotype of human ES cells during extended culture.</a> Nat Biotechnol. 22 (4), 381-381 (2004).</li><li>Caisander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+integrity+maintained+in+five+human+embryonic+stem+cell+lines+after+prolonged+in+vitro+culture.">Chromosomal integrity maintained in five human embryonic stem cell lines after prolonged in vitro culture.</a> Chromosome Res. 14 (2), 131-131 (2006).</li><li>Imreh, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+culture+conditions+favoring+selection+of+chromosomal+abnormalities+in+human+ES+cells.">In vitro culture conditions favoring selection of chromosomal abnormalities in human ES cells.</a> J Cell Biochem. 99 (2), 508-508 (2006).</li><li>Robin-Wesselschmidt, J. L., Loring, J. F., Robin-Wesselschmidt, J. L., Robin-Wesselschmidt, S. c. h. w. a. r. t. z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Stem Cell Manual. , 59-59 (2007).</li><li>Rooney, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Cytogenetics. , (2001).</li><li>Heslop-Harrison, P., Schwarzacher, T., Heslop-Harrison, P., Schwarzacher, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical in situ hybridization. , 51-51 (2000).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

إعداد ينتشر الكروموسومات هي خطوة حاسمة لإجراء تحليل لحالة نجاح الوراثية للخلايا الجذعية الجنينية من خلال تقنيات روتينية كما G - النطاقات ، وتقنيات أكثر تطورا مثل الأسماك والسماء وCGH. ويمكن تطبيق هذا الإجراء لأنواع مختلفة العديد ?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>15 ml centrifuge tube</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>TPP</td>
<td>91015</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Colcemid Karyo MAX</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>15212-012</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Isofar</td>
<td>721</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glacial acetic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Isofar</td>
<td>100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Isofar</td>
<td>208</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck</td>
<td>104.931.000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Slide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bioslide</td>
<td>7105-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tripsin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SIGMA</td>
<td>T4799</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

chromosomal spread preparation of human embryonic stem cells for karyotyping

وإن كانت قد أظهرت الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESC) لتقديم النمط النووي ضعفاني مستقرة 1 ، وأفادت دراسات عديدة بأن تبعا للظروف الثقافة التي تصبح عرضة لاكتساب شذوذ الكروموسومات مثل إضافة أو أجزاء كاملة من الكروموزومات. في الواقع ، خلال فترة طويلة الأجل والثقافة ، ولوحظت تغييرات karyotypic عندما تستخدم الأنزيمية أو التفكك الكيميائي 2،3،4 ، في حين تشريح دليل المستعمرات الركض ليحتفظ النمط النووي مستقرة 5. الى جانب ذلك ، التغيرات في البيئة ، مثل ازالة الخلايا المغذية ويبدو أيضا أن تعرض للخطر سلامة الجيني للhESC 3،6. مرة واحدة يمكن أن تؤثر التغيرات الكروموسومية الفيزيولوجيا الخلوية ، وتوصيف سلامة الجيني للhESC في المختبر أمر حاسم hESC النظر بوصفه أداة أساسية في الدراسات والاختبارات تخلق المخدرات. علاوة على ذلك ، لأغراض علاجية في المستقبل التغيرات الكروموسومية هي مصدر قلق حقيقي ويرتبط في كثير من الأحيان إلى التسرطن. هنا نعرض طريقة بسيطة ومفيدة للحصول على ارتفاع هوامش كروموسوم الجودة للتحليل اللاحق للكروموسوم التي وضعتها مجموعة النطاقات ، SKY ، FISH أو تقنيات CGH 7،8. نوصي بالتحقق من الوضع الكروموسومات بشكل روتيني مع فترات من 5 فقرات من أجل رصد ظهور translocations و[أنيوبلويدي] ساهم Priscila بريتو وSartore رافاييلا بالتساوي على الورق.

Watch this Scientific Journal Video about Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping at JoVE.com

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Karyotyping هي تقنية بسيطة ومفيدة تستخدم على نطاق واسع للكشف عن تغيرات جينية. نحن هنا وصف خطوة خطوة لإعداد بروتوكول نشر كروموسوم من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية لرصد حالة الكروموسومات من هذه الخلايا في الحفاظ على الثقافة.

الكروموسومات التحضير انتشار الخلايا الجذعية الجنينية البشرية لKaryotyping

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture ...

chromosomal-spread-preparation-human-embryonic-stem-cells-for

Research

JoVE Journal

Biology

48.5K Views.  Federal University of Rio De Janeiro-UFRJ. Karyotyping هي تقنية بسيطة ومفيدة تستخدم على نطاق واسع للكشف عن تغيرات جينية. نحن هنا وصف خطوة خطوة لإعداد بروتوكول نشر كروموسوم من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية لرصد حالة الكروموسومات من هذه الخلايا في الحفاظ على الثقافة.

Video: Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

انتشار الخلايا الجنينية البشرية (ES) الجذعية

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

اشتقاق خلايا الجذعية المكونة للدم من الفئران خلايا الجذعية الجنينية

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

اشتقاق الخلايا الجذعية الجنينية البشرية التي Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and programmed cell death. Mitochondria produce ATP, regulate the cytoplasmic redox state and Ca2+ balance, catabolize fatty acids, synthesize heme, nucleotides, steroid hormones, amino acids, and help assemble iron-sulfur clusters in proteins. Mitochondria also have an essential role in heat production. Mutations of the mitochondrial genome cause several types of human disorder. The accumulation of mtDNA mutations correlates with aging and is suspected to have an important role in the development of cancer. Due to their vitally important role in all cell types, the function of mitochondria must also be critical for stem cells. Key advances have been made in our understanding of stem cell viability, proliferation, and differentiation capacity. But the functional activity of stem cells, in particular their energy status, was not yet been studied in detail. Almost nothing is known about the mitochondrial properties of human embryonic stem cells (hESCs) and their differentiated precursor progeny. One way to understand and evaluate the role of mitochondria in hESC function and developmental potential is to directly measure the activity of mitochondrial respiratory complexes. Here, we describe high resolution clear native gel electrophoresis and subsequent in gel activity visualization as a method for analyzing the five respiratory chain complexes of hESCs.

In this video, we will show you how the mitochondrial respiratory chain complexes of human embryonic stem cells can be analyzed using in gel activity assays.

سبر للنشاط مجمع الميتوكوندريا في خلايا المنشأ الجنينية البشرية

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

مناعي لونين من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of the predominant imaging modalities to assess the restoration of the injured myocardium. Furthermore, ex-vivo labeling agents, such as iron-oxide nanoparticles, have been employed to track and localize the transplanted stem cells. However, this method does not monitor a fundamental cellular biology property regarding the viability of transplanted cells. It has been known that manganese chloride (MnCl2) enters the cells via voltage-gated calcium (Ca2+) channels when the cells are biologically active, and accumulates intracellularly to generate T1 shortening effect. Therefore, we suggest that manganese-guided MRI can be useful to monitor cell viability after the transplantation of hESC into the myocardium.
In this video, we will show how to label hESC with MnCl2 and how those cells can be clearly seen by using MRI in vitro. At the same time, biological activity of Ca2+-channels will be modulated utilizing both Ca2+-channel agonist and antagonist to evaluate concomitant signal changes.

In this video, we are showing how to label human embryonic stem cells (hESC) with manganese chloride (MnCl2) which can enter cells via voltage-gated calcium channels when the cells are biologically active. Additionally, we show the use of MnCl2 as cellular MRI contrast agent to determine the in vitro viability of hESC.

وصفها في المختبر من خلايا المنشأ الجنينية البشرية لتصوير بالرنين المغناطيسي

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be  fed  every day by performing a complete medium change to replenish lost nutrients and to keep the cultures free of unwanted differentiation factors. Although a small amount of differentiation is normal and expected in stem cell cultures, the culture should be routinely cleaned up by manually removing, or "picking" differentiated areas. Identifying and removing excess differentiation from hES cell cultures are essential techniques in the maintenance of a healthy population of cells.

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

This protocol demonstrates how to maintain healthy, undifferentiated human embryonic stem (ES) cells.

الثقافة والمحافظة على الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

تجميد والذوبان الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

تمايز الخلايا الجذعية الجنينية في السلائف Oligodendrocyte

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.