ציוד <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמות תרבות חממה, 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרכזת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סט של micropipettors (100, 100μL) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המים באמבטיה 37 ° C </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אמבט המים 90 מעלות צלזיוס להיות מקור של מים קיטור </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניגוד שלב מיקרוסקופ </li></ul> צעד ראשון טיפול בתאי עם colcemid בהליך זה השתמשנו קו hESC H9 תרבותי על fibroblasts העכבר עובריים (MEF) מומת עם mitomycin C (Sigma) ומתוחזק DMEM/F12 (Invitrogen) בתוספת החלפת בנוקאאוט 20% נסיוב (KSR, Gibco) ו 8ng/mL של גורם גדילה פיברובלסטים (FGF-2, R &amp; D). כדי לקבל מספר גדול של ממרחים metaphases, מומלץ להשתמש תרבויות עם מדד גבוה mitotic שבו יש חלוקת תאים רבים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את הבקבוק תרבות מן החממה, בזרימה למינרית, להוסיף Colcemid בריכוז סופי של 0.1 מיקרוגרם / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזירים את הבקבוק אל האינקובטור ולחכות 3 שעות כל כך מעכב יכולה לגרום למעצר mitotic על metaphase, כאשר כרומוזומים מרוכזים היטב ניתן דמיינו בקלות מתחת למיקרוסקופ. </li></ol> תיקון התאים <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קחו את המדיום ולהוסיף tripsin / EDTA 0.05% מספיק כדי לכסות את פני השטח לתאים. אפשר תאים כדי לדגור במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן להשבית את האנזים או על ידי הוספת בינוני תרבות המכילה סרום או פשוט על ידי הוספת נסיוב לתאים. הערה: חשוב לוודא כי השעיה תא בודד מושגת להשיג מתפשט metaphase טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת התאים לצינור צנטריפוגה 15 מ&quot;ל ו - 122 גרם ב צנטריפוגות במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant, והשאיר על 200 מ&quot;ל, ו resuspend את הכדור בעדינות על ידי הקשה על הצינור, כפי שמוצג בסרטון. ודא התאים ניתק היטב, כך שאתה לא יכול לדמיין את כל הגושים בתמיסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבא תצטרך להוסיף 5 מ&quot;ל של תמיסת hypotonic (KCl 75mm) מראש לחמם 37 ° C, לאט, על ידי הקיר צינור כמו בתיאור הבא. ראשית להוסיף 3 מ&quot;ל, להפוך לצינור למצב אופקי פשוט לערבב את התאים עם פתרון hypotonic מכן להוסיף את שאר מ&quot;ל 2 ו להתחמם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. הערה: בשלב זה הפתרון hypotonic יגרום לעלייה בנפח הסלולר לעזור לפענח את הכרומוזומים. זמן הדגירה חשוב לרכוש מתפשט כרומוזום טוב. אם העיתוי הוא ארוך מדי, קרום התא עשוי לפרוץ מוקדם מדי כרומוזומים יאבדו. אם קצר מדי, זה יכול להיות קשה להשיג מתפשט כרומוזום כי קרום התא לא יכול לשבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 טיפות של הפתרון מקבע (מתנול / חומצה אצטית קרחונית 03:01), להפוך את הצינור בעדינות כדי לערבב את הפתרון מקבע עם תאים צנטריפוגות ב 122 גר &#39;במשך 5 דקות ללא הפסקה. הערה: הפתרון צריך להיעשות מקבע עתה. הערה: חשוב להשתמש צנטריפוגה ללא הפסקה, כדי למנוע שחיקה התאים, מניעת אובדן של החומר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant, והשאיר על 200 מ&quot;ל, ו resuspend את הכדור בעדינות על ידי הקשה על החלק התחתון של הצינור. הערה: שוב, לוודא התאים ניתק היטב, כך שאתה לא יכול לדמיין את כל הגושים בתמיסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את הראשון 3 מ&quot;ל של תמיסת מקבע, לאט ליד הקיר צינור, תוך כדי לסובב את הצינור. הפוך את הצינור למצב אופקי פשוט לערבב את התאים, ולאחר מכן להוסיף עוד 2 מ&quot;ל של הפתרון מקבע ליד הקיר צינור לקחת את התאים מטה. במלאי ב 4 ° C למשך הלילה. הערה: תאים קבוע ניתן לאחסן פתרון מקבע במשך חודשים 4 ° C. מלבד הגנה על תאים במצב נפוח שלהם, הפתרון מקבע מסיר שומנים וחלבונים denatures. אירועים אלה להפוך את קרום התא שברירי, וכתוצאה מכך, להפוך את כרומוזום מתפשטת בקלות. </li></ol> ניקוי שקופיות הזכוכית לפני תחילת ביצוע מתפשט כרומוזום שלך לוודא כי השקופיות מנקים כמו שצריך אחרת אתם עלולים לאבד כמה גרעינים וגם metaphases. שלב זה הוא חשוב גם אם אתה רוצה לנסות כל טכניקה הכלאה 9. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום שקופיות כוס המכילה HCl 6M לפחות 3 שעות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופה זו, לשטוף במים זורמים שקופיות ברז למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את השקופיות במים מזוקקים ולתת להם להתייבש בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו השקופיות ניתן לאחסן לתוך אתנול 96% מיובשים עם ונטולת מוך מיד לפני השימוש. </li></ol> הערה: לקבלת בשיטות הכלאה באתרו, השקופיות לא ניתן לאחסן יותר מ 2 ימים לתוך אתנול 96% שלב השני כביסה התאים <ol start="10" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, צנטריפוגה התאים ב 122 גר &#39;במשך 5 דקות ללא הפסקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Discard supernatant עוזב על 200 מ&quot;ל. Resuspend גלולה מצליף בעדינות על ידי צינור ולאחר מכן להוסיף 5 מ&quot;ל של תמיסת טרי מקבע (מתנול / חומצה אצטית קרחונית 03:01), לאט ליד הקיר צינור תוך סיבוב הצינור. חזור על שלב 2 לשטוף יותר פעמים עבור סכום כולל של שלושה שוטף. הערה: הפתרון צריך להיעשות מקבע עתה. </li></ol> הכנת שקופיות <ol start="12" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצעד צנטריפוגה האחרון לעזוב כמות מספקת של פתרון homogenize התא גלולה ולקבל צפיפות מספקת של תאים השקופיות (ראה תרשים 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20-30 μL ההשעיה תא לשקופית יבש ונקי על ידי העברת פיפטה קרוב מאוד ובמקביל פני השטח. כמו מתאדה פתרון מקבע, את פני השטח של שקופיות הופך מגורען. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לחשוף את השקופית, עם הפנים כלפי מעלה, לתוך האדים של מים חמים (90 מעלות) למשך 30 שניות כדי לגרום לתאים לפוצץ. הערה: ברגע זה, מתנול מ מתאדה פתרון מקבע, וכתוצאה מכך גדל ריכוז חומצה אצטית, אשר יחד עם המים מגרה את כרומוזום מתפשטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תראו מיקרוסקופ לעומת השלב רק כדי לבדוק אם הריכוז כמו גם את חלוקת התא הוא טוב (ראו תרשים 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו השקופיות מוכנים לשמש כדי לבדוק את ערכה של כרומוזומים על ידי גישות cytogenetics כמו ה-G-banding (Giemsa) SKY, דגים, או CGH. </li></ol> חשוב רמזים איך לבחור metaphase נאותה כדי להיות מנותח בחירת metaphases עגולים מבודדים (דמות 2D), אתה עשוי להימנע בהתחשב aneuploidies כוזבת רווח של כרומוזומים שנוצר על ידי שניים או יותר מרווחי מעורבבים יחד או אובדן של כרומוזומים שנוצר על ידי כרומוזום השיק. אז, להימנע מבחירת metaphases ליד גרעינים כי כמה כרומוזומים עשוי להיות מוסתר על ידי אותם (דמות 2 א ו -2). חוץ מזה, לחפש metaphases עגול להיות בטוח כי כל כרומוזום מופרד מן metaphase (דמות 2C). מזין תאים קריוטיפ hESC עבור ה-G-banding וניתוח SKY, נוכחות של תאים מזין בתרבות hESC לא להפריע התוצאות, כי התאים מזין אינם תחת מדינה חלוקת (מומת על ידי mitomycin C או הקרנה) ולא יהיה חלק מהאוכלוסייה metaphase. עם זאת, עבור היישום של טכניקה דגים גרעינים שלבי הביניים, הוא העדיף להפריד את האוכלוסייה hESC מתאי מזין ידי קצירת המושבות ידנית לפני trypsinization לניתוח FISH. <img border="0" src="/files/ftp_upload/1512/1512fig1tmb.jpg" alt="איור 1" /> איור 1: איך לדעת את צפיפות התאים המתאימים השקופיות. תמונות של המיקרוסקופ שלב הניגוד אובייקטיבי 10x. (א) צפיפות התאים גבוהה מדי. החיצים מצביעים על metaphase מתפשטת קרוב מדי של גרעינים. (ב) שקופית עם צפיפות התאים טוב. חוגים מראים metaphases מתפשט מבודד גרעינים או metaphases אחרים. אנא <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1512/1512fig1.jpg">לחץ כאן</a> כדי לראות גרסה גדולה יותר של דמות 1. <img border="0" src="/files/ftp_upload/1512/1512fig2tmb.jpg" alt="איור 2" /> איור 2: איך לבחור metaphase נאותה כדי להיות מנותח. הכרומוזומים הם מוכתמים DAPI ותמונות מתקבל על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי ב אובייקטיבית 100x. (א) (ב) להימנע metaphases ליד גרעינים (מסומנת בחצים) (C) metaphases לא עגול כי הכרומוזומים מופרדים נוכח (עיגול). (ד) metaphase עגול הוא metaphase טוב כדי להיות מנותח. אנא <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1512/1512fig2.jpg">לחץ כאן</a> כדי לראות גרסה גדולה יותר של הדמות 2.

<ol>
	<li>Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1145 (1998).</li><li>Draper, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+gain+of+chromosomes+17q+and+12+in+cultured+human+embryonic+stem+cells.">Recurrent gain of chromosomes 17q and 12 in cultured human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 22 (1), 53-53 (2004).</li><li>Maitra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+alterations+in+cultured+human+embryonic+stem+cells.">Genomic alterations in cultured human embryonic stem cells.</a> Nat Genet. 37 (10), 1099-1099 (2005).</li><li>Mitalipova, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserving+the+genetic+integrity+of+human+embryonic+stem+cells.">Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 23 (1), 19-19 (2005).</li><li>Buzzard, J. J., Gough, N. M., Crook, J. M., Colman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Karyotype+of+human+ES+cells+during+extended+culture.">Karyotype of human ES cells during extended culture.</a> Nat Biotechnol. 22 (4), 381-381 (2004).</li><li>Caisander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+integrity+maintained+in+five+human+embryonic+stem+cell+lines+after+prolonged+in+vitro+culture.">Chromosomal integrity maintained in five human embryonic stem cell lines after prolonged in vitro culture.</a> Chromosome Res. 14 (2), 131-131 (2006).</li><li>Imreh, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+culture+conditions+favoring+selection+of+chromosomal+abnormalities+in+human+ES+cells.">In vitro culture conditions favoring selection of chromosomal abnormalities in human ES cells.</a> J Cell Biochem. 99 (2), 508-508 (2006).</li><li>Robin-Wesselschmidt, J. L., Loring, J. F., Robin-Wesselschmidt, J. L., Robin-Wesselschmidt, S. c. h. w. a. r. t. z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Stem Cell Manual. , 59-59 (2007).</li><li>Rooney, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Cytogenetics. , (2001).</li><li>Heslop-Harrison, P., Schwarzacher, T., Heslop-Harrison, P., Schwarzacher, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical in situ hybridization. , 51-51 (2000).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

הכנת ממרחים כרומוזום הוא שלב קריטי לניתוח מוצלח של מצב גנטי של תאים עובריים באופן שגרתי על ידי טכניקות כמו ה-G-banding, טכניקות מתוחכמות יותר כגון דגים, SKY ו - CGH. הליך זה יכול להיות מיושם על סוגי תאים רבים על ידי שינוי תקופת הדגירה colcemid, ...

<table><tbody><tr><td>15 ml centrifuge tube</td><td>Techno Plastic Products</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>Colcemid Karyo MAX</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15212-012</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Isofar</td><td>721</td><td></td></tr><tr><td>Glacial acetic acid</td><td>Isofar</td><td>100</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Isofar</td><td>208</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride (KCl)</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>104.931.000</td><td></td></tr><tr><td>Slide</td><td>Bioslide</td><td>7105-1</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4799</td><td></td></tr></tbody></table>

chromosomal spread preparation of human embryonic stem cells for karyotyping

למרות בתאי גזע עובריים אנושיים (hESC) הוכחו מציגים קריוטיפ דיפלואידי יציב 1, מחקרים רבים דיווחו כי בהתאם לתנאי התרבות הם הופכים נוטה לרכוש מומים כרומוזומליים כגון תוספת של שלם או חלקי כרומוזומים. ואכן, במהלך לתרבות לטווח ארוך, שינויים karyotypic הם נצפו כאשר אנזימטית או כימי דיסוציאציה משמשים 2,3,4, בעוד דיסקציה ידנית של המושבות עבור passaging שומרת קריוטיפ יציב 5. חוץ מזה, שינויים בסביבה, כגון הסרת תאים מזין גם נראה להתפשר על שלמות הגנטי של hESC 3,6. לאחר שינויים כרומוזומליים יכולים להשפיע על הפיזיולוגיה הסלולר, אפיון של שלמות הגנטי של hESC במבחנה הוא hESC בהתחשב מכריע ככלי חיוני במחקרים embryogenesis בדיקות סמים. יתר על כן, למטרות טיפוליות עתידיות שינויים כרומוזומליים הם חשש ממשי כפי שהוא מזוהה לעתים קרובות סרטן. כאן אנו מציגים שיטה פשוטה ושימושית להשיג איכות גבוהה כרומוזום מתפשט עבור ניתוח בדיעבד של כרומוזום שנקבעו על ידי G-banding SKY, דגים או טכניקות CGH 7,8. אנו ממליצים לבדוק את מצב הכרומוזומים באופן שגרתי במרווחים של 5 קטעים על מנת לפקח על המראה של טרנסלוקציות ו aneuploidies Priscila Britto ו Rafaela Sartore תרמו באופן שווה על הנייר.

Watch this Scientific Journal Video about Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping at JoVE.com

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Karyotyping היא טכניקה פשוטה ושימושית בשימוש נרחב לאיתור שינויים גנטיים. כאן אנו מתארים צעד אחר צעד להכנת פרוטוקול כרומוזום התפשטות בתאי גזע עובריים אנושיים לניטור מצב הכרומוזומים של תאים אלה נשמר בתרבות.

מורחים הכנה כרומוזומלית של בתאי גזע עובריים אנושיים עבור Karyotyping

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture ...

chromosomal-spread-preparation-human-embryonic-stem-cells-for

Research

JoVE Journal

Biology

48.6K Views.  Federal University of Rio De Janeiro-UFRJ. Karyotyping היא טכניקה פשוטה ושימושית בשימוש נרחב לאיתור שינויים גנטיים. כאן אנו מתארים צעד אחר צעד להכנת פרוטוקול כרומוזום התפשטות בתאי גזע עובריים אנושיים לניטור מצב הכרומוזומים של תאים אלה נשמר בתרבות.

Video: Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, Klf-4, and c-Myc), typically expressed by human embryonic stem cells (hESCs). Due to their similarity with hESCs, iPSCs have become an important tool for potential patient-specific regenerative medicine, avoiding ethical issues associated with hESCs. In order to obtain cells suitable for clinical application, transgene-free iPSCs need to be generated to avoid transgene reactivation, altered gene expression and misguided differentiation. Moreover, a highly efficient and inexpensive reprogramming method is necessary to derive sufficient iPSCs for therapeutic purposes. Given this need, an efficient non-integrating episomal plasmid approach is the preferable choice for iPSC derivation. Currently the most common cell type used for reprogramming purposes are fibroblasts, the isolation of which requires tissue biopsy, an invasive surgical procedure for the patient. Therefore, human peripheral blood represents the most accessible and least invasive tissue for iPSC generation.
In this study, a cost-effective and viral-free protocol using non-integrating episomal plasmids is reported for the generation of iPSCs from human peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) obtained from frozen buffy coats after whole blood centrifugation and without density gradient separation.

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) represent a source of patient-specific tissues for clinical applications and basic research. Here, we present a detailed protocol to reprogram human peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) obtained from frozen buffy coats into viral-free iPSCs using non-integrating episomal plasmids.

דור של גזע תאים המושרה pluripotent מקפוא באפי מעילים באמצעות Episomal פלסמידים ללא שילוב

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

Developmental Biology

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for spermatogenesis. These techniques allow for visualization of protein and DNA localization patterns during meiotic events such as homologous chromosome pairing, synapsis and DNA repair. While a few protocols have been described in the literature, general chromatin spread techniques using mammalian prophase oocytes are limited and difficult due to the timing of meiosis initiation in fetal ovaries. In comparison, prophase spermatocytes can be collected from juvenile male mice with higher yields without the need for microdissection. However, it is difficult to obtain a pure synchronized population of cells at specific stages due to the heterogeneity of meiotic and post-meiotic germ cell populations in the juvenile and adult testis. For later stages of meiosis, it is advantageous to assess oocytes undergoing meiosis I (MI) or meiosis II (MII), because groups of mature oocytes can be collected from adult female mice and stimulated to resume meiosis in culture. Here, methods for meiotic chromatin spread preparations using oocytes dissected from fetal, neonatal and adult ovaries are described with accompanying video demonstrations. Chromosome missegregation events in mammalian oocytes are frequent, particularly during MI. These techniques can be used to assess and characterize the effects of different mutations or environmental exposures during various stages of oogenesis. As there are distinct differences between oogenesis and spermatogenesis, the techniques described within are invaluable to increase our understanding of mammalian oogenesis and the sexually dimorphic features of chromosome and protein dynamics during meiosis.

Oogenesis in mammals is known to be error-prone, particularly due to chromosome missegregation. This manuscript describes chromatin spread preparation methods for mouse prophase, metaphase I and II-staged oocytes. These fundamental techniques allow for the study of chromatin-bound proteins and chromosome morphology throughout mammalian oogenesis.

כרומטין להפיץ את ההכנות לניתוח של העכבר Oocyte התקדמות מן Prophase כדי מפה של השני

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

Genetics

Establishment of Genome-edited Human Pluripotent Stem Cell Lines: From Targeting to Isolation

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human development and investigate the pathophysiology of disease. By employing site-specific nucleases (SSNs) for genome editing, the rapid derivation of new hPSC lines harboring specific genetic alterations in an otherwise isogenic setting becomes possible. Zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs) and clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 are the most commonly used SSNs. All of these nucleases function by introducing a double stranded DNA break at a specified site, thereby promoting precise gene editing at a genomic locus. SSN-meditated genome editing exploits two of the cell&#39;s endogenous DNA repair mechanisms, non-homologous end joining (NHEJ) and homology directed repair (HDR), to either introduce insertion/deletion mutations or alter the genome using a homologous repair template at the site of the double stranded break. Electroporation of hPSCs is an efficient means of transfecting SSNs and repair templates that incorporate transgenes such as fluorescent reporters and antibiotic resistance cassettes. After electroporation, it is possible to isolate only those hPSCs that incorporated the repair construct by selecting for antibiotic resistance. Mechanically separating hPSC colonies and confirming proper integration at the target site through genotyping allows for the isolation of correctly targeted and genetically homogeneous cell lines. The validity of this protocol is demonstrated here by using all three SSN platforms to incorporate EGFP and a puromycin resistance construct into the AAVS1 safe harbor locus in human pluripotent&#160;stem cells.

Genome editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) can be done quickly and efficiently. Presented here is a robust experimental procedure to genetically engineer hPSCs as exemplified by editing the AAVS1 safe harbor locus to express EGFP and introduce antibiotic resistance.

הקמת שורות תאי גזע pluripotent האדם בעריכה-הגנום: ממיקוד לבידוד

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human ...

Spectral Karyotyping to Study Chromosome Abnormalities in Humans and Mice with Polycystic Kidney Disease

Conventional method to identify and classify individual chromosomes depends on the unique banding pattern of each chromosome in a specific species being analyzed 1, 2. This classical banding technique, however, is not reliable in identifying complex chromosomal aberrations such as those associated with cancer. To overcome the limitations of the banding technique, Spectral Karyotyping (SKY) is introduced to provide much reliable information on chromosome abnormalities.
SKY is a multicolor fluorescence in-situ hybridization (FISH) technique to detect metaphase chromosomes with spectral microscope 3, 4. SKY has been proven to be a valuable tool for the cytogenetic analysis of a broad range of chromosome abnormalities associated with a large number of genetic diseases and malignancies 5, 6. SKY involves the use of multicolor fluorescently-labelled DNA probes prepared from the degenerate oligonucleotide primers by PCR. Thus, every chromosome has a unique spectral color after in-situ hybridization with probes, which are differentially labelled with a mixture of fluorescent dyes (Rhodamine, Texas Red, Cy5, FITC and Cy5.5). The probes used for SKY consist of up to 55 chromosome specific probes 7-10.
The procedure for SKY involves several steps (Figure 1). SKY requires the availability of cells with high mitotic index from normal or diseased tissue or blood. The chromosomes of a single cell from either a freshly isolated primary cell or a cell line are spread on a glass slide. This chromosome spread is labeled with a different combination of fluorescent dyes specific for each chromosome. For probe detection and image acquisition,the spectral imaging system consists of sagnac interferometer and a CCD camera. This allows measurement of the visible light spectrum emitted from the sample and to acquire a spectral image from individual chromosomes. HiSKY, the software used to analyze the results of the captured images, provides an easy identification of chromosome anomalies. The end result is a metaphase and a karyotype classification image, in which each pair of chromosomes has a distinct color (Figure 2). This allows easy identification of chromosome identities and translocations. For more details, please visit Applied Spectral Imaging website (<a href="http://www.spectral-imaging.com/" target="_blank">http://www.spectral-imaging.com/</a>).
SKY was recently used for an identification of chromosome segregation defects and chromosome abnormalities in humans and mice with Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease (ADPKD), a genetic disease characterized by dysfunction in primary cilia 11-13. Using this technique, we demonstrated the presence of abnormal chromosome segregation and chromosomal defects in ADPKD patients and mouse models 14. Further analyses using SKY not only allowed us to identify chromosomal number and identity, but also to accurately detect very complex chromosomal aberrations such as chromosome deletions and translocations (Figure 2).

Spectral Karyotyping (SKY) is an advanced cytogenetics technique to identify genomic and chromosomal aberrations. This technique takes advantage of chromosome painting probes, which allow classification of all chromosomes. SKY can also identify complex chromosome aberrations and segregation defects in mice and humans with various diseases, including polycystic kidney disease.

Karyotyping רפאים ללמוד חריגות כרומוזום בבני אדם ועכברים עם מחלת כליות פוליציסטיות

Conventional method to identify and classify individual chromosomes depends on the unique banding pattern of each chromosome in a specific species being ...

Medicine

Establishment of Proliferative Tetraploid Cells from Nontransformed Human Fibroblasts

Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to be responsible for carcinogenesis in such tissues. Although proliferative polyploid cells are requisite for analyzing chromosomal instability of polyploid cells, creating such cells from nontransformed human cells is rather challenging. Induction of tetraploidy by chemical agents usually results in a mixture of diploid and tetraploid populations, and most studies employed fluorescence-activated cell sorting or cloning by limiting dilution to separate tetraploid from diploid cells. However, these procedures are time-consuming and laborious. The present report describes a relatively simple protocol to induce proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts with minimum contamination by diploid cells. Briefly, the protocol is comprised of the following steps: arresting cells in mitosis by demecolcine (DC), collecting mitotic cells after shaking off, incubating collected cells with DC for an additional 3 days, and incubating cells in drug-free medium (They resume proliferation as tetraploid cells within several days). Depending on cell type, the collection of mitotic cells by shaking off might be omitted. This protocol provides a simple and feasible method to establish proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts. Tetraploid cells established by this method could be a useful model for studying chromosome instability and the oncogenic potential of polyploid human cells.

Although proliferative polyploid cells are necessary to analyze chromosomal instability of polyploid cells, creating such cells from nontransformed human cells is not easy. The present report describes relatively simple procedures to establish proliferative tetraploid cells free of a diploid population from normal human fibroblasts.

הקמת תאי tetraploid Proliferative מ Nontransformed אדם פיברובלסטים

Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

הכרומטין immunoprecipitation מן בתאי גזע עובריים אנושיים

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

למבוגרים עובריים שרירי השלד Microexplant התרבות בידוד בתאי גזע שרירי השלד

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Chromosome Preparation From Cultured Cells

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as fluorescence in situ hybridization (FISH), this assay has the powerful ability to analyze individual cells for aberrations that involve gains or losses of portions of the genome&#160;and rearrangements involving one or more chromosomes. In humans, chromosome abnormalities occur in approximately 1 per 160 live births1,2, 60-80% of all miscarriages3,4, 10% of stillbirths2,5, 13% of individuals with congenital heart disease6, 3-6% of infertility cases2, and in many patients with developmental delay&#160;and birth defects7. Cytogenetic analysis of malignancy is routinely used by researchers and clinicians, as observations of clonal chromosomal abnormalities have been shown to have both diagnostic and prognostic significance8,9.&#160; Chromosome isolation is invaluable for gene therapy and stem cell research of organisms including nonhuman primates and rodents10-13.
Chromosomes can be isolated from cells of live tissues, including blood lymphocytes, skin fibroblasts, amniocytes, placenta, bone marrow, and tumor specimens. Chromosomes are analyzed at the metaphase stage of mitosis, when they are most condensed and therefore more clearly visible. The first step of the chromosome isolation technique involves the disruption of the spindle fibers by incubation with Colcemid, to prevent the cells from proceeding to the subsequent anaphase stage. The cells are then treated with a hypotonic solution and preserved in their swollen state with Carnoy&#39;s fixative. The cells are then dropped on to slides and can then be utilized for a variety of procedures. G-banding involves trypsin treatment followed by staining with Giemsa to create characteristic light and dark bands. The same procedure to isolate chromosomes can be used for the preparation of cells for procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY)14,15.

Chromosomes can be isolated from live cells such as lymphocytes or skin fibroblasts, and from organisms including humans or mice. These chromosome preparations can be further utilized for routine G-banding and molecular cytogenetic procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY).

הכנת כרומוזום מתאים בתרבית

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

Zinc-finger Nuclease Enhanced Gene Targeting in Human Embryonic Stem Cells

One major limitation with current human embryonic stem cell (ESC) differentiation protocols is the generation of heterogeneous cell populations.&#160;These cultures contain the cells of interest, but are also contaminated with undifferentiated ESCs, non-neural derivatives and other neuronal subtypes.&#160; This limits their use in in vitro and in vivo applications, such as in vitro modeling for drug discovery or cell replacement therapy. To help overcome this, reporter cell lines, which offer a means to visualize, track and isolate cells of interest, can be engineered.&#160;However, to achieve this in human embryonic stem cells via conventional homologous recombination is extremely inefficient.&#160;This protocol describes targeting of the Pituitary homeobox 3 (PITX3) locus in human embryonic stem cells using custom designed zinc-finger nucleases, which introduce site-specific double-strand DNA breaks, together with a PITX3-EGFP-specific DNA donor vector. Following the generation of the PITX3 reporter cell line, it can then be differentiated using published protocols for use in studies such as in vitro Parkinson&#8217;s disease modeling or cell replacement therapy.

Reporter cell lines offer a means to visualize, track and isolate cells of interest from heterogeneous populations.&#160;However, gene-targeting using conventional homologous recombination in human embryonic stem cells is extremely inefficient. Herein, we describe targeting CNS midbrain specific transcription factor PITX3 locus with EGFP using zinc-finger nuclease enhanced homologous recombination.

ג&#39;ין משופר Nuclease אבץ אצבע מיקוד בתאי גזע עוברי האנושי

One major limitation with current human embryonic stem cell (ESC) differentiation protocols is the generation of heterogeneous cell ...

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes

Mammalian meiosis is a dynamic developmental process that occurs in germ cells and can be studied and characterized. Using a method to spread nuclei on the surface of slides (rather than dropping them from a height), we demonstrate an optimized technique on mouse spermatocytes that was first described in 1997. This method is widely used in laboratories to study mammalian meiosis because it yields a plethora of high quality nuclei undergoing substages of prophase I. Seminiferous tubules are first placed in a hypotonic solution to swell spermatocytes. Then spermatocytes are released into a sucrose solution to create a cell suspension, and nuclei are spread onto fixative-soaked glass slides. Following immunostaining, a diversity of proteins germane to meiotic processes can be examined. For example, proteins of the synaptonemal complex, a tripartite structure that connects the chromosome axes/cores of homologs together can be easily visualized. Meiotic recombination proteins, which are involved in repair of DNA double-strand breaks by homologous recombination, can also be immunostained to evaluate progression of prophase I. Here we describe and demonstrate in detail a technique widely used to study mammalian meiosis in spermatocytes from juvenile or adult male mice.

Meiosis is the developmental process by which gametes are formed through a single round of DNA replication and two successive rounds of chromosome segregation. Mammalian meiosis can be examined by utilizing a technique to prepare meiotic chromosome spreads. Here, we demonstrate a method of preparing surface-spread nuclei from mouse spermatocytes.

הכנה של כרומוזום Meiotic מתפשטת העכבר Spermatocytes

Mammalian meiosis is a dynamic developmental process that occurs in germ cells and can be studied and characterized. Using a method to spread nuclei on ...