ציוד <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמות תרבות חממה, 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרכזת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סט של micropipettors (100, 100μL) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המים באמבטיה 37 ° C </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אמבט המים 90 מעלות צלזיוס להיות מקור של מים קיטור </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניגוד שלב מיקרוסקופ </li></ul> צעד ראשון טיפול בתאי עם colcemid בהליך זה השתמשנו קו hESC H9 תרבותי על fibroblasts העכבר עובריים (MEF) מומת עם mitomycin C (Sigma) ומתוחזק DMEM/F12 (Invitrogen) בתוספת החלפת בנוקאאוט 20% נסיוב (KSR, Gibco) ו 8ng/mL של גורם גדילה פיברובלסטים (FGF-2, R &amp; D). כדי לקבל מספר גדול של ממרחים metaphases, מומלץ להשתמש תרבויות עם מדד גבוה mitotic שבו יש חלוקת תאים רבים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את הבקבוק תרבות מן החממה, בזרימה למינרית, להוסיף Colcemid בריכוז סופי של 0.1 מיקרוגרם / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזירים את הבקבוק אל האינקובטור ולחכות 3 שעות כל כך מעכב יכולה לגרום למעצר mitotic על metaphase, כאשר כרומוזומים מרוכזים היטב ניתן דמיינו בקלות מתחת למיקרוסקופ. </li></ol> תיקון התאים <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קחו את המדיום ולהוסיף tripsin / EDTA 0.05% מספיק כדי לכסות את פני השטח לתאים. אפשר תאים כדי לדגור במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן להשבית את האנזים או על ידי הוספת בינוני תרבות המכילה סרום או פשוט על ידי הוספת נסיוב לתאים. הערה: חשוב לוודא כי השעיה תא בודד מושגת להשיג מתפשט metaphase טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת התאים לצינור צנטריפוגה 15 מ&quot;ל ו - 122 גרם ב צנטריפוגות במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant, והשאיר על 200 מ&quot;ל, ו resuspend את הכדור בעדינות על ידי הקשה על הצינור, כפי שמוצג בסרטון. ודא התאים ניתק היטב, כך שאתה לא יכול לדמיין את כל הגושים בתמיסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבא תצטרך להוסיף 5 מ&quot;ל של תמיסת hypotonic (KCl 75mm) מראש לחמם 37 ° C, לאט, על ידי הקיר צינור כמו בתיאור הבא. ראשית להוסיף 3 מ&quot;ל, להפוך לצינור למצב אופקי פשוט לערבב את התאים עם פתרון hypotonic מכן להוסיף את שאר מ&quot;ל 2 ו להתחמם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. הערה: בשלב זה הפתרון hypotonic יגרום לעלייה בנפח הסלולר לעזור לפענח את הכרומוזומים. זמן הדגירה חשוב לרכוש מתפשט כרומוזום טוב. אם העיתוי הוא ארוך מדי, קרום התא עשוי לפרוץ מוקדם מדי כרומוזומים יאבדו. אם קצר מדי, זה יכול להיות קשה להשיג מתפשט כרומוזום כי קרום התא לא יכול לשבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 טיפות של הפתרון מקבע (מתנול / חומצה אצטית קרחונית 03:01), להפוך את הצינור בעדינות כדי לערבב את הפתרון מקבע עם תאים צנטריפוגות ב 122 גר &#39;במשך 5 דקות ללא הפסקה. הערה: הפתרון צריך להיעשות מקבע עתה. הערה: חשוב להשתמש צנטריפוגה ללא הפסקה, כדי למנוע שחיקה התאים, מניעת אובדן של החומר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant, והשאיר על 200 מ&quot;ל, ו resuspend את הכדור בעדינות על ידי הקשה על החלק התחתון של הצינור. הערה: שוב, לוודא התאים ניתק היטב, כך שאתה לא יכול לדמיין את כל הגושים בתמיסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את הראשון 3 מ&quot;ל של תמיסת מקבע, לאט ליד הקיר צינור, תוך כדי לסובב את הצינור. הפוך את הצינור למצב אופקי פשוט לערבב את התאים, ולאחר מכן להוסיף עוד 2 מ&quot;ל של הפתרון מקבע ליד הקיר צינור לקחת את התאים מטה. במלאי ב 4 ° C למשך הלילה. הערה: תאים קבוע ניתן לאחסן פתרון מקבע במשך חודשים 4 ° C. מלבד הגנה על תאים במצב נפוח שלהם, הפתרון מקבע מסיר שומנים וחלבונים denatures. אירועים אלה להפוך את קרום התא שברירי, וכתוצאה מכך, להפוך את כרומוזום מתפשטת בקלות. </li></ol> ניקוי שקופיות הזכוכית לפני תחילת ביצוע מתפשט כרומוזום שלך לוודא כי השקופיות מנקים כמו שצריך אחרת אתם עלולים לאבד כמה גרעינים וגם metaphases. שלב זה הוא חשוב גם אם אתה רוצה לנסות כל טכניקה הכלאה 9. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום שקופיות כוס המכילה HCl 6M לפחות 3 שעות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופה זו, לשטוף במים זורמים שקופיות ברז למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את השקופיות במים מזוקקים ולתת להם להתייבש בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו השקופיות ניתן לאחסן לתוך אתנול 96% מיובשים עם ונטולת מוך מיד לפני השימוש. </li></ol> הערה: לקבלת בשיטות הכלאה באתרו, השקופיות לא ניתן לאחסן יותר מ 2 ימים לתוך אתנול 96% שלב השני כביסה התאים <ol start="10" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, צנטריפוגה התאים ב 122 גר &#39;במשך 5 דקות ללא הפסקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Discard supernatant עוזב על 200 מ&quot;ל. Resuspend גלולה מצליף בעדינות על ידי צינור ולאחר מכן להוסיף 5 מ&quot;ל של תמיסת טרי מקבע (מתנול / חומצה אצטית קרחונית 03:01), לאט ליד הקיר צינור תוך סיבוב הצינור. חזור על שלב 2 לשטוף יותר פעמים עבור סכום כולל של שלושה שוטף. הערה: הפתרון צריך להיעשות מקבע עתה. </li></ol> הכנת שקופיות <ol start="12" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצעד צנטריפוגה האחרון לעזוב כמות מספקת של פתרון homogenize התא גלולה ולקבל צפיפות מספקת של תאים השקופיות (ראה תרשים 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20-30 μL ההשעיה תא לשקופית יבש ונקי על ידי העברת פיפטה קרוב מאוד ובמקביל פני השטח. כמו מתאדה פתרון מקבע, את פני השטח של שקופיות הופך מגורען. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לחשוף את השקופית, עם הפנים כלפי מעלה, לתוך האדים של מים חמים (90 מעלות) למשך 30 שניות כדי לגרום לתאים לפוצץ. הערה: ברגע זה, מתנול מ מתאדה פתרון מקבע, וכתוצאה מכך גדל ריכוז חומצה אצטית, אשר יחד עם המים מגרה את כרומוזום מתפשטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תראו מיקרוסקופ לעומת השלב רק כדי לבדוק אם הריכוז כמו גם את חלוקת התא הוא טוב (ראו תרשים 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו השקופיות מוכנים לשמש כדי לבדוק את ערכה של כרומוזומים על ידי גישות cytogenetics כמו ה-G-banding (Giemsa) SKY, דגים, או CGH. </li></ol> חשוב רמזים איך לבחור metaphase נאותה כדי להיות מנותח בחירת metaphases עגולים מבודדים (דמות 2D), אתה עשוי להימנע בהתחשב aneuploidies כוזבת רווח של כרומוזומים שנוצר על ידי שניים או יותר מרווחי מעורבבים יחד או אובדן של כרומוזומים שנוצר על ידי כרומוזום השיק. אז, להימנע מבחירת metaphases ליד גרעינים כי כמה כרומוזומים עשוי להיות מוסתר על ידי אותם (דמות 2 א ו -2). חוץ מזה, לחפש metaphases עגול להיות בטוח כי כל כרומוזום מופרד מן metaphase (דמות 2C). מזין תאים קריוטיפ hESC עבור ה-G-banding וניתוח SKY, נוכחות של תאים מזין בתרבות hESC לא להפריע התוצאות, כי התאים מזין אינם תחת מדינה חלוקת (מומת על ידי mitomycin C או הקרנה) ולא יהיה חלק מהאוכלוסייה metaphase. עם זאת, עבור היישום של טכניקה דגים גרעינים שלבי הביניים, הוא העדיף להפריד את האוכלוסייה hESC מתאי מזין ידי קצירת המושבות ידנית לפני trypsinization לניתוח FISH. <img border="0" src="/files/ftp_upload/1512/1512fig1tmb.jpg" alt="איור 1" /> איור 1: איך לדעת את צפיפות התאים המתאימים השקופיות. תמונות של המיקרוסקופ שלב הניגוד אובייקטיבי 10x. (א) צפיפות התאים גבוהה מדי. החיצים מצביעים על metaphase מתפשטת קרוב מדי של גרעינים. (ב) שקופית עם צפיפות התאים טוב. חוגים מראים metaphases מתפשט מבודד גרעינים או metaphases אחרים. אנא <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1512/1512fig1.jpg">לחץ כאן</a> כדי לראות גרסה גדולה יותר של דמות 1. <img border="0" src="/files/ftp_upload/1512/1512fig2tmb.jpg" alt="איור 2" /> איור 2: איך לבחור metaphase נאותה כדי להיות מנותח. הכרומוזומים הם מוכתמים DAPI ותמונות מתקבל על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי ב אובייקטיבית 100x. (א) (ב) להימנע metaphases ליד גרעינים (מסומנת בחצים) (C) metaphases לא עגול כי הכרומוזומים מופרדים נוכח (עיגול). (ד) metaphase עגול הוא metaphase טוב כדי להיות מנותח. אנא <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1512/1512fig2.jpg">לחץ כאן</a> כדי לראות גרסה גדולה יותר של הדמות 2.

<ol>
	<li>Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1145 (1998).</li><li>Draper, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+gain+of+chromosomes+17q+and+12+in+cultured+human+embryonic+stem+cells.">Recurrent gain of chromosomes 17q and 12 in cultured human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 22 (1), 53-53 (2004).</li><li>Maitra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+alterations+in+cultured+human+embryonic+stem+cells.">Genomic alterations in cultured human embryonic stem cells.</a> Nat Genet. 37 (10), 1099-1099 (2005).</li><li>Mitalipova, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserving+the+genetic+integrity+of+human+embryonic+stem+cells.">Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 23 (1), 19-19 (2005).</li><li>Buzzard, J. J., Gough, N. M., Crook, J. M., Colman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Karyotype+of+human+ES+cells+during+extended+culture.">Karyotype of human ES cells during extended culture.</a> Nat Biotechnol. 22 (4), 381-381 (2004).</li><li>Caisander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+integrity+maintained+in+five+human+embryonic+stem+cell+lines+after+prolonged+in+vitro+culture.">Chromosomal integrity maintained in five human embryonic stem cell lines after prolonged in vitro culture.</a> Chromosome Res. 14 (2), 131-131 (2006).</li><li>Imreh, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+culture+conditions+favoring+selection+of+chromosomal+abnormalities+in+human+ES+cells.">In vitro culture conditions favoring selection of chromosomal abnormalities in human ES cells.</a> J Cell Biochem. 99 (2), 508-508 (2006).</li><li>Robin-Wesselschmidt, J. L., Loring, J. F., Robin-Wesselschmidt, J. L., Robin-Wesselschmidt, S. c. h. w. a. r. t. z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Stem Cell Manual. , 59-59 (2007).</li><li>Rooney, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Cytogenetics. , (2001).</li><li>Heslop-Harrison, P., Schwarzacher, T., Heslop-Harrison, P., Schwarzacher, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical in situ hybridization. , 51-51 (2000).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

הכנת ממרחים כרומוזום הוא שלב קריטי לניתוח מוצלח של מצב גנטי של תאים עובריים באופן שגרתי על ידי טכניקות כמו ה-G-banding, טכניקות מתוחכמות יותר כגון דגים, SKY ו - CGH. הליך זה יכול להיות מיושם על סוגי תאים רבים על ידי שינוי תקופת הדגירה colcemid, ...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>15 ml centrifuge tube</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>TPP</td>
<td>91015</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Colcemid Karyo MAX</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>15212-012</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Isofar</td>
<td>721</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glacial acetic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Isofar</td>
<td>100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Isofar</td>
<td>208</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck</td>
<td>104.931.000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Slide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bioslide</td>
<td>7105-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tripsin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SIGMA</td>
<td>T4799</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

chromosomal spread preparation of human embryonic stem cells for karyotyping

למרות בתאי גזע עובריים אנושיים (hESC) הוכחו מציגים קריוטיפ דיפלואידי יציב 1, מחקרים רבים דיווחו כי בהתאם לתנאי התרבות הם הופכים נוטה לרכוש מומים כרומוזומליים כגון תוספת של שלם או חלקי כרומוזומים. ואכן, במהלך לתרבות לטווח ארוך, שינויים karyotypic הם נצפו כאשר אנזימטית או כימי דיסוציאציה משמשים 2,3,4, בעוד דיסקציה ידנית של המושבות עבור passaging שומרת קריוטיפ יציב 5. חוץ מזה, שינויים בסביבה, כגון הסרת תאים מזין גם נראה להתפשר על שלמות הגנטי של hESC 3,6. לאחר שינויים כרומוזומליים יכולים להשפיע על הפיזיולוגיה הסלולר, אפיון של שלמות הגנטי של hESC במבחנה הוא hESC בהתחשב מכריע ככלי חיוני במחקרים embryogenesis בדיקות סמים. יתר על כן, למטרות טיפוליות עתידיות שינויים כרומוזומליים הם חשש ממשי כפי שהוא מזוהה לעתים קרובות סרטן. כאן אנו מציגים שיטה פשוטה ושימושית להשיג איכות גבוהה כרומוזום מתפשט עבור ניתוח בדיעבד של כרומוזום שנקבעו על ידי G-banding SKY, דגים או טכניקות CGH 7,8. אנו ממליצים לבדוק את מצב הכרומוזומים באופן שגרתי במרווחים של 5 קטעים על מנת לפקח על המראה של טרנסלוקציות ו aneuploidies Priscila Britto ו Rafaela Sartore תרמו באופן שווה על הנייר.

Watch this Scientific Journal Video about Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping at JoVE.com

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Karyotyping היא טכניקה פשוטה ושימושית בשימוש נרחב לאיתור שינויים גנטיים. כאן אנו מתארים צעד אחר צעד להכנת פרוטוקול כרומוזום התפשטות בתאי גזע עובריים אנושיים לניטור מצב הכרומוזומים של תאים אלה נשמר בתרבות.

מורחים הכנה כרומוזומלית של בתאי גזע עובריים אנושיים עבור Karyotyping

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture ...

chromosomal-spread-preparation-human-embryonic-stem-cells-for

Research

JoVE Journal

Biology

48.5K Views.  Federal University of Rio De Janeiro-UFRJ. Karyotyping היא טכניקה פשוטה ושימושית בשימוש נרחב לאיתור שינויים גנטיים. כאן אנו מתארים צעד אחר צעד להכנת פרוטוקול כרומוזום התפשטות בתאי גזע עובריים אנושיים לניטור מצב הכרומוזומים של תאים אלה נשמר בתרבות.

Video: Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

רביה של האדם גזע עובריים (ES) תאים

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

גזירת בתאי גזע hematopoietic מ Murine בתאי גזע עובריים

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

גזירת בתאי גזע עובריים אנושיים על ידי Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and programmed cell death. Mitochondria produce ATP, regulate the cytoplasmic redox state and Ca2+ balance, catabolize fatty acids, synthesize heme, nucleotides, steroid hormones, amino acids, and help assemble iron-sulfur clusters in proteins. Mitochondria also have an essential role in heat production. Mutations of the mitochondrial genome cause several types of human disorder. The accumulation of mtDNA mutations correlates with aging and is suspected to have an important role in the development of cancer. Due to their vitally important role in all cell types, the function of mitochondria must also be critical for stem cells. Key advances have been made in our understanding of stem cell viability, proliferation, and differentiation capacity. But the functional activity of stem cells, in particular their energy status, was not yet been studied in detail. Almost nothing is known about the mitochondrial properties of human embryonic stem cells (hESCs) and their differentiated precursor progeny. One way to understand and evaluate the role of mitochondria in hESC function and developmental potential is to directly measure the activity of mitochondrial respiratory complexes. Here, we describe high resolution clear native gel electrophoresis and subsequent in gel activity visualization as a method for analyzing the five respiratory chain complexes of hESCs.

In this video, we will show you how the mitochondrial respiratory chain complexes of human embryonic stem cells can be analyzed using in gel activity assays.

גשוש עבור פעילות קומפלקס מיטוכונדריאלי של בתאי גזע עובריים אנושיים

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

הכרומטין immunoprecipitation מן בתאי גזע עובריים אנושיים

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of the predominant imaging modalities to assess the restoration of the injured myocardium. Furthermore, ex-vivo labeling agents, such as iron-oxide nanoparticles, have been employed to track and localize the transplanted stem cells. However, this method does not monitor a fundamental cellular biology property regarding the viability of transplanted cells. It has been known that manganese chloride (MnCl2) enters the cells via voltage-gated calcium (Ca2+) channels when the cells are biologically active, and accumulates intracellularly to generate T1 shortening effect. Therefore, we suggest that manganese-guided MRI can be useful to monitor cell viability after the transplantation of hESC into the myocardium.
In this video, we will show how to label hESC with MnCl2 and how those cells can be clearly seen by using MRI in vitro. At the same time, biological activity of Ca2+-channels will be modulated utilizing both Ca2+-channel agonist and antagonist to evaluate concomitant signal changes.

In this video, we are showing how to label human embryonic stem cells (hESC) with manganese chloride (MnCl2) which can enter cells via voltage-gated calcium channels when the cells are biologically active. Additionally, we show the use of MnCl2 as cellular MRI contrast agent to determine the in vitro viability of hESC.

ב סימון במבחנה של בתאי גזע עובריים אנושיים עבור דימות תהודה מגנטית

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be  fed  every day by performing a complete medium change to replenish lost nutrients and to keep the cultures free of unwanted differentiation factors. Although a small amount of differentiation is normal and expected in stem cell cultures, the culture should be routinely cleaned up by manually removing, or "picking" differentiated areas. Identifying and removing excess differentiation from hES cell cultures are essential techniques in the maintenance of a healthy population of cells.

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

This protocol demonstrates how to maintain healthy, undifferentiated human embryonic stem (ES) cells.

תרבות ותחזוקה של בתאי גזע עובריים אנושיים

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

מקפיא הפשרה בתאי גזע עובריים אנושיים

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

התמיינות של תאים עובריים לתוך מבשרי Oligodendrocyte

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.