EKİPMAN <ul><li> Doku kültürü inkübatör, 37 ° C,% 5 CO 2 </li><li> Santrifüj </li><li> Set micropipettors (100 100μL) </li><li> Su banyosu, 37 ° C </li><li> Su banyosu, 90 ° C buhar su kaynağı olarak </li><li> Faz kontrast mikroskobu </li></ul> İLK ADIM Colcemid ile hücrelerin tedavisi Bu prosedürde,% 20 nakavt serum replasmanı (KSR, Gibco) ve 8ng/mL, ile desteklenmiş, mitomisin C (Sigma) ile inaktive ve DMEM/F12 (Invitrogen) muhafaza fare embriyonik fibroblastlar (MEF) üzerine kültür H9 hESC hattı fibroblast büyüme faktörü (FGF-2, Ar-Ge). Metafaz yayılır, çok sayıda elde etmek için, birçok bölünen hücreleri vardır yüksek mitotik indeksi ile kültürlerin kullanılması tavsiye edilir. <ol><li> Inkübatör kültür şişesi alın ve laminer akış, son bir 0,1 mg / ml konsantrasyonda Colcemid eklemek. </li><li> Inkübatör balon dönün ve 3 saat bekleyin inhibitörü, kromozomlar yoğunlaşmış ve mikroskop altında kolayca görüntülenebilmekte metafaz, mitoz tutuklama neden olabilir. </li></ol> Hücrelerin Tespit <ol start="3"><li> Orta çıkarın ve hücrelerin yüzeyini kaplayan tripsin / EDTA% 0.05 &#39;yeterli eklemek. Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin ve sonra serum içeren kültür ortamı ekleyerek veya sadece hücreler serum ekleyerek ya enzim inaktive etmek için izin verin. NOT: iyi metafaz yayılır elde etmek için tek bir hücre süspansiyonu elde edilir emin yapmak için çok önemlidir. </li><li> 15 ml santrifüj tüpüne ve 5 dakika boyunca 122 g santrifüj hücrelere aktarın. </li><li> 200 ml hakkında bırakarak süpernatantı atın ve hafifçe videoda gösterildiği gibi tüp, dokunarak pelet tekrar süspansiyon haline getirin. Hücrelerin iyi ayrışmış, bu nedenle çözüm kümeleri görselleştirmek emin olun. </li><li> Sonra 5 ml hipotonik çözüm (KCl 75mm) 37 önceden ısıtılmış ° C, yavaş yavaş, aşağıdaki açıklamayı olduğu gibi tüp duvar eklemeniz gerekecektir İlk tüp invert hipotonik bir çözüm hemen sonra hücrelerin bir arada kalan 2 ml ekleyin ve 37 sıcak tutmak ° C 15 dakika boyunca yatay konumda, 3 ml ekleyin. NOT: Bu noktada hipotonik çözüm hücresel birimde bir artışa neden ve kromozomlar ayıklayabilir yardımcı olacaktır. Inkübasyon süresi, iyi bir kromozom elde etmek için önemlidir. Zamanlaması çok uzun ise, hücre zarı, çok erken ve kromozomlar kaybolur patlayabilir. Eğer çok kısa olursa, hücre zarı bozabilir çünkü kromozom yayılır elde etmek zor olabilir. </li><li> Fiksatif solüsyonu (metanol / asetik asit buzul 03:01) 3 damla ekleyin, 5 dakika ara vermeden 122 g hücreleri ve santrifüj fiksatif çözüm karıştırmak için tüp nazikçe çevirin. NOT: fiksatif solüsyon taze yapılmalıdır. NOT: malzeme kaybını önleyerek, hücrelerin yıpratma önlemek için ara vermeden santrifüj kullanmak önemlidir. </li><li> 200 ml hakkında bırakarak süpernatantı atın ve yavaşça tüpün alt dokunarak pelet tekrar süspansiyon haline getirin. NOT: Yine, hücrelerin iyi ayrışmış, bu nedenle çözüm kümeleri görselleştirmek emin olun. </li><li> Tüp döndürmek ederken, yavaş yavaş, fiksatif çözüm tüp duvar ilk 3 mL ekleyin. Hücrelerin karışımı, ve daha sonra tüp duvar hücreleri aşağı çekmek için 2 mL fiksatif çözüm daha eklemek için yatay pozisyonda Tüpü ters çevirin. 4 ° C gecede Stok. NOT: sabit hücreler, 4 ay için sabitleştirici çözüm saklanabilir ° C Kendi şişmiş durumda hücrelerini koruyarak yanı sıra, fiksatif çözüm lipitleri ve denatüre proteinlerin ortadan kaldırır. Bu olaylar sonucunda, kromozom kolayca yayılmasını, hücre zarının kırılgan yapmak ve. </li></ol> CAM KAYDIRAKLARI TEMİZLİK Kromozom yayılır slaytlarınız düzgün bir şekilde temizlenir veya bazı çekirdeklerin kaybedebilirsiniz ve aynı zamanda metafaz ki emin olun başlamadan önce. Eğer herhangi bir hibridizasyon tekniği 9 denemek istiyorsanız bu adımı yanı sıra önemlidir . <ol><li> Yeri oda sıcaklığında en az 3 saat 6M HCl içeren bir beher slaytlar. </li><li> Bu süreden sonra, 10 dakika boyunca çalışan musluk suyu slaytlar yıkayın. </li><li> Slaytları distile su ile çalkalayın ve oda sıcaklığında kurumaya bırakın. </li><li> Şimdi slaytlar% 96 etanol içinde saklanan ve kullanmak için bir havsız hemen önce kurutulmuş olabilir. </li></ol> NOT: situ hibridizasyon yöntemleri için, slaytlar, en fazla 2 gün boyunca% 96 etanol içine saklanabilir olamaz İkinci adım Çamaşır hücreler <ol start="10"><li> Ertesi gün, 5 dakika ara vermeden 122 g hücreler santrifüj. </li><li> D200 ml bırakarak süpernatant iscard. Nazikçe tüp dönerken tüp tüp duvar sonra yavaş yavaş taze fiksatif solüsyonu 5 ml (metanol / asetik asit buzul 03:01) eklemek Flicking pelletini tekrar. Bu yıkama üç yıkama olmak üzere toplam 2 kez daha adımı yineleyin. NOT: fiksatif solüsyon taze yapılmalıdır. </li></ol> Slaytlar hazırlanması <ol start="12"><li> (Bkz. Şekil 1) hücre pelletini homojenize ve slaytlar hücrelerin yeterli bir yoğunluk elde etmek için çözüm son santrifüj aşamada yeterli miktarda bırakın. </li><li> 20-30 mcL hücre süspansiyonu, temiz ve kuru bir slayt yüzeye çok yakın ve paralel hareket pipet üzerine ekleyin. Fiksatif çözüm buharlaşır gibi, slayt yüzeyi grenli olur. </li><li> Hemen havaya uçurmak hücrelerin neden 30 saniye süreyle sıcak su, buhar (90 °) içine, slayt maruz yüzü yukarı. NOT: Şu anda, asetik asit konsantrasyonu artmış ile sonuçlanan, metanol, fiksatif çözüm buharlaşır, su ile birlikte yayılan kromozom uyarır. </li><li> Açabildiği gibi, hücre dağılımı (bkz. Şekil 1) iyi olup olmadığını kontrol etmek için bir faz kontrast mikroskobu bakın. </li><li> Şimdi slaytlar G-bantlama (Giemsa), FISH, SKY veya CGH gibi yaklaşımlar sitogenetik kromozom seti kontrol etmek için kullanılmaya hazır. </li></ol> ÖNEMLİ İPUÇLARI Nasıl tercih analiz edilmesi için yeterli bir metafaz Yuvarlak ve izole metafaz (Şekil 2B) seçmek, iki veya daha fazla kromozom kazanç birlikte karışık veya başlattı kromozom tarafından oluşturulan kromozom kaybı yayılır yanlış anöploidiler dikkate kaçınmak olabilir. Yani, bazı kromozom (Şekil 2A ve 2B) tarafından gizli olabilir çünkü çekirdekleri yakın metafaz seçerek kaçının. Ayrıca, yuvarlak metafaz bakmak ve herhangi bir kromozom metafaz (Şekil 2C) ayrılmış olduğundan emin olun. Besleyici hücreleri ve hESC karyotip G-bantlama ve SKY analizi için, besleyici hücreler bölünerek devlet (mitomisin C veya ışınlama ile inaktif) altında değildir ve metafaz nüfusunun parçası olmayacaktır çünkü besleyici hücreler hESC kültür varlığı, sonuçları ile müdahale değildir. Ancak,, interfaz çekirdekleri FISH tekniğinin uygulanması için, besleyici hücrelerin koloniler FISH analizi için trypsinization önce elle hasat hESC nüfus ayırmak için tercih edilir. <img border="0" src="/files/ftp_upload/1512/1512fig1tmb.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1: slayt uygun hücre yoğunluğu nasıl biliyoruz. 10x objektif faz kontrast mikroskop görüntülerini. (A) hücre yoğunluğu çok yüksek. Ok çok yakın çekirdekleri yayılır metafaz işaret etmektedir. (B) iyi bir hücre yoğunluğu ile bir slayt. Çevreler, çekirdekleri veya diğer metafaz izole metafaz yayılır göstermektedir. Lütfen Şekil 1&#39;de bir büyük halini görmek için <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1512/1512fig1.jpg">buraya tıklayınız</a> . <img border="0" src="/files/ftp_upload/1512/1512fig2tmb.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2: Nasıl analiz edilmesi için yeterli bir metafaz seçin. Kromozomlar DAPI ve 100x objektif bir floresan mikroskobu ile elde edilen görüntüler ile boyandı. (A) (B) çekirdekleri yakın metafaz kaçının (oklarla gösterilen) (C) ve mevcut kromozom ayrılmış (daire) yuvarlak değil metafaz. (D) yuvarlak metafaz analiz edilmesi için iyi bir metafaz. Lütfen Şekil 2&#39;de büyük halini görmek için <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1512/1512fig2.jpg">buraya tıklayın</a> .

<ol>
	<li>Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1145 (1998).</li><li>Draper, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+gain+of+chromosomes+17q+and+12+in+cultured+human+embryonic+stem+cells.">Recurrent gain of chromosomes 17q and 12 in cultured human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 22 (1), 53-53 (2004).</li><li>Maitra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+alterations+in+cultured+human+embryonic+stem+cells.">Genomic alterations in cultured human embryonic stem cells.</a> Nat Genet. 37 (10), 1099-1099 (2005).</li><li>Mitalipova, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserving+the+genetic+integrity+of+human+embryonic+stem+cells.">Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 23 (1), 19-19 (2005).</li><li>Buzzard, J. J., Gough, N. M., Crook, J. M., Colman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Karyotype+of+human+ES+cells+during+extended+culture.">Karyotype of human ES cells during extended culture.</a> Nat Biotechnol. 22 (4), 381-381 (2004).</li><li>Caisander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+integrity+maintained+in+five+human+embryonic+stem+cell+lines+after+prolonged+in+vitro+culture.">Chromosomal integrity maintained in five human embryonic stem cell lines after prolonged in vitro culture.</a> Chromosome Res. 14 (2), 131-131 (2006).</li><li>Imreh, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+culture+conditions+favoring+selection+of+chromosomal+abnormalities+in+human+ES+cells.">In vitro culture conditions favoring selection of chromosomal abnormalities in human ES cells.</a> J Cell Biochem. 99 (2), 508-508 (2006).</li><li>Robin-Wesselschmidt, J. L., Loring, J. F., Robin-Wesselschmidt, J. L., Robin-Wesselschmidt, S. c. h. w. a. r. t. z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Stem Cell Manual. , 59-59 (2007).</li><li>Rooney, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Cytogenetics. , (2001).</li><li>Heslop-Harrison, P., Schwarzacher, T., Heslop-Harrison, P., Schwarzacher, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical in situ hybridization. , 51-51 (2000).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Kromozom yayılır hazırlık, G-bantlama ve BALIK, SKY ve CGH gibi daha sofistike teknikler olarak rutin teknikleri ile embriyonik kök hücrelerin genetik bir durum başarılı bir analiz için önemli bir adım. Bu prosedür, hücre döngüsü uzunluğu bağlıdır colcemid kuluçka döneminde değişen birçok hücre tipleri için uygulanabilir. (EB) embriyoid organları için bu süre 6 saate kadar ise embriyonik kök hücre kolonileri için, biz 3 saat bekleyin. <p class="jove_cont...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>15 ml centrifuge tube</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>TPP</td>
<td>91015</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Colcemid Karyo MAX</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>15212-012</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Isofar</td>
<td>721</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glacial acetic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Isofar</td>
<td>100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Isofar</td>
<td>208</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck</td>
<td>104.931.000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Slide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bioslide</td>
<td>7105-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tripsin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SIGMA</td>
<td>T4799</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

chromosomal spread preparation of human embryonic stem cells for karyotyping

Insan embriyonik kök hücreleri (hESC) istikrarlı bir diploid karyotip 1 sunmak için gösterilmiş olsa da, pek çok çalışmada, kültür koşullarına bağlı olarak bütün ek veya kromozom parçaları gibi kromozomal anomaliler elde eğilimli hale bildirmişlerdir. Gerçekten de, enzimatik veya kimyasal disosiasyon 2,3,4 kullanıldığında Pasajlanması için koloniler manuel diseksiyon istikrarlı bir karyotip 5 korur, uzun vadeli kültür sırasında karyotipik değişiklikler gözlenir. Bunun yanı sıra, besleyici hücrelerin ortadan kaldırılması gibi çevre değişiklikleri de hESC 3,6 genetik bütünlüğünü tehlikeye görünüyor. Kromozomal bozukluklar önemli dikkate alınarak hESC embriyogenez çalışmaları ve uyuşturucu testi için gerekli bir araç olarak, in vitro genetik bütünlüğü hESC karakterizasyonu hücresel fizyoloji etkileyebilir. Ayrıca, gelecekte tedavi amaçlı kromozomal değişiklikler sık ​​karsinogenez ilişkili olarak gerçek bir endişe vardır. Burada G-bantlama, FISH, SKY veya CGH teknikleri 7,8 kromozom sonraki analiz için yüksek kalitede kromozom yayılır elde etmek için basit ve kullanışlı bir yöntem gösteriyor . Translokasyonlar ve anöploidiler görünümünü izlemek için rutin kromozomal durumu 5 pasajların aralıklarla kontrol etmenizi öneririz Priscila Britto ve Rafaela Sartore kağıt üzerinde eşit olarak katkıda bulundu.

Watch this Scientific Journal Video about Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping at JoVE.com

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Karyotipleme genetik değişiklikler tespit etmek için yaygın olarak kullanılan basit ve kullanışlı bir bir tekniktir. Burada bakımı, kültür bu hücrelerin kromozom durum izleme için insan embriyonik kök hücrelerin kromozom yayılmış hazırlık için adım protokol tarafından bir adım açıklanmaktadır.

Karyotipik İnsan Embriyonik Kök Hücreleri kromozom Yayılı Hazırlık

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture ...

chromosomal-spread-preparation-human-embryonic-stem-cells-for

Research

JoVE Journal

Biology

48.5K Görüntüleme.  Federal University of Rio De Janeiro-UFRJ. Karyotipleme genetik değişiklikler tespit etmek için yaygın olarak kullanılan basit ve kullanışlı bir bir tekniktir. Burada bakımı, kültür bu hücrelerin kromozom durum izleme için insan embriyonik kök hücrelerin kromozom yayılmış hazırlık için adım protokol tarafından bir adım açıklanmaktadır.

Video: Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

İnsan Embriyonik Kök Hücre (ES) yayılması

Biyoloji

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Murin Embriyonik Kök Hücre Hematopoetik Kök Hücre türetilmesi

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

Immunosurgery İnsan Embriyonik Kök Hücreleri türetilmesi

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and programmed cell death. Mitochondria produce ATP, regulate the cytoplasmic redox state and Ca2+ balance, catabolize fatty acids, synthesize heme, nucleotides, steroid hormones, amino acids, and help assemble iron-sulfur clusters in proteins. Mitochondria also have an essential role in heat production. Mutations of the mitochondrial genome cause several types of human disorder. The accumulation of mtDNA mutations correlates with aging and is suspected to have an important role in the development of cancer. Due to their vitally important role in all cell types, the function of mitochondria must also be critical for stem cells. Key advances have been made in our understanding of stem cell viability, proliferation, and differentiation capacity. But the functional activity of stem cells, in particular their energy status, was not yet been studied in detail. Almost nothing is known about the mitochondrial properties of human embryonic stem cells (hESCs) and their differentiated precursor progeny. One way to understand and evaluate the role of mitochondria in hESC function and developmental potential is to directly measure the activity of mitochondrial respiratory complexes. Here, we describe high resolution clear native gel electrophoresis and subsequent in gel activity visualization as a method for analyzing the five respiratory chain complexes of hESCs.

In this video, we will show you how the mitochondrial respiratory chain complexes of human embryonic stem cells can be analyzed using in gel activity assays.

İnsan Embriyonik Kök Hücreleri Mitokondrial Kompleksi Aktivite araştırmayı

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

İnsan Embriyonik Kök Hücre Kromatin Immunoprecipitation

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of the predominant imaging modalities to assess the restoration of the injured myocardium. Furthermore, ex-vivo labeling agents, such as iron-oxide nanoparticles, have been employed to track and localize the transplanted stem cells. However, this method does not monitor a fundamental cellular biology property regarding the viability of transplanted cells. It has been known that manganese chloride (MnCl2) enters the cells via voltage-gated calcium (Ca2+) channels when the cells are biologically active, and accumulates intracellularly to generate T1 shortening effect. Therefore, we suggest that manganese-guided MRI can be useful to monitor cell viability after the transplantation of hESC into the myocardium.
In this video, we will show how to label hESC with MnCl2 and how those cells can be clearly seen by using MRI in vitro. At the same time, biological activity of Ca2+-channels will be modulated utilizing both Ca2+-channel agonist and antagonist to evaluate concomitant signal changes.

In this video, we are showing how to label human embryonic stem cells (hESC) with manganese chloride (MnCl2) which can enter cells via voltage-gated calcium channels when the cells are biologically active. Additionally, we show the use of MnCl2 as cellular MRI contrast agent to determine the in vitro viability of hESC.

İnsan Embriyonik Kök Hücreleri Manyetik Rezonans Görüntüleme için in vitro Etiketleme

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be  fed  every day by performing a complete medium change to replenish lost nutrients and to keep the cultures free of unwanted differentiation factors. Although a small amount of differentiation is normal and expected in stem cell cultures, the culture should be routinely cleaned up by manually removing, or "picking" differentiated areas. Identifying and removing excess differentiation from hES cell cultures are essential techniques in the maintenance of a healthy population of cells.

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

This protocol demonstrates how to maintain healthy, undifferentiated human embryonic stem (ES) cells.

İnsan Embriyonik Kök Hücre Kültürü ve Bakım

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

İnsan Embriyonik Kök Hücreler Donma ve Çözülme

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

Embriyonik Kök Hücreler farklılaşma oligodendrosit Öncüleri

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.