وقدم العمل المبين في هذا المخطوط بفضل تمويل من مؤسسة باتريك تايلور F..

1. كروموسوم حصاد خلايا منتسب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بروتوكول القياسية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو الخلايا وفقا لظروف زراعة خلية معينة. عندما وصلت إلى مرحلة الخلايا لوغاريتمي (80٪ confluency)، إضافة 10 ميكرولتر / مل من Colcemid إلى قارورة ثقافة الخلية. ويوصى ما لا يقل عن 2 × 10 6 خلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة لمدة 45 دقيقة. باستخدام ماصة معقمة، ونقل وسائل الاعلام من الخلايا في أنبوب 15 مل المخروطية. توضع جانبا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بلطف غسل الخلايا عن طريق إضافة 2 مل من HBSS العازلة في قارورة. دوامة العازلة ومن ثم إزالة باستخدام ماصة. تجاهل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من التربسين، وضمان أنه يغطي كامل سطح القارورة. ترك فقط الخلايا في التربسين لحوالي 2 دقيقة. بمجرد فصل الغالبية العظمى من الخلايا، ماصة وسائل الإعلام في أنبوب مخروطي مرة أخرى إلى الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل تعليق خلية في 10 مل مأخوذة في 15 مل أنابيب المخروطية.أجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 10 دقيقة. إزالة طاف و resuspend بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 مل من 0.075 M بوكل التي تم prewarmed إلى 37 درجة مئوية لبيليه المتبقية في أنبوب مخروطي. أنبوب دوامة على سرعة متوسطة لخلط بوكل والخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق عند 25 درجة مئوية. إزالة طاف (حتى حوالي 0.5 مل بقايا) و resuspend بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة بعناية 5 مل من مثبت الطازجة كاروني في (3:1 نسبة الميثانول: حمض الخليك الجليدي) إلى الخلايا بينما vortexing ل. ثم يضاف 5 مل أكثر من تثبيتي دون vortexing لليصبح المجموع 10 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة الخلايا طاف و resuspend. إضافة 5 مل من تثبيتي لكل أنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة الخلايا طاف و resuspend. إضافة 5 مل من تثبيتي لكل أنبوب. ويمكن الآن خلايا خزنها في 4 درجة مئوية لمدة سنة واحدة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التعديل في البروتوكول: harvesti كروموسومنانوغرام من خطوط الخلايا lymphoblastoid <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو الخلايا وفقا لظروف زراعة خلية معينة. (استخدام قارورة مناسبة لكمية الخلايا المستزرعة). عندما وصلت إلى مرحلة الخلايا لوغاريتمي (بعد حوالي 2 أيام انقسام الخلايا)، إضافة 10 ميكرولتر / مل من Colcemid إلى قارورة ثقافة الخلية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التعديل في البروتوكول: حصاد كروموسوم من الدم الكامل راصة دموية نباتية (PHA)، وكتين المستمدة من اللوبيا الحمراء، هو mitogen قوية لT-16 الخلايا البشرية. 72 ساعة بعد إضافة PHA للثقافة، حوالي 45٪ من الخلايا في مرحلة S. هذا يمثل ذروة النشاط التفتلي، و هو النقطة المثلى التي لحصاد للدراسات كروموسوم. mitogens أخرى مثل الفتلاق (1-10 ميكروغرام / مل) يمكن استخدامها عند تحليل الخلايا البائية 17،18. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع ما لا يقل عن 1 مل من الدم الكامل في الأخضر أعلى الصوديوم أنبوب الهيبارين. استخدام في غضون 3 أيام بعد جمع. متجر الدم في RT الامم المتحدةسمسم جاهزة للاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة 0.25 مل من الدم الكامل في 10 مل من وسائل الإعلام RPMI كاملة تحتوي على L-الجلوتامين (20٪ مصل بقري جنيني، 1٪ البنسلين / الستربتوميسين، 1٪ fungizone، و 1٪ PHA). الثقافة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التعديل في البروتوكول: حصاد كروموسوم من نخاع العظام تحليل وراثي خلوي على نخاع العظم هو مفيد في كثير من الاضطرابات الدموية الخبيثة مثل مراقبة استنساخ غير طبيعي صبغويا قد يكون التشخيص لنوع معين من سرطان الدم. وتستخدم الدراسات كروموسوم أيضا لتقييم تطور المرض مثل بداية الأزمة الانفجار والاستجابة للعلاج. منذ خلايا نخاع العظم يتم تقسيم بنشاط، لا التحفيز mitogen ضروري 9،19. لسرطانات الدم الحادة يتم تعيين 24 و 48 ساعة الثقافات أيضا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع ما لا يقل عن 1 مل من نخاع العظام في كبار الخضراء الصوديوم أنبوب الهيبارين. قسامة 0.25 مل من نخاع العظام في 10 مل من وسائل الإعلام RPMI كاملة تحتوي على L-الجلوتامين (20٪ مصل الجنين البقري، 1٪ البنسلين / الستربتوميسين، 1٪ fungizone). الثقافة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2. </li></ol></li></ol> 2. إعداد شريحة وتلطيخ الصلبة وهناك تقييم السريع للشريحة ممثل واحد تقديم معلومات عن نوعية المحصول قبل الاستمرار في إجراءات أخرى مثل G-النطاقات، FISH، [ك]، أو SKY. بعض المختبرات تفضل وصمة عار الصلبة الخلايا لحصاد سريع وتقييم كروموسوم. بدلا من ذلك، يمكن استخدام المجهر النقيض من المرحلة لهذا التحليل. من الأفضل إعداد الشرائح عندما تكون الرطوبة حوالي 50٪ ودرجة الحرارة المحيطة (20-25 درجة مئوية). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي الخلايا في 200 x ج لمدة 5 دقائق عند 25 درجة مئوية. إزالة طاف حتى 0.3-0.5 مل فقط بقايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد إعادة التعليق بلطف بيليه، ماصة ثلاث قطرات من تعليق خلية من مسافة حوالي 2 في على شريحة الذي يميل بزاوية مقدارها حوالي 45 درجة، والسماح للتعليقللفة عبر الشريحة. إضافة قطرة واحدة كبيرة من مثبت الطازجة كاروني على الشريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجف الجزء الخلفي من الشريحة على منشفة ورقية ثم الجلوس الشريحة لتجف لمدة 10 دقيقة على الأقل. يجب أن تكون الشريحة تجف تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد جديدة تلطيخ الحل بالغيمزا (3:1 نسبة الاحتياطي جور وبالغيمزا صمة عار). وضع الشرائح على رف تلطيخ. تغطية الشريحة بأكملها في حل تلطيخ بالغيمزا. دعونا تبقى الشرائح في حل تلطيخ لمدة 5 دقائق. شطف الشرائح مع الماء المقطر، واستنزاف، والسماح للهواء الجاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 4 قطرات من Permount وانزلاق الغطاء إلى الشريحة. تأكد من عدم وجود فقاعات تحت ساترة. الفائض Permount يمكن إزالتها مع منشفة ورقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل الخلايا تحت المجهر تحت ضوء 10X والتكبير 100X. إذا كانت الخلايا الطورية وفيرة وانتشار جيدا، والشرائح المتبقية يمكن استخدامها لإجراءات تجريبية أخرى. </li></ol> 3. G-التطويق باستخدام التربسين وبالغيمزا (GTG) &lt;ع&gt; التربسين هو انزيم بروتين الذي يبدل طبيعة الهستونات الكروماتين الحقيقي في مناطق الحمض النووي مع ارتفاع النشاط النسخي الناتجة عن ذلك. تلطيخ بالغيمزا التالية، سوف تظهر هذه المناطق كما العصابات الخفيفة. سوف ونين مكثف للغاية مع النشاط النسخي ضئيلة أو معدومة (المغاير) لديها جزء كبير من الهستونات لحمايتها من التربسين وبالتالي سيكون وصمة عار على نحو مظلم التالية بالغيمزا تلطيخ. من الضروري في البداية G-الفرقة شريحة واحدة لمراقبة الأوضاع وضبط توقيت التربسين إذا لزم الأمر لالشرائح اللاحقة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الحلول التالية إلى 4 الجرار Coplin. جرة # 1 = 30 مل من 1X HBSS و 4 مل من التربسين 10X (0.5٪) جرة # 2 = 50 مل من 1X HBSS جرة # 3 = 45 مل من 1X HBSS و 5 مل من مصل بقري جنيني جرة # 4 = 50 مل من 1X HBSS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج كل شريحة في جرة # 1 لمدة 5 ثوانى، شطف سريع في جرة رقم 2، وترك كل شريحة في جرة # 3 لا يقل عن 30 ثانية، شطف سريع في جرة # 4 ثم تسمح الشرائح لتجف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد FRESح بالغيمزا تلطيخ الحل (3:1 نسبة الاحتياطي جور وبالغيمزا صمة عار). وضع الشرائح على رف تلطيخ. تغطية الشريحة بأكملها في حل تلطيخ بالغيمزا. دعونا تبقى الشرائح في حل تلطيخ لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الشرائح في الماء المقطر في نفس الترتيب الذي كانت ملطخة. تسمح الشرائح لتجف لمدة 10 دقيقة. يجب أن تكون الشريحة تجف تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 4 قطرات من Permount وانزلاق الغطاء إلى الشريحة. تأكد من عدم وجود فقاعات تحت ساترة. الفائض Permount يمكن إزالتها مع منشفة ورقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل الخلايا تحت المجهر تحت ضوء 10X والتكبير 100X. ضبط توقيت التربسين من بقية الشرائح استنادا إلى نتائج من الشريحة الأولى. </li></ol>

<ol>
	<li>Driscoll, D., Gross, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+screening+for+aneuploidy.">Prenatal screening for aneuploidy.</a> New Engl. J. Med. 360, 2556-2562 (2009).</li><li>Nussbuam, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genetics in Medicine: 7th Edition. , 76 (2007).</li><li>Ljunger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+abnormalities+in+first-trimester+miscarriages.">Chromosomal abnormalities in first-trimester miscarriages.</a> Acta Obstet. Gynecol. Scand. 84 (11), 1103-1107 (2005).</li><li>Kwinecka-Dmitri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+of+chromosomal+aberrations+in+material+from+abortions.">Frequency of chromosomal aberrations in material from abortions.</a> Ginecol. Pol. 81 (12), 896-901 (2010).</li><li>Reddy, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stillbirth+classification&#8212;Developing+an+international+consensus+for+research:+Executive+summary+of+a+national+institute+of+child+health+and+human+development+workshop.">Stillbirth classification&#8212;Developing an international consensus for research: Executive summary of a national institute of child health and human development workshop.</a> Obstet. Gynecol. 114 (4), 901-914 (2009).</li><li>Pierpoint, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+basis+for+congenital+heart+defects:+Current+knowledge.">Genetic basis for congenital heart defects: Current knowledge.</a> Circulation. 115 (23), 3015 (2007).</li><li>Kaneshiro, N., Zieve, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down+Syndrome:+Trisomy+21..">Down Syndrome: Trisomy 21..</a> PubMed Health. , (2010).</li><li>Cin, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols in Human Genetics. , (2003).</li><li>Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodologies+in+cancer+cytogenetics+and+molecular+cytogenetics.">Methodologies in cancer cytogenetics and molecular cytogenetics.</a> Am. J. Med. Genet. 115 (3), 118-124 (2002).</li><li>Miura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulated+Chromosomal+Instability+in+Murine+Bone+Marrow+Mesenchymal+Stem+Cells+Leads+to+Malignant+Transformation.">Accumulated Chromosomal Instability in Murine Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Leads to Malignant Transformation.</a> Stem Cells. 24 (4), 1095-1103 (2006).</li><li>Izadpanah, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+In+vitro+Expansion+Alters+the+Biology+of+Adult+Mesenchymal+Stem+Cells.">Long-term In vitro Expansion Alters the Biology of Adult Mesenchymal Stem Cells.</a> Cancer Res. 68 (11), 4229-4238 (2008).</li><li>Dekel-Naftali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+human+pluripotent+stem+cells+using+CGH+and+FISH+reveals+low-grade+mosaic+aneuploidy+and+a+recurrent+amplification+of+chromosome+1q.">Screening of human pluripotent stem cells using CGH and FISH reveals low-grade mosaic aneuploidy and a recurrent amplification of chromosome 1q.</a> Eur. J. Hum. Genet. 20 (12), 1248-1255 (2012).</li><li>Moralli, D., Yusuf, M., Mandegar, M., Khoja, S., Monaco, Z. L., Volpi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Improved+Technique+for+Chromosomal+Analysis+of+Human+ES+and+iPS+Cells.">An Improved Technique for Chromosomal Analysis of Human ES and iPS Cells.</a> Stem Cell Rev. Rep. 7 (2), 471-477 (2011).</li><li>Bayani, J., Squire, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traditional+banding+of+chromosomes+for+cytogenetic+analysis.">Traditional banding of chromosomes for cytogenetic analysis.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. 22, (2004).</li><li>Speicher, M. R., Carter, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+cytogenetics:+blurring+the+boundaries+with+molecular+biology.">The new cytogenetics: blurring the boundaries with molecular biology.</a> Nat. Rev. Genet. 6 (10), 782-792 (2005).</li><li>Benn, P., Delach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Lymphocyte+Culture+and+Chromosome+Analysis.">Human Lymphocyte Culture and Chromosome Analysis.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2010).</li><li>Muul, L. M., Heine, G., Silvin, C., James, S. P., Candotti, F., Radbruch, A., Worm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Measurement of Proliferative Responses of Cultured Lymphocytes, Curr. Protoc. Immunol. , (2011).</li><li>Barch, M. J., Knutsen, T., Spurbeck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Association of Genetic Technologists Cytogenetics Laboratory Manual. San Francisco: 3rd edition. , (1997).</li><li>Dewald, G. W., Ketterling, R. P., Wyatt, W. A., Stupca, P. J., McClatchey, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytogenetic+studies+in+neoplastic+hematologic+disorders.">Cytogenetic studies in neoplastic hematologic disorders.</a> In Clinical Laboratory Medicine, 2nd edition. , 658-685 (2002).</li><li>Kibe, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-7R&#945;+deficiency+in+p53(null)+mice+exacerbates+thymocyte+telomere+erosion+and+lymphomagenesis.">IL-7R&#945; deficiency in p53(null) mice exacerbates thymocyte telomere erosion and lymphomagenesis.</a> Cell Death Different. 19 (7), 1139-1151 (2012).</li><li>Tsien, F., Morava, E., Talarski, A., Marble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+features+of+a+boy+with+trisomy+of+16q22--&gt;qter+due+to+paternal+Y;+16+translocation.">Phenotypic features of a boy with trisomy of 16q22--&gt;qter due to paternal Y; 16 translocation.</a> Clin. Dysmorphol. 4 (4), 177-181 (2005).</li><li>Tsien, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+culture+of+normal+chorionic+villus+cells+yields+ICF+syndrome-like+chromatin+decondensation+and+rearrangements.">Prolonged culture of normal chorionic villus cells yields ICF syndrome-like chromatin decondensation and rearrangements.</a> Cytogenet. Genome Res. 8 (1), 13-21 (2002).</li><li>McGrattan, P., Campbell, S., Cuthbert, R., Jones, F., McMullin, M., Humphreys, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+conventional+cytogenetics+(G-banding),+comparative+genomic+hybridization+(CGH)+and+interphase+fluorescence+in+situ+hybridization+(i-FISH)+for+the+detection+of+genomic+rearrangements+in+acute+leukemia.">Integration of conventional cytogenetics (G-banding), comparative genomic hybridization (CGH) and interphase fluorescence in situ hybridization (i-FISH) for the detection of genomic rearrangements in acute leukemia.</a> J. Clin. Pathol. 61 (8), 903-908 (2008).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

لقد استخدمت الإجراء الحالي لكروموسوم بمعزل عن خلايا الكائنات الحية المختلفة، بما في ذلك أنواع مختلفة خلية تم الحصول عليها من الإنسان، المكاك وهو قرد اسيوي والجرذان، والفئران 11،20-22. يتم توفير بروتوكول قياسي، ولكن قد يحتاج بعض الخطوات الرئيسية والمتغيرات التي ?...

تحليل الكروموسومات هي تقنية تستخدم في جميع أنحاء العالم التقليدية لتشخيص عدم الاستقرار وإعادة ترتيب الكروموسومات مما يؤدي إلى الاضطرابات الوراثية والأورام الخبيثة 1،2،8،9. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تحقيق دقة أعلى لتشخيص والبحوث من خلل وراثي دستوري والمكتسبة السرطان مع مجموعة من الإجراءات والمنهجيات الكلاسيكية خلوي خلوي الجزيئية مثل مضان التهجين في الموضع (FISH)، التهجين الجينومي المقارن ([ك]) ، وتنميط نووي الطيفية (SKY) 14،15. في الآونة الأخيرة، وقد تم استخدام هذه التقنيات لتقييم عدم الاستقرار الصبغي المرتبطة أبحاث الخلايا الجذعية. وقد تم الإبلاغ عن تشوهات مثل عدم توازن الصبغيات النمط النووي للخلايا طويلة الأجل مثقف الجنينية (ES) والخلايا الجذعية البالغة من الكائنات الحية المختلفة من قبل مختبرات متعددة. يدعم الأدلة الحديثة أن بعض خطوط الخلايا هي بطبيعتها أكثر ميلا للكروموسوم instability بغض النظر عن الظروف الثقافة. لهذا السبب، عند إنشاء و / أو الحفاظ على خطوط الخلايا الجذعية القرد الإنسان، والماوس، أو، فمن المستحسن تحليل كروموسوم كجزء من عملية مراقبة الجودة. وصف العديد من التقارير على الاهتمام المتزايد في استخدام علم الوراثة الخلوية والجزيئية روتينية لمراقبة الاستقرار الكروموسومات من الخلايا الجذعية والخلايا الخبيثة أو الكائنات المختلفة في الثقافة 10-13. ويتزايد استخدام هذه البروتوكولات من قبل مختبرات غير الوراثية لتقييم الكروموسومات السريع لزنازينهم مثقف 13. نقدم الإجراءات الأساسية لدينا لإعداد كروموسوم من أنواع الخلايا المختلفة، والتي يمكن تطبيقها لكلا الغرضين والخلايا السريرية والبحوث المستمدة من الكائنات الحية المختلفة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="662">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:155px;">KaryoMAX Colcemid</td>
			<td style="width:213px;">Gibco</td>
			<td style="width:145px;">15212-012</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HBSS Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>24020-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.5% Trypsin EDTA 10x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Permount</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SP15-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Buffer Tablets &#34;GURR&#34;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10580-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Geimsa Stain</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>3250-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge 5810</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methanol</td>
			<td>Caledon Laboratory Chemicals</td>
			<td>6700130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Krackeler Scientific Inc.&#160;</td>
			<td>11-9508-05</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chromosome preparation from cultured cells

ويستخدم على نطاق واسع الصبغي (خلوي) تحليل للكشف عن عدم الاستقرار كروموسوم. عندما تليها G-النطاقات والتقنيات الجزيئية مثل مضان التهجين في الموقع (FISH) في، هذا الاختبار لديه القدرة قوية لتحليل الخلايا الفردية للالانحرافات التي تنطوي على مكاسب أو خسائر من أجزاء من الجينوم والتي تنطوي على إعادة ترتيب الكروموسومات واحد أو أكثر. في البشر، وتحدث تشوهات صبغية في حوالي 1 في 160 ولادة حية 1،2، 60-80٪ من جميع حالات الإجهاض 3،4، 10٪ من حالات الإملاص 2،5، 13٪ من الأفراد الذين يعانون من أمراض القلب الخلقية 6، 3-6٪ من حالات العقم 2، وفي كثير من المرضى الذين يعانون من تأخر في النمو والعيوب الخلقية 7. ويستخدم التحليل الوراثي الخلوي الخباثة بشكل روتيني من قبل الباحثين والأطباء، كما تبين من الملاحظات شذوذ الكروموسومات نسيلي أن يكون أهمية التشخيص والنذير كلا 8،9.60؛ كروموسوم العزلة لا تقدر بثمن للعلاج بالجينات وأبحاث الخلايا الجذعية من الرئيسيات غير البشرية بما في ذلك الكائنات الحية والقوارض 10-13. الكروموسومات يمكن أن تكون معزولة من خلايا الأنسجة الحية، بما في ذلك الخلايا الليمفاوية في الدم، والخلايا الليفية الجلدية، amniocytes، والمشيمة، ونخاع العظام، وعينات الورم. ويتم تحليل الكروموسومات في المرحلة الطورية من الانقسام، وعندما تشتد مكثف، وبالتالي فإنها مرئية أكثر وضوحا. الخطوة الأولى للتقنية الكروموسوم العزلة ينطوي على اضطراب في ألياف المغزل قبل الحضانة مع Colcemid، لمنع الخلايا من الانتقال إلى مرحلة لاحقة طور الصعود. ثم يتم التعامل مع الخلايا مع حل ناقص التوتر والحفاظ عليها في حالة تورم مع تثبيتي في كاروني. ثم يتم إسقاط الخلايا إلى الشرائح ويمكن بعد ذلك أن تستخدم لمجموعة متنوعة من الإجراءات. G-النطاقات ينطوي العلاج التربسين تليها تلطيخ مع بالغيمزا لخلق ضوء مميزة وعصابات الظلام. نفس العلاقات العامةocedure لعزل الكروموسومات يمكن استخدامها لإعداد الخلايا لإجراءات مثل مضان التهجين في الموقع (FISH) في والتهجين الجينومي المقارن ([ك])، وتنميط نووي الطيفية (SKY) 14،15.

ينتشر الطورية جودة عالية ضرورية لتحليل كروموسوم. وفحص الكروموسومات ينتج الناجحة التي تنتشر بشكل جيد ومورفولوجيا كروموسوم مناسبة. الكروموسومات بشكل صحيح G النطاقات تحتوي على ضوء سمات وأنماط النطاقات الظلام. <...

Watch this Scientific Journal Video about Chromosome Preparation From Cultured Cells at JoVE.com

Chromosome Preparation From Cultured Cells

الكروموسومات يمكن عزلها عن الخلايا الحية مثل الخلايا اللمفية أو الخلايا الليفية الجلد، ومن الكائنات الحية بما فيها البشر أو الفئران. هذه الاستعدادات كروموسوم يمكن استخدامها لمزيد من الروتين G-النطاقات والإجراءات الوراثية الخلوية الجزيئية مثل مضان التهجين في الموقع (FISH) في والتهجين الجينومي المقارن ([ك])، وتنميط نووي الطيفية (SKY).

إعداد كروموسوم من الخلايا المستزرعة

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

chromosome-preparation-from-cultured-cells

Research

JoVE Journal

Biology

80.3K Views.  Louisiana State University Health Science Center.  الكروموسومات يمكن عزلها عن الخلايا الحية مثل الخلايا اللمفية أو الخلايا الليفية الجلد، ومن الكائنات الحية بما فيها البشر أو الفئران. هذه الاستعدادات كروموسوم يمكن استخدامها لمزيد من الروتين G-النطاقات والإجراءات الوراثية الخلوية الجزيئ?...

Video: Chromosome Preparation From Cultured Cells

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A hemacytometer is a thick glass slide with a central area designed as a counting chamber. Cell suspension is applied to a defined area and counted so cell density can be calculated. 

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. In this video, we demonstrate how cells are counted using a hemacytometer.

العد وتحديد صلاحية خلايا مثقف

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological advantages provided by the giant salivary gland polytene chromosomes of third instar larvae.  In this tissue the chromosomes undergo many rounds of replication in the absence of cell division giving rise to approximately 1000 copies.  The DNA remains aligned after each replicative cycle resulting in greatly enlarged chromosomes that provide a unique opportunity to correlate chromatin morphology with the localization of specific proteins.  Consequently, there has been a high level of interest in defining the epigenetic modifications present at different genes and at different stages of the transcription process. An important tool for such studies is the labeling of polytene chromosomes with antibodies to the enzyme, transcription factor, or histone modification of interest. This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

إعداد يسحق ذبابة الفاكهة كروموسوم كثور الخيوط الصبغية للجسم وصفها

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

تصور هيولي باطني شبكية النطاقات الفرعية في الخلايا المستزرعة

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.

فحوصات مراسل المتوازية نطاق واسع في خلايا الثدييات مثقف

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

العزلة والتحليل الوظيفي من الميتوكوندريا من الخلايا المستزرعة وماوس الأنسجة

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

التصوير المحلية الكالسيوم<sup&gt; 2+</sup&gt; الإشارات في خلايا الثدييات مثقف

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

A Fast Air-dry Dropping Chromosome Preparation Method Suitable for FISH in Plants

Preparation of chromosome spreads is a prerequisite for the successful performance of fluorescence in situ hybridization (FISH). Preparation of high quality plant chromosome spreads is challenging due to the rigid cell wall. One of the approved methods for the preparation of plant chromosomes is a so-called drop preparation, also known as drop-spreading or air-drying technique. Here, we present a protocol for the fast preparation of mitotic chromosome spreads suitable for the FISH detection of single and high copy DNA probes. This method is an improved variant of the air-dry drop method performed under a relative humidity of 50%-55%. This protocol comprises a reduced number of washing steps making its application easy, efficient and reproducible. Obvious benefits of this approach are well-spread, undamaged and numerous metaphase chromosomes serving as a perfect prerequisite for successful FISH analysis. Using this protocol we obtained high-quality chromosome spreads and reproducible FISH results for Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum and Secale cereale.

A protocol is described for the preparation of high-quality mitotic plant chromosome spreads by a fast air-dry dropping method suitable for the FISH detection of single and high copy DNA probes.

سريع الهواء الجاف اسقاط كروموسوم طريقة التحضير مناسبة لFISH في النباتات

Preparation of chromosome spreads is a prerequisite for the successful performance of fluorescence in situ hybridization (FISH). Preparation of high ...

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes

Mammalian meiosis is a dynamic developmental process that occurs in germ cells and can be studied and characterized. Using a method to spread nuclei on the surface of slides (rather than dropping them from a height), we demonstrate an optimized technique on mouse spermatocytes that was first described in 1997. This method is widely used in laboratories to study mammalian meiosis because it yields a plethora of high quality nuclei undergoing substages of prophase I. Seminiferous tubules are first placed in a hypotonic solution to swell spermatocytes. Then spermatocytes are released into a sucrose solution to create a cell suspension, and nuclei are spread onto fixative-soaked glass slides. Following immunostaining, a diversity of proteins germane to meiotic processes can be examined. For example, proteins of the synaptonemal complex, a tripartite structure that connects the chromosome axes/cores of homologs together can be easily visualized. Meiotic recombination proteins, which are involved in repair of DNA double-strand breaks by homologous recombination, can also be immunostained to evaluate progression of prophase I. Here we describe and demonstrate in detail a technique widely used to study mammalian meiosis in spermatocytes from juvenile or adult male mice.

Meiosis is the developmental process by which gametes are formed through a single round of DNA replication and two successive rounds of chromosome segregation. Mammalian meiosis can be examined by utilizing a technique to prepare meiotic chromosome spreads. Here, we demonstrate a method of preparing surface-spread nuclei from mouse spermatocytes.

إعداد كروموسوم هو ينتشر من الماوس سبيرماتوسيتيس

Mammalian meiosis is a dynamic developmental process that occurs in germ cells and can be studied and characterized. Using a method to spread nuclei on ...

Co-immunoprecipitation Assay Using Endogenous Nuclear Proteins from Cells Cultured Under Hypoxic Conditions

Low oxygen levels (hypoxia) trigger a variety of adaptive responses with the Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) complex acting as a master regulator. HIF-1 consists of a heterodimeric oxygen-regulated &#945; subunit (HIF-1&#945;) and constitutively expressed &#946; subunit (HIF-1&#946;) also known as aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator (ARNT), regulating genes involved in diverse processes including angiogenesis, erythropoiesis and glycolysis. The identification of HIF-1 interacting proteins is key to the understanding of the hypoxia signaling pathway. Besides the regulation of HIF-1&#945; stability, hypoxia also triggers the nuclear translocation of many transcription factors including HIF-1&#945; and ARNT. Notably, most of the current methods used to study such protein-protein interactions (PPIs) are based on systems where protein levels are artificially increased through protein overexpression. Protein overexpression often leads to non-physiological results arising from temporal and spatial artifacts. Here we describe a modified co-immunoprecipitation protocol following hypoxia treatment using endogenous nuclear proteins, and as a proof of concept, to show the interaction between HIF-1&#945; and ARNT. In this protocol, the hypoxic cells were harvested under hypoxic conditions and the Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) wash buffer was also pre-equilibrated to hypoxic conditions before usage to mitigate protein degradation or protein complex dissociation during reoxygenation. In addition, the nuclear fractions were subsequently extracted to concentrate and stabilize endogenous nuclear proteins and avoid possible spurious results often seen during protein overexpression. This protocol can be used to demonstrate endogenous and native interactions between transcription factors and transcriptional co-regulators under hypoxic conditions.

Here we describe a co-immunoprecipitation protocol to study protein-protein interactions between endogenous nuclear proteins under hypoxic conditions. This method is suitable for demonstration of the interactions between transcription factors and transcriptional co-regulators at hypoxia.

استخدام البروتينات النووية الذاتية من الخلايا المزروعة تحت ظروف التاكسج بالانزيم Co-إيمونوبريسيبيتيشن

Low oxygen levels (hypoxia) trigger a variety of adaptive responses with the Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) complex acting as a master regulator. ...

Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident adipose progenitor cells (APCs) play a key role in adipose tissue homeostasis and can contribute to the tissue pathology. The growing use of single cell analysis technologies &#8211; including single-cell RNA-sequencing and single-cell proteomics &#8211; is transforming the stem/progenitor cell field by permitting unprecedented resolution of individual cell expression changes within the context of population- or tissue-wide changes. In this article, we provide detailed protocols to dissect mouse epididymal adipose tissue, isolate single adipose tissue-derived cells, and perform fluorescence activated cell sorting (FACS) to enrich for viable Sca1+/CD31-/CD45-/Ter119- APCs. These protocols will allow investigators to prepare high quality APCs suitable for downstream analyses such as single cell RNA sequencing.

We present a simple method to isolate highly viable adipose progenitor cells from mouse epididymal fat pads using fluorescence activated cell sorting.

إعداد الخلايا الدهنية بروجينيتور من ماوس Epididymal الأنسجة الدهنية

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident ...