المؤلفان بالشكر كاتارينا Schallmoser لتوفير pHPL ، إيفا ورود هوفمان نيكول للتعليقات مفيدة للمخطوطة ، ومارغريتا دانييلا ثالر hwirth الأب للحصول على المساعدة التقنية ، ومونيكا لتحرير فاريل لغوية ، لانج أوفه ، Holzapfel مارجيت وساندرا Eppich في قسم التوليد لتوفير الحبال. وقد تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة الأبحاث النمساوية (FWF ، منح N211 - NAN إلى DS) ، لتعزيز البحوث النمساوية وكالة (FFG ، ومنحة لN200 DS) والخلايا الجذعية للبالغين ومؤسسة أبحاث (ع). AR وزميل في الطب الجزيئي برنامج الدكتوراه من كلية الطب بجامعة غراتس.

الجزء 1 : إعداد 1. إعداد مستنبت الخلية قبل البدء في إعداد المتوسطة جمع كل المواد والأدوات التي سوف تحتاج إليها. ذوبان الجليد 2 × 56 مل من aliquots lysate تجميع الصفائح الدموية البشرية (pHPL ، عصامي : مرجع 1 &amp; # إن الرب 1523) ، و 10 مل من البنسلين 100X / حل الستربتوميسين ، 2 × 5 مل من L - الجلوتامين (سواء سيغما). ذوبان الجليد في خلوى وaliquots عامل النمو (VEGF ، bFGF ، EGF ، IGF ، هيدروكورتيزون ، حمض الأسكوربيك ، الهيبارين ، على النحو المنصوص عليه الامفوتريسين &#39;quots واحدة&#39;) لاستكمال تعديل 1 زجاجة (500 مليلتر) من EGM - 2 المتوسط ​​(Lonza). من الثلاجة تأخذ زجاجة واحدة من كل 500 مل (ط) ألفا معدلة والوسيلة الأساسية الدنيا (أ - MEM) و (ب) متوسطة القاعدية البطانية (EBM). يتم تنفيذ كافة الخطوات التالية في غطاء تدفق الصفحي زراعة الأنسجة تحت ظروف معقمة. إعداد الهيبارين حافظة خالية (على سبيل المثال ، Biochrom) عن طريق تذويب المسحوق إلى تركيز النهائي من 1000 وحدة دولية / مل مع الماء المعقم. MSC - المتوسطة : استخدام 500 مل من MEM ، إضافة 56 مل من pHPL إذابة (أنظر المرجع أيضا 1 لمزيد من التفاصيل) وحدة دولية / 2 مل (= 224 ميكرولتر من محلول المخزون) من الهيبارين ، الصائن الحرة (يجنب تجلط الدم من خلال تكتل المتوسطة والفيبرينوجين في البلازما) للوصول إلى التركيز النهائي للpHPL 10 ٪. بالإضافة إلى ذلك إضافة البنسلين (100U/mL) / الستبرتوميسين (100μg/mL) من الحل و2mm وL - Glutamin (سواء سيغما). تصفية المتوسطة من خلال 20 ميكرون ، حجم المسام تصفية فراغ (ميليبور). تسمية زجاجة مناسب (المحتوى والتاريخ). ECFC المتوسطة : استخدام زجاجة واحدة (500 مليلتر) من EBM ، إضافة aliquots خلوى ، 56 مل من pHPL ، 10 وحدة دولية / مل (= 1120μl من محلول المخزون) من الهيبارين ، الصائن الحرة ، البنسلين (100U/mL) / الستبرتوميسين (100 غرام / مل) من الحل و2mm وL - Glutamin إلى القاعدية والمتوسطة مع فلتر - 20 ميكرولتر حجم المسام تصفية فراغ (ميليبور). تسمية زجاجة مناسب (المحتوى والتاريخ). 2. تعقيم الأدوات الجراحية يجب ملقط ، زوج من مقص حاد حامل مشرط الجراحة وتكون الحرارة المستهلكات خام تعقيم عقيمة. 3. إعداد أنابيب لجمع الحبل إضافة 500 وحدة دولية من المواد الحافظة -- الهيبارين مجانا إلى 50 مل أنابيب البولي بروبلين (فالكون) ، والتكيف مع الحجم النهائي من 20 مل مع برنامج تلفزيوني. أنابيب نقل إلى غرفة الولادة. 4. الموافقة المستنيرة (أكد من قبل لجنة أخلاقية الخاص المحلي أو IRB). نطلب من الآباء والأمهات قبل الولادة إذا كانت ترغب في التبرع بقطعة من الحبل ، وإبلاغ كافية لهم لأغراض أنه سيخدم. 5. الحبل التبرع بعد خفض التسليم والتفتيش على المشيمة والحبل السري خارج قطعة 10 سم ونقل على الفور إلى أنبوب الخاص المعبأة مسبقا مع الهيبارين لتجنب تجلط الدم داخل الأوعية المتبقية الحبل. على تواصل مع عزل الخلايا في أقرب وقت ممكن. الجزء 2 : عزل الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الصفحي زراعة الأنسجة هود التدفق عن طريق تنظيف الأسطح مع Incidin أو 70 ٪ EtOH. مكان معقم 150 سم ثقافة الخلية 2 لوحات ، و 75 قارورة سم ثقافة خلية (سواء كورننغ) ، برنامج تلفزيوني ، تعقيم الأدوات الجراحية ومكاشط الخلية ، حامل أنبوب ، 25 stripettes مل و 5 مل حقن الإبر مجهزة بشكل مناسب في نهاية حادة الغطاء الخاص تنظيفها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل الدافئة الخاص أعدت α - MEM - 2 وغير العادية مستنبت الخلية الى 37 درجة. مئوية في حمام مائي </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جلب سلك من غرفة الولادة إلى مختبر مجهز الخاص الخلية هود الثقافة. بعد تحويل الحبل الى تدفق الصفحي غسله مرتين في برنامج تلفزيوني (عن طريق نقل لوحة جديدة) للتخلص من خلايا الدم الملوثة. شطف الوريد السري بعد canulating على جانب واحد مع حقنة معقمة 5mL مجهزة إبرة حادة مع نهاية PBS حتى السوائل التي تخرج في الطرف الآخر من الحبل يصبح شفافا تماما (المحمر يشير إلى تلوث الدم). </li></ol> ECFCs : <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 75 سم 2 قارورة (كورنينج) ، وتسميته في ملء 15-20 مل من المتوسط ​​EGM - 2 قبل تحسنت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الحبل في لوحة جديدة مليئة برنامج تلفزيوني العقيمة. تأخذ المقص الجراحي وقطع الحبل السري في قطعتين من حوالي 5 سم في الطول (قطعة قصيرة يسهل عملية ، لأن السفن السري الملتوية على طول محور الخاصة بهم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في محاولة للعثور على الوريد السري (سفينة كبيرة) ، تضاف شفرة واحدة من مقص الخاص الجراحية وخفض الوريد طوليا. عند هذه النقطة يمكن أن تكون مفيدة إذا كان يمكن أن تعقد مساعد السياق قطعت بالفعل مع اثنين بينما كنت ملقط قطع أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الحبل الدائريم مع قطع الوريد في لوحة جديدة من دون برنامج تلفزيوني ، واتخاذ مكشطة الخلية وكشط السطح (البطانية) الداخلية للالوريد السري من قبل rubbings واحدة من نهاية إلى أخرى. نقل الخلايا إلى قارورة الخاص الذي أعدته تنظيف غيض من مكشطة في المتوسط. كرر هذا الإجراء لا يقل عن 10 مرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إغلاق القارورة الخاص ووضعها في حاضنة (37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2 ، 95 ٪ من الرطوبة). </li></ol> اللجان الدائمة : <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعد لوحة 150 سم ثقافة 2 (كورنينج) وتسميته. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأخذ قطعة من الحبل (بعد تجريف قبالة الطبقة البطانية) ، وقطع الحبل كله الى قطع صغيرة جدا باستخدام مقص العقيمة ومشرط معقم. وينبغي أن الحد الأقصى لحجم قطع الحبل السري يمكن 1-2 ملم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل قطع الحبل السري الخاص بك مع ملقط معقم في صحنك ثقافة ما قبل المسمى. قبل مغادرته لوحة مفتوحة لمدة 5 دقائق قبل ملء مع المتوسط ​​، ويتعزز المرفق من القطع البلاستيكية على السطح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حالما يتم توصيل القطع بشكل مناسب لسلك من البلاستيك ، إضافة برفق في 30-35 مل من قبل تحسنت ألفا معدلة MEM. محاولة استخدام أدنى سرعة للتأكد من أن جميع القطع لا تزال تعلق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إغلاق لوحة ووضعها في حاضنة (37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2 ، 95 ٪ من الرطوبة). </li></ol> الجزء 3 : توسيع الخلايا وتأكيد النمط الظاهري المناعة بواسطة التدفق الخلوي توسيع الخلية EFCFs : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق من مرفق من الخلايا البطانية في اليوم التالي على مجهر مقلوب وتبادل كله EGM - 2 المتوسط ​​للتخلص من كافة الخلايا غير المرفقة والجسيمات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توسيع الخلايا حتى ثلث التقاء وتبادل المتوسط ​​مرتين في الأسبوع. عندما يتم التوصل إلى نقطة التقاء ، فصل الخلايا مع 0.05 ٪ Trypsin/0.7 ملي EDTA ونقلها إلى السفن ثقافة جديدة. اعتمادا على عدد من الخلايا داخل القارورة T75 الخاص بك ، يجب عليك اختيار حجم وعدد من القوارير الجديدة الخاصة بك لضمان انخفاض كثافة البذر لمزيد من التوسع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبادل ثلث المتوسط ​​مرتين في الأسبوع خلال التوسع في الخلايا. </li></ol> اللجان الدائمة : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وثمرة من اللجان الدائمة من الحبل يستغرق مزيدا من الوقت ، حتى تتمكن من الانتظار على الأقل 3-4 أيام حتى تقوم بالتدقيق على مجهر مقلوب لظهور خلايا مغزلية الشكل في محيط القطع الأنسجة المرفقة. عندما يكون هناك ما يكفي من الخلايا من النمو ، ويميلون إلى فصل القطع لأنها تفقد الاتصال مع البلاستيك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 10-12 يوما إزالة قطع الأنسجة ، وفصل اللجان الدائمة من البلاستيك مع 0.05 ٪ Trypsin/0.7 ملي EDTA ونقلها إلى السفن ثقافة جديدة. اعتمادا على كمية من الخلايا داخل صحنك يجب عليك أن تقرر حجم وعدد من القوارير الجديدة الخاصة بك لضمان انخفاض كثافة البذر لمزيد من التوسع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبادل ثلث المتوسط ​​مرتين في الأسبوع خلال التوسع في الخلايا. </li></ol> التدفق الخلوي المعدات اللازمة : تدفق عداد الكريات دينار بحريني (FACSCalibur) ، ميكرونية أنابيب (كورنينج) ، حامل الأنبوب والأغنام المصل (حظر كاشف) ، Eppifuge (إيبندورف) ، والأجسام المضادة وحيدة النسيلة اللجان الدائمة : CD45 ، CD14 ، CD19 ، HLA - DR ، CD31 ، CD73 ، CD90 ، CD105 ، والضوابط isotype ECFCs : CD45 ، CD14 ، CD19 ، HLA - DR ، CD31 ، CD34 ، CD90 ، CD105 ، CD144 ، CD146 ، والضوابط isotype <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التوصل إلى نقطة التقاء ، فصل الخلية مع 0.05 ٪ Trypsin/0.7 ملي EDTA والطرد المركزي في 300g لمدة 7 دقائق في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلايا إلى تركيز خلايا 1x10 6 / مل في برنامج تلفزيوني وتعديل كتلة ملزمة الأضداد غير محددة ب 10 ٪ V / V مصل الأغنام لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمية أنابيب ميكرونية وإضافة المناسب للتركيز الأجسام المضادة المسماة الفلورسنت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة تعليق ميكرولتر من 50 خلية (المحظورة) لكل أنبوب ، واحتضان لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل خلايا معدلة بإضافة برنامج تلفزيوني لإزالة الأجسام المضادة غير ملزم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تذهب مع الخلية المسمى الخاص إلى تدفق عداد الكريات وتنفيذ التحليل. </li></ol> الجزء 4 : مستعمرة ECFC النمو والتثبيت ، وتلطيخ وتحليل التسلسل الهرمي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور وحصاد ECFCs نقية تقريبا في كثافة منخفضة جدا من الطلاء 3 أو 10 خلايا لكل سنتيمتر مربع في لوحات ثقافة خلية للسماح للنمو مستعمرة واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبادل ثلث المتوسط ​​مرتين في الأسبوع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 14 يوما (نهاية الثقافة) إزالة المتوسطة ، ويغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني وإصلاح المستعمرات مع الحل التثبيت الجليد الباردة (الأسيتون : الميثانول = 3 : 2) لمدة 15 دقيقة في الثلاجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل الحل التثبيت وترك لوحات مفتوحة حتى يجف لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترطيب الخلايا مع الماء المقطر لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة هاريس الهيماتوكسيلين الحل وصمة عار للمستعمرات ثابتة لمدة 12 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة H matoxylin حل لوحات وشطف مع مياه الصنبور للتخلص من الحل تلطيخ المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط الصور من كل مستعمرة من قبلاستخدام واستيراد stereomicroscope *. jpg أو *. TIF شكل ملفات على جهاز الكمبيوتر الخاص بك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح الصور مع برنامج ImageJ وتحليل دقيق لعدد الخلايا في كل مستعمرة كما هو موضح في الرسوم المتحركة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> افتح البرنامج واستيراد ImageJ صورة مستعمرة باستخدام &quot;ملف \ فتح&#39; وظيفة في سحب أسفل القائمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المضي قدما باستخدام &quot;عملية \ طرح الخلفية&#39; الدالة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام وظيفة &quot;الاختيار * * بيضاوي الشكل أو فرشاة&#39; في القائمة ImageJ بمناسبة هامش مستعمرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صورة واضحة المحيطة به &quot;تعديل \ مسح خارج&#39; وظيفة واقتصاص الصورة عن طريق تحديد &quot;صورة \ المحاصيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط عتبة يدويا باستخدام &quot;صورة \ ضبط \ عتبة&#39; الدالة ، بحيث يتم تماما كافة الخلايا الملونة باللون الأحمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب عدد الخلايا من مستعمرة عن طريق تحديد &quot;تحليل \ تحليل الجزيئات. اختيار الإعدادات المناسبة (الأمثل لكل نوع من الخلايا) وحدد &quot;موافق&quot;. سوف مربع النتائج ، بما في ذلك عدد الخلايا وصورة جديدة تحتوي على الخطوط العريضة المماثلة من الخلايا تظهر عدها. <img src="/files/ftp_upload/1525/1525op2.jpg" alt="الشكل 1" /></li></ol>

<ol>
	<li>Schallmoser, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+lysate+can+replace+fetal+bovine+serum+for+clinical-scale+expansion+of+functional+mesenchymal+stromal+cells.">Human platelet lysate can replace fetal bovine serum for clinical-scale expansion of functional mesenchymal stromal cells.</a> Transfusion. 47, 1436-1446 (2007).</li><li>Reinisch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+system+to+propagate+cord+blood-derived+multipotent+mesenchymal+stromal+cells+for+clinical+application.">Humanized system to propagate cord blood-derived multipotent mesenchymal stromal cells for clinical application.</a> Regen Med. 2, 371-382 (2007).</li><li>Reinisch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+large-scale+expanded+endothelial+colony-forming+cells+function+in+vitro+and+in+vivo.">Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo.</a> Blood. 113, 6716-6725 (2009).</li><li>Strunk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+characterization+and+preclinical+production+of+human+lineage-negative+cells+for+regenerative+stem+cell+therapy.">Phenotypic characterization and preclinical production of human lineage-negative cells for regenerative stem cell therapy.</a> Transfusion. 45, 315-326 (2005).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم أي تضارب في المصالح المالية أن تعلن.

هناك مجموعة متنوعة من المصادر التي تحصل على اللجان الدائمة أو ECFCs بما نخاع العظام ، والأنسجة الدهنية ، دم الحبل السري ، الخ. فمن الضروري الحصول على كلا النوعين من الأسلاف من المصدر نفسه للمقارنة مباشرة إشراك أنواع مختلفة من الخلا?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>alpha modified MEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-GLutamin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin/Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EBM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Single cytokine quots</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>75 cm2 flasks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>150 cm2 plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell scraper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin/EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Monoclonal antibodies</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickenson</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50 ml tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>500 mL filter 20 &mu;m pore size </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Preservative free heparin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biochrom</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation and animal serum free expansion of human umbilical cord derived mesenchymal stromal cells (mscs) and endothelial colony forming progenitor cells (ecfcs)

الحبل السري مصدرا غنيا للخلايا الاصلية مع إمكانات عالية التكاثري بما في ذلك الخلايا اللحمية الوسيطة (وتسمى أيضا الخلايا الجذعية الوسيطة ، MSCS) والخلايا البطانية التي تشكل مستعمرة السلف (ECFCs). كلا النوعين من الخلايا اللاعبين الرئيسيين في المحافظة على سلامة الأنسجة وربما تشارك أيضا في عمليات التجدد وتشكيل الأورام. لدراسة البيولوجيا وظيفة بطريقة نسبية من المهم أن يكون كل أنواع الخلايا المتاحة من الجهات المانحة نفسها. قد يكون من المفيد أيضا لأغراض التجدد واللجان الدائمة لاستخلاص ECFCs من النسيج نفسه. لأن العلاجات الخلوية وينبغي أن تجد طريقها من مقاعد البدلاء إلى جانب السرير أنشأنا طريقة جديدة لعزل وتوسيع الخلايا الاصلية من دون استخدام البروتين الحيواني. استبدال تجمع الصفيحات lysate الإنسان (pHPL) مصل بقري جنيني في جميع خطوات بروتوكول جهدنا لتجنب الاتصال تماما من الخلايا البروتينات لأعضاء غير بشرية. هذا الفيديو يوضح منهجية لعزل وتوسيع الخلايا الاصلية من الحبل السري واحد. وسيتم شرح جميع المواد والإجراءات.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

هذا البروتوكول وصف العزلة والتوسع اللاحق في خلايا انسجة وخلايا اللحمة المتوسطة مستعمرة البطانية التي تشكل من دون استخدام الحيوان مصل لتوليد أزواج ذاتي لأغراض زراعة تجريبية.

العزلة والحيوان التوسع الحرة المصل الحبل السري الإنسان المستمدة الخلايا اللحمية الوسيطة (MSCS) وغشائي خلايا مستعمرة السلف التشكيل (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

isolation-animal-serum-free-expansion-human-umbilical-cord-derived

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

15.3K Views.  Medical University of Graz, Austria. هذا البروتوكول وصف العزلة والتوسع اللاحق في خلايا انسجة وخلايا اللحمة المتوسطة مستعمرة البطانية التي تشكل من دون استخدام الحيوان مصل لتوليد أزواج ذاتي لأغراض زراعة تجريبية.

Video: Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane. Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels often do not resemble vessels in vivo. Here we demonstrate an optimized in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts. This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis, and importantly the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. Vessels can be easily observed by phase-contrast and time-lapse microscopy, and recovered in pure form for downstream applications.

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

This video protocol illustrates the isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) from human umbilical cord. Once isolated these cells can be used for in vitro angiogenesis assays like the Optimized Fibrin Gel Bead Assay also demonstrated by the Hughes lab.

عزل خلايا الإنسان الوريد السري غشائي (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

العزلة وتوقعات بنمو كبير من الكبار الإنسان خلايا غشائي السلف تشكيل مستعمرة

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Isolation and Enrichment of Rat Mesenchymal Stem Cells (MSCs) and Separation of Single-colony Derived MSCs

MSCs are a population of adult stem cells that is a promising source for therapeutic applications. These cells can be isolated from the bone marrow and can be easily separated from the hematopoietic stem cells (HSCs) due to their plastic adherence. This protocol describes how to isolate MSCs from rat femurs and tibias. The isolated cells were further enriched against two MSCs surface markers CD54 and CD90 by magnetic cell sorting. Expression of surface markers CD54 and CD90 were then confirmed by flow cytometry analysis. HSC marker CD45 was also included to check if the sorted MSCs were depleted of HSCs. MSCs are naturally quite heterogeneous. There are subpopulations of cells that have different shapes, proliferation and differentiation abilities. These subpopulations all express the known MSCs markers and no unique marker has yet been identified for the different subpopulations. Therefore, an alternative approach to separate out the different subpopulations is using cloning cylinders to separate out single-colony derived cells. The cells derived from the single-colonies can then be cultured and evaluated separately.

Isolation and Enrichment of Rat Mesenchymal Stem Cells MSCs and Separation of Single-colony Derived MSCs

Rat MSCs were isolated from femurs and tibias and then enriched by magnetic cell sorting. Sorted cells were confirmed for the expression of surface markers by flow cytometry. These cells were also cultured at clonal density to form single colonies and then these colonies were separated by cloning cylinders.

العزلة والإثراء من خلايا فأر الجذعية الوسيطة (MSCS) والفصل بين مستعمرة واحدة مشتقة اللجان الدائمة

MSCs are a population of adult stem cells that is a promising source for therapeutic applications. These cells can be isolated from the bone marrow and ...

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded and their collection does not imply any added risk to the newborn or mother s health. Moreover no ethical concerns are raised. The UC is composed by one vein and two arteries from which both endothelial cells (ECs) 1 and smooth muscle cells (SMCs) 2, two of the main cellular components of blood vessels, can be isolated. In this project the SMCs were obtained after enzymatic treatment of the UC arteries accordingly the experimental procedure previously described by Jaffe et al 3. After cell isolation they were kept in t-flash with DMEM-F12 supplemented with 5% of fetal bovine serum and were cultured for several passages. Cells maintained their morphological and other phenotypic characteristics in the different generations. The aim of this study was to isolate smooth muscle cells in order to use them as models for future assays with constrictor drugs, isolate and structurally characterize L-type calcium channels, to study cellular and molecular aspects of the vascular function 4 and to use them in tissue engineering.

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

The umbilical cords are used to isolate smooth muscle cells by different ways. In this work we used the enzymatic treatment to isolated smooth muscle cells.

عزل الشريان السري الإنسان خلايا العضلات الملساء (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Phenotypic and Functional Characterization of Endothelial Colony Forming Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood

Longstanding views of new blood vessel formation via angiogenesis, vasculogenesis, and arteriogenesis have been recently reviewed1. The presence of circulating endothelial progenitor cells (EPCs) were first identified in adult human peripheral blood by Asahara et al. in 1997 2 bringing an infusion of new hypotheses and strategies for vascular regeneration and repair. EPCs are rare but normal components of circulating blood that home to sites of blood vessel formation or vascular remodeling, and facilitate either postnatal vasculogenesis, angiogenesis, or arteriogenesis largely via paracrine stimulation of existing vessel wall derived cells3. No specific marker to identify an EPC has been identified, and at present the state of the field is to understand that numerous cell types including proangiogenic hematopoietic stem and progenitor cells, circulating angiogenic cells, Tie2+ monocytes, myeloid progenitor cells, tumor associated macrophages, and M2 activated macrophages participate in stimulating the angiogenic process in a variety of preclinical animal model systems and in human subjects in numerous disease states4, 5. Endothelial colony forming cells (ECFCs) are rare circulating viable endothelial cells characterized by robust clonal proliferative potential, secondary and tertiary colony forming ability upon replating, and ability to form intrinsic in vivo vessels upon transplantation into immunodeficient mice6-8. While ECFCs have been successfully isolated from the peripheral blood of healthy adult subjects, umbilical cord blood (CB) of healthy newborn infants, and vessel wall of numerous human arterial and venous vessels 6-9, CB possesses the highest frequency of ECFCs7 that display the most robust clonal proliferative potential and form durable and functional blood vessels in vivo8, 10-13. While the derivation of ECFC from adult peripheral blood has been presented14, 15, here we describe the methodologies for the derivation, cloning, expansion, and in vitro as well as in vivo characterization of ECFCs from the human umbilical CB.

Endothelial colony forming cells (ECFCs) are circulating endothelial cells with robust clonal proliferative potential that display intrinsic in vivo vessel forming ability. Phenotypic and functional characterization of outgrowth endothelial cells derived from CB are important to identify and isolate bona fide ECFCs for potential clinical application in repairing damaged tissues.

توصيف المظهري والوظيفي للخلايا غشائي مستعمرة تشكيل المستمدة من الإنسان دم الحبل السري

Longstanding views of new blood vessel formation via angiogenesis, vasculogenesis, and arteriogenesis have been recently reviewed1. The presence of ...

Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells

Brown adipocytes have the ability to uncouple the respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat. Development of UCP1-positive brown adipocytes in white adipose tissues (so called beige or brite cells) is highly induced by a variety of environmental cues such as chronic cold exposure or by PPAR&gamma; agonists, therefore, this cell type has potential as a therapeutic target for obesity treatment. Although most immortalized adipocyte lines cannot recapitulate the process of "browning" of white fat in culture, primary adipocytes isolated from stromal vascular fraction in subcutaneous white adipose tissue (WAT) provide a reliable cellular system to study the molecular control of beige/brite cell development. Here we describe a protocol for effective isolation of primary preadipocytes and for inducing differentiation to beige/brite cells in culture. The browning effect can be assessed by the expression of brown fat-selective markers such as UCP1.

Primary white preadipocytes isolated from white adipose tissues in mice can be differentiated into beige/brite cells. Presented here is a reliable cellular model system to study the molecular regulation of "browning" of white fat.

العزلة وتمايز الخلايا إلى خلايا الأوعية الدموية اللحمية بيج / برايت

Brown adipocytes have the ability to uncouple the  respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat.  Development of UCP1-positive ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

الاستقراء وتحليل الظهارية الوسيطة الانتقالية ل

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

عزل خلايا الفئران صمام غشائي

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides the use of bone marrow and umbilical cord MSCs for exogenous cell therapy, there is also increasing interest in the repair and regenerative potential of resident tissue MSCs. Moreover, they likely have a role in normal organ development, and have been attributed roles in disease, particularly those with a fibrotic nature. The main hurdle for the study of these resident tissue MSCs is the lack of a clear marker for the isolation and identification of these cells. The isolation technique described here applies multiple characteristics of lung resident MSCs (L-MSCs). Upon sacrifice of the rats, lungs are removed and rinsed multiple times to remove blood. Following mechanical dissociation by scalpel, the lungs are digested for 2-3 hr using a mix of collagenase type I, neutral protease and DNase type I. The obtained single cell suspension is subsequently washed and layered over density gradient medium (density 1.073 g/ml). After centrifugation, cells from the interphase are washed and plated in culture-treated flasks. Cells are cultured for 4-7 days in physiological 5% O2, 5% CO2 conditions. To deplete fibroblasts (CD146-) and to ensure a population of only L-MSCs (CD146+), positive selection for CD146+ cells is performed through magnetic bead selection. In summary, this procedure reliably produces a population of primary L-MSCs for further in vitro study and manipulation. Because of the nature of the protocol, it can easily be translated to other experimental animal models.

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

This protocol describes an isolation technique for obtaining primary lung resident mesenchymal stromal cells from rats, through the use of enzymatic digestion, density gradient separation, plastic adherence and CD146+ magnetic bead selection.

عزل CD146<sup&gt; +</sup&gt; خلايا المقيم الرئة الجذعية الوسيطة اللحمية من الجرذ الرئتين

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, epithelial progenitor cells can self-renew and generate differentiating progeny that exhibit cellular functions similar to those of their in vivo counterparts. Herein we describe a step-by-step protocol to isolate region-specific progenitors from human lung and generate 3D organoid cultures as an experimental and validation tool. We define proximal and distal regions of the lung with the goal of isolating region-specific progenitor cells. We utilized a combination of enzymatic and mechanical dissociation to isolate total cells from the lung and trachea. Specific progenitor cells were then fractionated from the proximal or distal origin cells using fluorescence associated cell sorting (FACS) based on cell type-specific surface markers, such as NGFR&#160;for sorting basal cells and HTII-280 for sorting alveolar type II cells. Isolated basal or alveolar type II progenitors were used to generate 3D organoid cultures. Both distal and proximal progenitors formed organoids with a colony forming efficiency of 9-13% in distal region and 7-10% in proximal region when plated 5000 cell/well on day 30. Distal organoids maintained HTII-280+ alveolar type II cells in culture whereas proximal organoids differentiated into ciliated and secretory cells by day 30. These 3D organoid cultures can be used as an experimental tool for studying the cell biology of lung epithelium and epithelial mesenchymal interactions, as well as for the development and validation of therapeutic strategies targeting epithelial dysfunction in a disease.

This article provides a detailed methodology for tissue dissociation and cellular fractionation approaches allowing enrichment of viable epithelial cells from proximal and distal regions of the human lung. Herein these approaches are applied for the functional analysis of lung epithelial progenitor cells through the use of 3D organoids culture models.

عزل وإثراء الخلايا السلفية الظهارية للرئة البشرية للزراعة العضوية

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...