המחברים מודים קתרינה Schallmoser למתן pHPL, אווה רודה וניקול הופמן להערות שימושי היד, דניאלה טלר לבין מרגרטה Fr hwirth לקבלת סיוע טכני, מוניקה פארל לעריכה לשונית, אווה לנג, מרגיט הולצפפל וסנדרה Eppich על החוג למיילדות למתן את מיתרי. עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר האוסטרי (FWF, מענק N211-NAN ל DS), המחקר האוסטרי קידום הסוכנות (FFG, מענק N200 ל DS) ועל ידי תא גזע בוגרים Research Foundation (ע&quot;ר). AR הוא עמית לרפואה של התוכנית PhD מולקולרית של האוניברסיטה לרפואה של גראץ.

חלק 1: הגדרת 1. הכנת תרבית תאים בינוני לפני תחילת הכנת בינוני לאסוף את כל החומרים והכלים תצטרך. הפשירי 2 x 56 aliquots מ&quot;ל של lysate ונקווה טסיות האנושי (pHPL, מתוצרת עצמית: התייחסות 1 &amp; יופיטר # 1523), 10 מ&quot;ל של פניצילין 100x / פתרון סטרפטומיצין, 2 x 5 מ&quot;ל של L-גלוטמין (הן סיגמא). ההפשרה ציטוקינים ו - גורם גדילה aliquots (VEGF, bFGF, EGF, IGF, הידרוקורטיזון, חומצה אסקורבית, הפרין, amphotericin כאמור &quot;quots יחיד &#39;) מותאם משלים 1 בקבוק (500 מ&quot;ל) של המדיום EGM-2 (Lonza). מהמקרר לקחת אחד בקבוק 500 מ&quot;ל כל אחד (i) אלפא שונה מדיום חיוני מינימלי (A-ממ) ו (ב) בינוני הבסיס האנדותל (EBM). כל השלבים הבאים מתבצעים ברדס זרימה למינרית רקמה תרבות בתנאים סטריליים. הכן הפרין ללא חומר משמר (למשל, Biochrom) על ידי המסת אבקת לריכוז סופי של 1000 IU / mL עם מים סטריליים. MSC-בינונית: השתמש ב 500 מ&quot;ל של-ממ, להוסיף 56 מ&quot;ל של pHPL מופשר (ראה גם התייחסות 1 לפרטים נוספים) ו 2 IU / mL (= 224 μl של פתרון המניות) של הפארין, חומר משמר בחינם (מונע קרישה של המדיום דרך ובהצטברויות פיברינוגן של פלזמה) להגיע הריכוז הסופי של pHPL 10%. בנוסף להוסיף פניצילין (100U/mL) / סטרפטומיצין (100μg/mL) פתרון של 2 מ&quot;מ L-Glutamin (הן סיגמא). סינון בינוני באמצעות מסנן 20 מיקרומטר, גודל הנקבוביות ואקום (Millipore). תווית הבקבוק כיאות (תאריך, תוכן). ECFC-בינונית: השתמש בקבוק אחד (500 מ&quot;ל) של EBM, מוסיפים את ציטוקינים-aliquots, 56 מ&quot;ל של pHPL, 10 IU / מ&quot;ל ​​(= 1120μl של פתרון המניות) של הפארין, חומר משמר בחינם, פניצילין (100U/mL) / סטרפטומיצין (100 גר &#39;/ מ&quot;ל) פתרון של 2 מ&quot;מ L-Glutamin עד בינוני המסנן הבסיס, עם 20 μl-נקבוביות ואקום גודל המסנן (Millipore). תווית הבקבוק כיאות (תאריך, תוכן). 2. עיקור של מכשירי ניתוח מלקחיים, זוג מספריים חדות כירורגית מחזיק אזמל חייב להיות חום disposables עפרות מעוקר סטרילי. 3. הכנת צינורות לאיסוף חוט הוספת 500 IU של משמר - הפרין חופשי 50 מ&quot;ל צינורות פוליפרופילן (Falcon) ולהתאים את נפח סופי של 20 מ&quot;ל עם PBS. העברת צינורות לחדר הלידה. 4. הסכמה מדעת (אושר על ידי הוועדה המקומית שלך IRB אתית או). שאל את ההורים לפני הלידה אם הם רוצים לתרום חתיכת חוט והולם ליידע אותם על מטרות זה ישמש. 5. כבל תרומה לאחר הלידה ובדיקה של השליה חוט לחתוך חתיכה 10 ס&quot;מ ומיד להעביר אותו צינור שלך prefilled עם הפרין כדי למנוע קרישת הדם הנותר בתוך כלי חוט. ממשיכים עם בידוד תא בהקדם האפשרי. חלק 2: בידוד נייד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תזרים למינרית רקמות ברדס התרבות על ידי ניקוי משטחים עם Incidin EtOH או 70%. מקום סטרילי 150 ס&quot;מ 2 תאים תרבות צלחות, 75 צלוחיות תא ס&quot;מ התרבות (הן קורנינג), PBS, מכשירי ניתוח עיקור, מגרדים תאים, בעל צינור, stripettes 25 מ&quot;ל ו 5 מ&quot;ל מצויד מזרקים ומחטים סוף בוטה כראוי ברדס ניקה שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום חם שהוכן שלך α-EGM ממ ו-2 תרבית תאים בינוניים עד 37 מעלות צלזיוס באמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביאו את כבל מחדר הלידה למעבדה שלך מצויד למכסה המנוע תרבית תאים. לאחר העברת כבל לתוך הזרימה למינרית לשטוף אותו פעמיים PBS (על ידי העברת לצלחת חדש) להיפטר לזהם כדוריות הדם. שוטפים את וריד הטבור לאחר canulating אותו בצד אחד עם מזרק 5 מ&quot;ל סטרילי מצויד במחט עם קצה קהה PBS עד הנוזל שיוצא את הקצה השני של החבל הופך שקוף לחלוטין (אדמדם מציין זיהום בדם). </li></ol> ECFCs: <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 75 2 ס&quot;מ צפחת (קורנינג), תווית ומלא 15-20 מ&quot;ל של מדיום EGM-2 מראש התחמם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הכבל לתוך צלחת חדש מלא PBS סטרילית. קחו את המספריים כירורגית לחתוך את חבל הטבור לשתי חתיכות של כ -5 ס&quot;מ אורך (קטעים קצרים קל יותר בתהליך, כי כלי הטבור שזורות לאורך ציר שלהם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נסו למצוא את הווריד הטבורי (כלי גדול), להוסיף אחת להב מספריים כירורגיות שלך לחתוך את הווריד longitudinally. בשלב זה יכול להיות מועיל אם כעוזר יכול להחזיק את הווריד לחתוך כבר עם שני מלקחיים בזמן שאתה לחתוך עוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העוגה בחוטce עם הווריד לחתוך בצלחת חדשה ללא PBS, לקחת את מגרד לגרד תאים של פני השטח (אנדותל) הפנימי של וריד הטבור על ידי שפשוף מקצה אחד לקצה השני. העברת התאים בקבוק שהוכן על ידי ניקוי מגרד את קצה של המדיום. חזור על הליך זה לפחות 10 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את הבקבוק שלך ולשים אותו לתוך אינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, 95% לחות). </li></ol> MSCs: <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 150 2 ס&quot;מ תרבות צלחת (קורנינג) ואת התווית אותה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קחו את חתיכת חוט (לאחר מקרצפים את שכבת האנדותל) ו לחתוך את חבל הטבור כולו לחתיכות קטנות מאוד באמצעות מספריים סטרילית אזמל סטרילי. גודל מקסימלי של חתיכות חוט צריך להיות 1-2 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת חלקים כבל שלך עם מלקחיים סטרילי לתוך הצלחת שלך מראש שכותרתו תרבות. מאת עוזב צלחת הפתוח במשך 5 דקות לפני מתמלא בינוני, החיבור של החלקים למשטח פלסטיק מחוזק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חתיכות חוט מחוברים כראוי הפלסטיק, בעדינות מוסיפים 30-35 מ&quot;ל של אלפא טרום חימם שונה ממ. נסה להשתמש המהירות הנמוכה ביותר כדי לוודא כי כל החלקים נשארים מחוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את הצלחת להכניס אותו לתוך אינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, 95% לחות). </li></ol> חלק 3: הרחבת התא ואישור פנוטיפ-החיסונית על ידי זרימת cytometry Cell Expansion EFCFs: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הקובץ המצורף של בתאי האנדותל למחרת על מיקרוסקופ חילופי הפוכה כל EGM-2 בינוני להיפטר כל הלא צמוד תאים וחלקיקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרחב את התאים עד שליש מפגש וחילופי המדיום פעמיים בשבוע. כאשר המפגש הוא הגיע, לנתק את התאים עם 0.05% Trypsin/0.7 mM EDTA ולהעבירם כלי תרבות חדשה. בהתאם למספר התאים בתוך בקבוק שלך T75, אתה צריך לבחור את גודל ומספר צלוחיות החדש שלך כדי להבטיח את צפיפות זריעה נמוכה להתרחבות נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שערי שליש המדיום פעמיים בשבוע במהלך התרחבות של התאים. </li></ol> MSCs: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תולדה של MSCs מחוט ייקח יותר זמן, כך שאתה יכול לחכות לפחות 3-4 ימים עד שאתה לבדוק מיקרוסקופ הפוכה להופעת תאים דמויי כישור בסביבה של חתיכות רקמה המצורפת. כאשר יש תא מספיק מחוץ צמיחה, חתיכות נוטים לנתק כי הם מאבדים את הקשר עם הפלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 10-12 ימים להסיר את פיסות רקמה, לנתק את MSCs מפלסטיק עם 0.05% Trypsin/0.7 mM EDTA ולהעבירם כלי תרבות חדשה. בהתאם לכמות של תאים בתוך הצלחת שלך אתה צריך להחליט על גודל ומספר צלוחיות החדש שלך כדי להבטיח את צפיפות זריעה נמוכה להתרחבות נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שערי שליש המדיום פעמיים בשבוע במהלך התרחבות של התאים. </li></ol> תזרים cytometry ציוד נחוץ: תזרים cytometer (BD FACSCalibur), micronic צינורות (קורנינג), בעל צינור, כבשים סרום (חסימת מגיב), Eppifuge (Eppendorf), נוגדנים חד שבטיים MSCs: CD45, CD14, CD19, HLA-DR, CD31, CD73, CD90, CD105, שולטת אלוטיפ ECFCs: CD45, CD14, CD19, HLA-DR, CD31, CD34, CD90, CD105, CD144, CD146, שולטת אלוטיפ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שהגיע למפגש, לנתק את התא עם 0.05% Trypsin/0.7 mM EDTA ו צנטריפוגות ב 300 גרם ב 7 דקות 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את התאים בריכוז של 1x10 6 תאים / מ&quot;ל PBS שונה ומחייבת לחסום נוגדן נוקבים עם 10% v / v כבשים בסרום במשך 20 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבל צינורות micronic ולהוסיף את הריכוז המתאים של נוגדנים שכותרתו ניאון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של השעיה תא (חסום) כדי צינור כל דגירה למשך 30 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים על ידי הוספת שונה PBS להסיר בלתי מחייב נוגדנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכי עם תא שכותרתו שלך cytometer את זרימת ולבצע את הניתוח. </li></ol> חלק 4: המושבה ECFC צמיחה, קיבעון, מכתים וניתוח היררכיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרע ECFCs שנקטפו טהור כמעט בצפיפות נמוכה מאוד של ציפוי 3 או 10 תאים לסנטימטר מרובע צלחות תרבית תאים, כדי לאפשר צמיחה מושבה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שערי שליש המדיום פעמיים בשבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 14 ימים (סוף תרבות) להסיר בינוני, לשטוף פעמיים עם PBS ולתקן את מושבות עם פתרון קרים קיבעון (אצטון: מתנול = 3: 2) במשך 15 דקות במקרר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את הפתרון קיבעון ולהשאיר הצלחות לפתוח להתייבש במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רעננותם התאים עם מים מזוקקים במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף פתרון האריס Hematoxylin ואת כתם המושבות קבוע במשך 12 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון H matoxylin ולשטוף את הצלחות עם מי ברז להיפטר הפתרון מכתים הנותרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלמו תמונות של המושבה על ידי כלבאמצעות stereomicroscope ולייבא *. jpg או tif *. קבצים בפורמט למחשב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את התמונות באמצעות תוכנת ImageJ ולנתח את מספר הסלולרי מדויק של המושבה כל כמתואר האנימציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תוכנת ImageJ ולייבא תמונת המושבה באמצעות &quot;קובץ \ פתיחה&quot; לתפקד למשוך למטה בתפריט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך באמצעות &quot;תהליך \ רקע הפחת&quot; פונקציה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בפונקציה &quot;בחירה * * אליפטית או מברשת&quot; בתפריט ImageJ לסמן את השוליים המושבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את התמונה המקיפה באמצעות &#39;ערוך \ מחוץ נקה &quot;פונקציה לחתוך את התמונה על ידי בחירת&#39; Image יבול \ &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את הסף באופן ידני באמצעות &quot;תמונה \ כוונון \ סף&quot; לתפקד, כך שכל התאים נצבעים באדום לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים של המושבה על ידי בחירת &quot;נתח \ נתח חלקיקים&quot;. בחר את ההגדרות המתאימות (אופטימיזציה עבור כל סוג התא) ובחר &#39;אישור&#39;. תיבת התוצאות, כולל ספירת התאים תמונה חדשה המכילה את קווי המתאר המקביל התאים נספר יופיע. <img src="/files/ftp_upload/1525/1525op2.jpg" alt="איור 1" /></li></ol>

<ol>
	<li>Schallmoser, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+lysate+can+replace+fetal+bovine+serum+for+clinical-scale+expansion+of+functional+mesenchymal+stromal+cells.">Human platelet lysate can replace fetal bovine serum for clinical-scale expansion of functional mesenchymal stromal cells.</a> Transfusion. 47, 1436-1446 (2007).</li><li>Reinisch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+system+to+propagate+cord+blood-derived+multipotent+mesenchymal+stromal+cells+for+clinical+application.">Humanized system to propagate cord blood-derived multipotent mesenchymal stromal cells for clinical application.</a> Regen Med. 2, 371-382 (2007).</li><li>Reinisch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+large-scale+expanded+endothelial+colony-forming+cells+function+in+vitro+and+in+vivo.">Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo.</a> Blood. 113, 6716-6725 (2009).</li><li>Strunk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+characterization+and+preclinical+production+of+human+lineage-negative+cells+for+regenerative+stem+cell+therapy.">Phenotypic characterization and preclinical production of human lineage-negative cells for regenerative stem cell therapy.</a> Transfusion. 45, 315-326 (2005).</li></ol>

המחברים אין לי סכסוכים כספיים של עניין להכריז.

יש מגוון של מקורות שמהם לקבל MSCs או ECFCs כולל מח העצם, רקמת שומן, דם טבורי, וכו &#39; זה הכרחי כדי לקבל את שני הסוגים של אבות מאותו מקור כדי להשוות ישירות את מעורבותם של תאים מסוגים שונים בתהליכי התחדשות רקמות כמו כלי או תרומה התקדמות הג?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>alpha modified MEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-GLutamin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin/Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EBM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Single cytokine quots</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>75 cm2 flasks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>150 cm2 plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell scraper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin/EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Monoclonal antibodies</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickenson</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50 ml tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>500 mL filter 20 &mu;m pore size </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Preservative free heparin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biochrom</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation and animal serum free expansion of human umbilical cord derived mesenchymal stromal cells (mscs) and endothelial colony forming progenitor cells (ecfcs)

חבל הטבור הוא מקור עשיר עבור ובתאים עם פוטנציאל שגשוג גבוהה כולל תאים סטרומה mesenchymal (שמכונה גם בתאי גזע mesenchymal, MSCs) ו אנדותל להרכיב המושבה ובתאים (ECFCs). שני סוגי תאים הם שחקני מפתח בשמירה על שלמות רקמות הם כנראה מעורבים גם בתהליכי ההתחדשות היווצרות הגידול. כדי ללמוד ביולוגיה שלהם לתפקד באופן השוואתי חשוב יש גם סוגי תאים זמין מתורם זהה. זה יכול להיות גם מועיל למטרות משובי להפיק MSCs ו ECFCs מרקמות זהה. מאחר ותרופות הסלולר צריך בסופו של דבר מוצאים את דרכם מהספסל אל המיטה הקמנו שיטה חדשה לבודד להרחיב עוד יותר ובתאים ללא שימוש של חלבון מן החי. משולב lysate טסיות האנושי (pHPL) החליף בסרום שור העובר בכל השלבים של פרוטוקול שלנו לחלוטין להימנע ממגע של תאים וחלבונים xenogeneic. וידאו זה מדגים מתודולוגיה בידוד והרחבת ובתאים מחוט one הטבור. כל החומרים והנהלים יתוארו.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד והרחבת הבאות של תאים סטרומה mesenchymal ותאי האנדותל המושבה להרכיב ללא שימוש בבעלי חיים בסרום ליצור זוגות עצמיים למטרות השתלה ניסיונית.

בידוד בעלי חיים הרחבת חינם סרום של טבורי האדם נגזר תאים סטרומה mesenchymal (MSCs) ו האנדותל יצירת המושבה ובתאים (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

isolation-animal-serum-free-expansion-human-umbilical-cord-derived

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

15.3K Views.  Medical University of Graz, Austria. פרוטוקול זה מתאר את הבידוד והרחבת הבאות של תאים סטרומה mesenchymal ותאי האנדותל המושבה להרכיב ללא שימוש בבעלי חיים בסרום ליצור זוגות עצמיים למטרות השתלה ניסיונית.

Video: Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane. Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels often do not resemble vessels in vivo. Here we demonstrate an optimized in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts. This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis, and importantly the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. Vessels can be easily observed by phase-contrast and time-lapse microscopy, and recovered in pure form for downstream applications.

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

This video protocol illustrates the isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) from human umbilical cord. Once isolated these cells can be used for in vitro angiogenesis assays like the Optimized Fibrin Gel Bead Assay also demonstrated by the Hughes lab.

בידוד של האדם תאים עורק טבורי האנדותל (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

בידוד הרחבת בקנה מידה גדול של תאים אנושיים למבוגרים האנדותל המושבה יצירת אב

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Isolation and Enrichment of Rat Mesenchymal Stem Cells (MSCs) and Separation of Single-colony Derived MSCs

MSCs are a population of adult stem cells that is a promising source for therapeutic applications. These cells can be isolated from the bone marrow and can be easily separated from the hematopoietic stem cells (HSCs) due to their plastic adherence. This protocol describes how to isolate MSCs from rat femurs and tibias. The isolated cells were further enriched against two MSCs surface markers CD54 and CD90 by magnetic cell sorting. Expression of surface markers CD54 and CD90 were then confirmed by flow cytometry analysis. HSC marker CD45 was also included to check if the sorted MSCs were depleted of HSCs. MSCs are naturally quite heterogeneous. There are subpopulations of cells that have different shapes, proliferation and differentiation abilities. These subpopulations all express the known MSCs markers and no unique marker has yet been identified for the different subpopulations. Therefore, an alternative approach to separate out the different subpopulations is using cloning cylinders to separate out single-colony derived cells. The cells derived from the single-colonies can then be cultured and evaluated separately.

Isolation and Enrichment of Rat Mesenchymal Stem Cells MSCs and Separation of Single-colony Derived MSCs

Rat MSCs were isolated from femurs and tibias and then enriched by magnetic cell sorting. Sorted cells were confirmed for the expression of surface markers by flow cytometry. These cells were also cultured at clonal density to form single colonies and then these colonies were separated by cloning cylinders.

בידוד והעשרה של תאים עכברוש mesenchymal גזע (MSCs) והפרדה של המושבה, סינגל נגזר MSCs

MSCs are a population of adult stem cells that is a promising source for therapeutic applications. These cells can be isolated from the bone marrow and ...

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded and their collection does not imply any added risk to the newborn or mother s health. Moreover no ethical concerns are raised. The UC is composed by one vein and two arteries from which both endothelial cells (ECs) 1 and smooth muscle cells (SMCs) 2, two of the main cellular components of blood vessels, can be isolated. In this project the SMCs were obtained after enzymatic treatment of the UC arteries accordingly the experimental procedure previously described by Jaffe et al 3. After cell isolation they were kept in t-flash with DMEM-F12 supplemented with 5% of fetal bovine serum and were cultured for several passages. Cells maintained their morphological and other phenotypic characteristics in the different generations. The aim of this study was to isolate smooth muscle cells in order to use them as models for future assays with constrictor drugs, isolate and structurally characterize L-type calcium channels, to study cellular and molecular aspects of the vascular function 4 and to use them in tissue engineering.

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

The umbilical cords are used to isolate smooth muscle cells by different ways. In this work we used the enzymatic treatment to isolated smooth muscle cells.

בידוד של האדם עורקי טבורי תאים שרירים חלקים (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Phenotypic and Functional Characterization of Endothelial Colony Forming Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood

Longstanding views of new blood vessel formation via angiogenesis, vasculogenesis, and arteriogenesis have been recently reviewed1. The presence of circulating endothelial progenitor cells (EPCs) were first identified in adult human peripheral blood by Asahara et al. in 1997 2 bringing an infusion of new hypotheses and strategies for vascular regeneration and repair. EPCs are rare but normal components of circulating blood that home to sites of blood vessel formation or vascular remodeling, and facilitate either postnatal vasculogenesis, angiogenesis, or arteriogenesis largely via paracrine stimulation of existing vessel wall derived cells3. No specific marker to identify an EPC has been identified, and at present the state of the field is to understand that numerous cell types including proangiogenic hematopoietic stem and progenitor cells, circulating angiogenic cells, Tie2+ monocytes, myeloid progenitor cells, tumor associated macrophages, and M2 activated macrophages participate in stimulating the angiogenic process in a variety of preclinical animal model systems and in human subjects in numerous disease states4, 5. Endothelial colony forming cells (ECFCs) are rare circulating viable endothelial cells characterized by robust clonal proliferative potential, secondary and tertiary colony forming ability upon replating, and ability to form intrinsic in vivo vessels upon transplantation into immunodeficient mice6-8. While ECFCs have been successfully isolated from the peripheral blood of healthy adult subjects, umbilical cord blood (CB) of healthy newborn infants, and vessel wall of numerous human arterial and venous vessels 6-9, CB possesses the highest frequency of ECFCs7 that display the most robust clonal proliferative potential and form durable and functional blood vessels in vivo8, 10-13. While the derivation of ECFC from adult peripheral blood has been presented14, 15, here we describe the methodologies for the derivation, cloning, expansion, and in vitro as well as in vivo characterization of ECFCs from the human umbilical CB.

Endothelial colony forming cells (ECFCs) are circulating endothelial cells with robust clonal proliferative potential that display intrinsic in vivo vessel forming ability. Phenotypic and functional characterization of outgrowth endothelial cells derived from CB are important to identify and isolate bona fide ECFCs for potential clinical application in repairing damaged tissues.

אפיון פנוטיפי ופונקציונלי של תאים מושבה אנדותל יוצרי נגזר דם טבורי האדם קורד

Longstanding views of new blood vessel formation via angiogenesis, vasculogenesis, and arteriogenesis have been recently reviewed1. The presence of ...

Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells

Brown adipocytes have the ability to uncouple the respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat. Development of UCP1-positive brown adipocytes in white adipose tissues (so called beige or brite cells) is highly induced by a variety of environmental cues such as chronic cold exposure or by PPAR&gamma; agonists, therefore, this cell type has potential as a therapeutic target for obesity treatment. Although most immortalized adipocyte lines cannot recapitulate the process of "browning" of white fat in culture, primary adipocytes isolated from stromal vascular fraction in subcutaneous white adipose tissue (WAT) provide a reliable cellular system to study the molecular control of beige/brite cell development. Here we describe a protocol for effective isolation of primary preadipocytes and for inducing differentiation to beige/brite cells in culture. The browning effect can be assessed by the expression of brown fat-selective markers such as UCP1.

Primary white preadipocytes isolated from white adipose tissues in mice can be differentiated into beige/brite cells. Presented here is a reliable cellular model system to study the molecular regulation of "browning" of white fat.

בידוד והתמיינות של תאי כלי דם לתאי סטרומה בז&#39;ים / Brite

Brown adipocytes have the ability to uncouple the  respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat.  Development of UCP1-positive ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

אינדוקציה וניתוח של אפיתל לmesenchymal מעבר

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

בידוד של תאי Murine Valve האנדותל

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides the use of bone marrow and umbilical cord MSCs for exogenous cell therapy, there is also increasing interest in the repair and regenerative potential of resident tissue MSCs. Moreover, they likely have a role in normal organ development, and have been attributed roles in disease, particularly those with a fibrotic nature. The main hurdle for the study of these resident tissue MSCs is the lack of a clear marker for the isolation and identification of these cells. The isolation technique described here applies multiple characteristics of lung resident MSCs (L-MSCs). Upon sacrifice of the rats, lungs are removed and rinsed multiple times to remove blood. Following mechanical dissociation by scalpel, the lungs are digested for 2-3 hr using a mix of collagenase type I, neutral protease and DNase type I. The obtained single cell suspension is subsequently washed and layered over density gradient medium (density 1.073 g/ml). After centrifugation, cells from the interphase are washed and plated in culture-treated flasks. Cells are cultured for 4-7 days in physiological 5% O2, 5% CO2 conditions. To deplete fibroblasts (CD146-) and to ensure a population of only L-MSCs (CD146+), positive selection for CD146+ cells is performed through magnetic bead selection. In summary, this procedure reliably produces a population of primary L-MSCs for further in vitro study and manipulation. Because of the nature of the protocol, it can easily be translated to other experimental animal models.

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

This protocol describes an isolation technique for obtaining primary lung resident mesenchymal stromal cells from rats, through the use of enzymatic digestion, density gradient separation, plastic adherence and CD146+ magnetic bead selection.

בידוד של CD146<sup&gt; +</sup&gt; תאי סטרומה mesenchymal ריאות התושב מריאות העכברוש

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, epithelial progenitor cells can self-renew and generate differentiating progeny that exhibit cellular functions similar to those of their in vivo counterparts. Herein we describe a step-by-step protocol to isolate region-specific progenitors from human lung and generate 3D organoid cultures as an experimental and validation tool. We define proximal and distal regions of the lung with the goal of isolating region-specific progenitor cells. We utilized a combination of enzymatic and mechanical dissociation to isolate total cells from the lung and trachea. Specific progenitor cells were then fractionated from the proximal or distal origin cells using fluorescence associated cell sorting (FACS) based on cell type-specific surface markers, such as NGFR&#160;for sorting basal cells and HTII-280 for sorting alveolar type II cells. Isolated basal or alveolar type II progenitors were used to generate 3D organoid cultures. Both distal and proximal progenitors formed organoids with a colony forming efficiency of 9-13% in distal region and 7-10% in proximal region when plated 5000 cell/well on day 30. Distal organoids maintained HTII-280+ alveolar type II cells in culture whereas proximal organoids differentiated into ciliated and secretory cells by day 30. These 3D organoid cultures can be used as an experimental tool for studying the cell biology of lung epithelium and epithelial mesenchymal interactions, as well as for the development and validation of therapeutic strategies targeting epithelial dysfunction in a disease.

This article provides a detailed methodology for tissue dissociation and cellular fractionation approaches allowing enrichment of viable epithelial cells from proximal and distal regions of the human lung. Herein these approaches are applied for the functional analysis of lung epithelial progenitor cells through the use of 3D organoids culture models.

בידוד והעשרה של תאי אב אפיתל הריאה האנושיים לתרבית אורגנואידית

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...