Yazarlar yazının yararlı yorumlar, Daniela Thaler ve Margaretha Fr hwirth teknik yardım için, dil düzenleme için Monica Farrell, Uwe Lang, Margit Holzapfel ve Kadın Hastalıkları Bölümü Sandra Eppich pHPL, Eva Rohde ve Nicole Hofmann sağlamak için Katharina Schallmoser teşekkür Kabloları sağlamak için. Bu çalışma, Avusturya Araştırma Vakfı (FWF, DS hibe N211-NAN), Avusturya Araştırma Promosyon Ajansı (FFG, hibe N200 DS) ve Yetişkin Kök Hücre Araştırma Vakfı (AR) tarafından desteklenmiştir. AR doktora programı Graz Üniversitesi Tıp Fakültesi Moleküler Tıp üyesidir.

Bölüm 1: ayarlama 1. Hücre kültür ortamı hazırlanması Orta hazırlığı başlamadan önce tüm malzemeleri ve gereken araçlar topluyoruz. Çözülme 2 toplanmış insan trombosit lizat x 56 ml alikotları (pHPL, kendi kendine: Referans 1 ve Jüpiter # 1523), 100x Penisilin / Streptomisin çözümü, 2 adet 10 ml x 5 ml L-Glutamin (Sigma hem). EGM-2 orta boy (Lonza) 1 şişe (500 ml) ek için ayarlanan sitokin ve büyüme faktörü alikotları (VEGF, bFGF, EGF, IGF, hidrokortizon, Amfoterisin &#39;tek quots&#39; olarak askorbik asit, heparin,) Çözülme. Buzdolabından bir adet 500 ml şişe (i) her minimal temel orta alfa-modifiye (MEM) ve (ii) endotel bazal, orta (KDT). Aşağıdaki adımları, steril koşullar altında bir laminer akış doku kültürü kaputu yapılmaktadır. 1000 IU / mL steril su ile son bir konsantrasyon toz eriterek, koruyucu içermeyen heparin (örneğin, Biochrom) hazırlayın. MSC-Orta: 500 mL-MEM kullanın çözülmüş pHPL 56 ml (da daha fazla ayrıntı için 1 referans) ve 2 IU / mL (= 224 ul stok solüsyonu), koruyucu içermeyen Heparin (orta, topaklanma yoluyla koagülasyon önler eklemek plazma fibrinojen)% 10 pHPL bir final konsantrasyonuna ulaşmak için. Ayrıca Penisilin (100U/mL) / Streptomisin (100μg/mL) çözüm ve L-glutamin 2mm (Sigma hem) ekleyin. 20 mikron gözenek boyutu vakum filtresi (Millipore) ile orta Filtresi. (Içerik, tarih) uygun şişe etiketi. ECFC-Orta: EBM bir şişe (500 ml) kullanın ekleyin, sitokin alikotları, koruyucu içermeyen Heparin pHPL, 10 IU / ml (= 1120μl stok solüsyonu) 56 mL, Penisilin (100U/mL) / Streptomisin (100 g / ml) solüsyonu ve 20 ul-gözenek boyutu vakum filtresi (Millipore) ile bazal, orta ve filtre L-glutamin 2mm. (Içerik, tarih) uygun şişe etiketi. 2. Cerrahi aletlerin sterilizasyon Forseps, cerrahi makas ve neşter sahibinin keskin çifti ısı sterilize cevheri steril tek kullanımlık olmalıdır. 3. Kordon koleksiyonu için tüplerin hazırlanması 50 ml polipropilen tüpler (Falcon) ücretsiz heparin ve son hacim 20 ml PBS ile uyum - 500 IU koruyucu ekleyin. Tüpleri teslim odasına aktarın. 4. Aydınlatılmış onam (yerel etik kurul veya IRB tarafından onaylandıktan sonra). Kablonun bir parça bağış ve yeterli hizmet amaçları onları bilgilendirmek istiyorsanız teslimat için önce anne ve babalar sorabilir. 5. Kordon bağış Plasenta ve kord teslimat ve teftişin 10 cm bir parça kesti ve hemen kordon damarları içindeki kalan kanın pıhtılaşma önlemek için heparin ile önceden doldurulmuş tüp transferinden sonra. En kısa sürede hücre izolasyonu ile devam edin. Bölüm 2: Hücre izolasyonu <ol><li> Incidin veya% 70 EtOH yüzeylerin temizlenmesi, laminer akış doku kültürü kaputu hazırlayın. Yeri steril 150 cm 2 hücre kültürü tabak, 75 cm hücre kültürü şişeleri (Corning), PBS, steril cerrahi aletler, cep kazıyıcılar, tüp tutucu, 25 ml stripettes ve 5 ml şırınga temizlenir kaputu uygun künt sonunda iğne ile donatılmış. </li><li> Pre-sıcak hazırlanan α-MEM ve EGM-2 hücre kültürü orta 37 ° C su banyosu. </li><li> Doğumhane hücre kültürü kaputu ile donatılmış laboratuvar kablosu getirin. Laminer akım kablosunun aktardıktan sonra, kan hücrelerinin kontamine kurtulmak için (yeni bir plaka transfer) PBS içinde iki kez yıkayın. Umbilikal ven kablosunun diğer ucunu çıkan sıvı kadar PBS ile künt sonunda iğne ile donatılmış steril bir 5 ml&#39;lik şırınga ile bir tarafta canulating sonra durulayın (kırmızımsı kan kontaminasyonu gösterir) tamamen şeffaf hale gelir. </li></ol> ECFCs: <ol start="4"><li> 75 cm 2 balonuna (Corning) hazırlayın, etiket ve önceden ısıtılmış EGM-2 orta 15-20 ml doldurun. </li><li> Kablosu steril PBS ile dolu yeni bir tabak içine yerleştirin. Cerrahi makas alın ve yaklaşık 5 cm uzunluğunda iki adet (göbek damarları kendi ekseni boyunca bükülmüş, çünkü kısa parçalar, süreci daha kolay) içine göbek kordonu kesmek. </li><li> Umbilikal ven (büyük damar) bulmaya çalışın cerrahi makas, bir bıçak yerleştirin ve uzunlamasına damar kesmek. Bu noktada daha engellerken, bir asistan, iki forseps ile zaten kesilmiş damar tutabilir yararlı olabilir. </li><li> Kord pasta yerleştirin.ce PBS olmadan yeni plaka kesme damar, hücre kazıyıcı ve bir ucundan diğer rubbings umbilikal ven iç (endotel) yüzey kazıma alır. Orta sıyırıcı ucu temizleme hazırlanmış balona hücrelere aktarın. Bu işlem en az 10 kez tekrarlayın. </li><li> Şişeyi kapatın ve içine koymak, bir kuluçka makinesi (37 ° C,% 5 CO 2,% 95 nem) . </li></ol> MKH: <ol start="4"><li> 150 cm 2 kültür plakasına (Corning) hazırlayın ve etiket. </li><li> (Endotel tabakası kazıyarak sonra) kablosunun parça alın ve steril makas ve steril bistüri ile çok küçük parçalar halinde tüm kablosunu kesip. Kord adet maksimum boyutu 1-2 mm olmalıdır. </li><li> Önceden etiketli kültür plakasına steril forseps ile kordon adet aktarın. Plaka orta ile doldurmadan önce 5 dakika boyunca açık bırakarak, plastik yüzey adet ek güçlendirilmiştir. </li><li> Kord adet plastik uygun bağlandıktan sonra, yavaşça 30-35 ml MEM değiştirilmiş önceden ısıtılmış alfa ekleyin. Tüm parçaları takılı kalması emin olmak için en düşük hızda kullanmayı deneyin. </li><li> Tabak kapatın ve içine koymak, bir kuluçka makinesi (37 ° C,% 5 CO 2,% 95 nem) . </li></ol> Bölüm 3: Hücre genişlemesi ve flow sitometri ile bağışıklık-fenotip onay Hücre Genişleme EFCFs: <ol><li> Ters bir mikroskop ve döviz endotelyal hücrelerin ek bir sonraki gün kontrol edin bütün EGM-2 bağlı olmayan tüm hücreleri ve parçacıkların kurtulmak için orta. </li><li> Orta izdiham ve döviz üçte biri haftada iki kez kadar hücreleri genişletin. Izdiham ulaşıldığında,% 0.05 &#39;Trypsin/0.7 mM EDTA hücreleri ayırmak ve yeni bir kültür gemilere aktarmak. Sizin T75 şişesinin içinde hücrelerinin sayısına bağlı olarak, daha da genişlemesi için düşük ekim yoğunluğu garanti altına almak için yeni şişeler sayı ve büyüklüğü seçmelisiniz. </li><li> Exchange üçte biri haftada iki kez hücrelerinin genişlemesi sırasında orta. </li></ol> MKH: <ol><li> Kabloyu MKH akıbet daha fazla zaman alacaktır, bu yüzden bağlı doku parçaları çevrede iğ şekilli hücreler görünüm için ters bir mikroskop kadar en az 3-4 gün bekleyebilir. Yeterli hücre dışı büyüme olduğunda, adet plastik ile temas kaybı nedeniyle ayırmak için eğilimindedir. </li><li> 10-12 gün doku parçaları kaldırdıktan sonra,% 0.05 &#39;Trypsin/0.7 mM EDTA ile plastik MKH ayırmak ve yeni bir kültür damarlarının aktarabilirsiniz. Plağındaki hücrelerinin miktarına bağlı olarak daha da genişlemesi için düşük ekim yoğunluğu garanti altına almak için yeni şişe büyüklüğü ve sayısına karar. </li><li> Exchange üçte biri haftada iki kez hücrelerinin genişlemesi sırasında orta. </li></ol> Flow sitometri Gerekli ekipman: Akış sitometresi (BD FACSCalibur), mikronik tüpleri (Corning), tüp tutucu, koyun serum (reaktif engelleme), Eppifuge (Eppendorf), monoklonal antikorlar MKH: CD45, CD14, CD19, HLA-DR, CD31, CD73, CD90, CD105, izotip kontrol ECFCs: CD45, CD14, CD19, HLA-DR, CD31, CD34, CD90, CD105, CD144, CD146, izotip kontrol <ol><li> Izdiham ulaştıktan sonra, 4 dk 7 300g 0.05% Trypsin/0.7 mM EDTA ve santrifüj hücre ayırmak ° C </li><li> Modifiye PBS ve% 10, 4 dakika 20 v / v koyun serum ° C blok belirsiz antikor bağlanma 1x10 6 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyon hücreleri yeniden süspanse </li><li> Etiket mikronik tüpleri ve floresan etiketli antikorlar uygun konsantrasyonda ekleyin. </li><li> Her bir tüp hücre süspansiyonu (bloke) 50 ul ekleyin ve 30 dakika boyunca inkübe 4 ° C </li><li> Bağlayıcı olmayan antikorlar kaldırmak için modifiye PBS ekleyerek hücrelerin yıkayın. </li><li> Akış sitometresinin etiketli hücre ile gidin ve analiz yapmak. </li></ol> Bölüm 4: ECFC koloni büyüme, fiksasyon, boyama ve hiyerarşi analizi <ol><li> Tohum santimetre kare başına 3 veya 10 hücre hücre kültürü plakaları çok düşük kaplama yoğunluğu neredeyse saf hasat ECFCs tek koloni büyümesi için izin vermek. </li><li> Exchange üçte biri haftada iki kez orta. </li><li> 14 gün (kültür sonu) orta kaldırdıktan sonra, PBS ile iki kez yıkayın ve buz gibi fiksasyon çözüm (Aseton 2: Metanol = 3) koloniler düzeltmek buzdolabında 15 dakika boyunca. </li><li> Fiksasyon çözüm atın ve plakalar 10 dakika kuruması için açık bırakın. </li><li> Distile su ile 10 dakika hücreleri rehidrate. </li><li> Harris hematoksilen çözeltisi ekleyin ve 12 dakika boyunca sabit koloniler leke. </li><li> H matoxylin çözüm çıkarın ve kalan boyama çözüm kurtulmak için musluk suyu ile plakalar durulayın. </li><li> Her koloninin fotoğraflar çekinstereomikroskopta ve ithalat kullanarak *. jpg veya bilgisayarınıza *. tif formatındaki dosyalar. </li><li> ImageJ yazılımı ile fotoğrafları açın ve animasyon açıklandığı gibi her koloninin doğru hücre sayısı analiz. </li><li> ImageJ yazılımını açın ve menü aşağı çekme &#39;Dosya \ Open&#39; fonksiyonunu kullanarak bir koloni resmi ithalat. </li><li> Fonksiyonu &#39;\ çıkart Arkaplan Süreci&#39; ile devam edin </li><li> Koloni marjı işaretlemek için ImageJ menüsünde &#39;* eliptik veya fırça seçimi&#39; işlevini kullanın. </li><li> &#39;Düzenle \ Clear dışında&#39; fonksiyonu ve kırpma &#39;\ kırpma&#39; seçilerek resmi kullanarak, çevredeki görüntü temizleyin. </li><li> Kullanarak elle ayarlayabilirsiniz.Özellik &#39;Resim \ \ Eşik ayarlayın&#39; tüm hücreleri tamamen kırmızı renkli, böylece fonksiyonu. </li><li> &quot;Analyze \ analiz Parçacıklar &#39;seçerek koloni hücre sayısını saymak. Uygun ayarları (her bir hücre tipi için optimize) seçin ve &#39;OK&#39; i seçin. Hücre sayımı ve sayılan hücrelerin karşılık gelen ana hatlarını içeren bir yeni görüntü de dahil olmak üzere sonuçları kutusunda görünecektir. <img src="/files/ftp_upload/1525/1525op2.jpg" alt="Şekil 1" /></li></ol>

<ol>
	<li>Schallmoser, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+lysate+can+replace+fetal+bovine+serum+for+clinical-scale+expansion+of+functional+mesenchymal+stromal+cells.">Human platelet lysate can replace fetal bovine serum for clinical-scale expansion of functional mesenchymal stromal cells.</a> Transfusion. 47, 1436-1446 (2007).</li><li>Reinisch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+system+to+propagate+cord+blood-derived+multipotent+mesenchymal+stromal+cells+for+clinical+application.">Humanized system to propagate cord blood-derived multipotent mesenchymal stromal cells for clinical application.</a> Regen Med. 2, 371-382 (2007).</li><li>Reinisch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+large-scale+expanded+endothelial+colony-forming+cells+function+in+vitro+and+in+vivo.">Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo.</a> Blood. 113, 6716-6725 (2009).</li><li>Strunk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+characterization+and+preclinical+production+of+human+lineage-negative+cells+for+regenerative+stem+cell+therapy.">Phenotypic characterization and preclinical production of human lineage-negative cells for regenerative stem cell therapy.</a> Transfusion. 45, 315-326 (2005).</li></ol>

Yazarlar, herhangi bir mali çatışmalar faiz beyan etmek zorunda değilsiniz.

Kemik iliği, yağ dokusu, kordon kanı, vb de dahil olmak üzere MKH veya ECFCs almak için çeşitli kaynaklardan vardır Bu doku ve damar yenilenme veya tümör progresyonu katkı gibi süreçlerde farklı hücre tiplerinin doğrudan katılımını karşılaştırmak için aynı kaynaktan atalarıdır iki türlü elde etmek için gereklidir. Izole etmek ve daha sonra aynı donörden ECFCs ve MKH otolog çiftleri çalışma kolaylığı olan bu yöntem bireysel...

<table><tbody><tr><td>alpha modified MEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-GLutamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EBM</td><td>Lonza Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Single cytokine quots</td><td>Lonza Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; flasks</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>150 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; plates</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell scraper</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal antibodies</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml tubes</td><td>Falcon BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>500 mL filter 20 &amp;mu;m pore size </td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Preservative free heparin</td><td>Biochrom AG</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and animal serum free expansion of human umbilical cord derived mesenchymal stromal cells (mscs) and endothelial colony forming progenitor cells (ecfcs)

Göbek kordonu, mezenkimal stromal hücreler (mezenkimal kök hücreler olarak da adlandırılır, MKH) ve endotel progenitör hücrelerin koloni oluşturan (ECFCs) de dahil olmak üzere yüksek proliferatif potansiyele sahip progenitör hücreler için zengin bir kaynaktır. Her iki hücre tipleri, doku bütünlüğünün korunmasında anahtar oyuncular ve muhtemelen de rejeneratif süreçleri ve tümör oluşumu ilgilidirler. Biyoloji ve karşılaştırmalı bir şekilde çalışma için aynı vericiden alınan hücreler türleri olması önemlidir. Ayrıca aynı doku MKH ve ECFCs türetmek için rejeneratif amaçlar için faydalı olabilir. Hücresel terapötikler sonunda Masadan yatağın başucuna kendi yolunu bulmak gerekir çünkü biz, izole etmek için yeni bir yöntem kurulmuş ve daha fazla hayvansal protein kullanmadan progenitör hücrelerin genişletmek. Pooled insan trombosit lizatı (pHPL) fetal sığır serumu tamamen xenogeneic proteinler hücreleri temas önlemek için tüm adımları protokol yerini aldı. Bu video bir göbek kordonu progenitör hücrelerin izolasyonu ve genişleme için bir metodoloji ortaya koymaktadır. Tüm malzeme ve usulleri açıklanan olacaktır.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

Bu protokol deneysel nakli amaçlı otolog yaratmanız serum hayvan kullanmadan mezenkimal stromal hücreleri ve endotel koloni oluşturan hücrelerin izolasyonu ve sonraki genişleme açıklamaktadır.

İnsan Göbek kordonu İzolasyon ve Hayvan Serum Genişleme Mezenkimal stromal hücreler (MKH) ve endotel Koloni Oluşturan Progenitör Hücreler (ECFCs) Türetilmiş

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

isolation-animal-serum-free-expansion-human-umbilical-cord-derived

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

15.4K Görüntüleme.  Medical University of Graz, Austria. Bu protokol deneysel nakli amaçlı otolog yaratmanız serum hayvan kullanmadan mezenkimal stromal hücreleri ve endotel koloni oluşturan hücrelerin izolasyonu ve sonraki genişleme açıklamaktadır.

Video: Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

Isolation of Human Mesenchymal Stem Cells and their Cultivation on the Porous Bone Matrix

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold. Thus, the application of MSCs in repair and tissue regeneration processes depends principally on the efficient implementation of the techniques for placing these cells in a host tissue. For this reason, the design of biomaterials and cellular scaffolds has gained importance in recent years because the topographical characteristics of the selected scaffold must ensure adhesion, proliferation and differentiation into the desired cell lineage in the microenvironment of the injured tissue. This option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) employs bovine bone matrix as a cellular scaffold and is an efficient culture technique because the cells respond to the topographic characteristics of the bovine bone matrix Nukbone (NKB), i.e., spreading on the surface, macroporous covering and colonizing the depth of the biomaterial, after the cell isolation process. We present the procedure for isolating and culturing MSCs on a bovine matrix.

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs the bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold.

İnsan Mezenkimal Kök Hücre İzolasyonu ve Gözenekli Kemik Matrix kendi Yetiştirme

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific ...

Gelişim Biyolojisi

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.

Herein we describe methods for the dissection of fetal and maternal tissues from human term placenta, followed by isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells (MSC) from these tissues.

İnsan Plasenta Doku türetilen İzolasyon ve mezenkimal kök Genişleme / Stromal hücreler

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly gained attention because they do not pose any ethical or moral concerns. Current methods to isolate MSCs from UC yield low amounts of cells with variable proliferation potentials. Since UC is an anatomically-complex organ, differences in MSC properties may be due to the differences in the anatomical regions of their isolation. In this study, we first dissected the cord/placenta samples into three discrete anatomical regions: UC, cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP). Second, two distinct zones, cord lining (CL) and Wharton&#39;s jelly (WJ), were separated. The explant culture technique was then used to isolate cells from the four sources. The time required for the primary culture of cells from the explants varied depending on the source of the tissue. Outgrowth of the cells occurred within 3 - 4 days of the CPJ explants, whereas growth was observed after 7 - 10 days and 11 - 14 days from CL/WJ and FP explants, respectively. The isolated cells were adherent to plastic and displayed fibroblastoid morphology and surface markers, such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, similarly to bone marrow (BM)-derived MSCs. However, the colony-forming efficiency of the cells varied, with CPJ-MSCs and WJ-MSCs showing higher efficiency than BM-MSCs. MSCs from all four sources differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, indicating that they were multipotent. CPJ-MSCs differentiated more efficiently in comparison to other MSC sources. These results suggest that the CPJ is the most potent anatomical region and yields a higher number of cells, with greater proliferation and self-renewal capacities in vitro. In conclusion, the comparative analysis of the MSCs from the four sources indicated that CPJ is a more promising source of MSCs for cell therapy, regenerative medicine, and tissue engineering.

Here, we present a protocol for the dissection of human umbilical cord (UC) and fetal placenta sample into cord lining (CL), Wharton&#39;s jelly (WJ), cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP) for the isolation and characterization of mesenchymal stromal cells (MSCs) using the explant culture technique.

İnsan göbek bağı ve fetal plasentadan Mezenkimal Stromal Hücre İzolasyonu ve Vasıflandırılması

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and colleagues1. Later, others documented the existence of similar types of EPCs originating from bone marrow2,3. More recently, Yoder and Ingram showed that EPCs derived from umbilical cord blood had a higher proliferative potential compared to ones isolated from adult peripheral blood4,5,6. Apart from being involved in postnatal vasculogenesis, EPCs have also shown promise as a cell source for creating tissue-engineered vascular and heart valve constructs7,8. Various isolation protocols exist, some of which involve the cell sorting of mononuclear cells (MNCs) derived from the sources mentioned earlier with the help of endothelial and hematopoietic markers, or culturing these MNCs with specialized endothelial growth medium, or a combination of these techniques9. Here, we present a protocol for the isolation and culture of EPCs using specialized endothelial medium supplemented with growth factors, without the use of immunosorting, followed by the characterization of the isolated cells using Western blotting and immunostaining.

The goal of this protocol is to isolate endothelial progenitor cells from umbilical cord blood. Some of the applications include using these cells as a biomarker for identifying patients with cardiovascular risk, treating ischemic diseases, and creating tissue-engineered vascular and heart valve constructs.

Yalıtım endotelyal Progenitor Hücre insan göbek kordon kanı

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

İzolasyon ve Büyük Ölçekli Genişleme Yetişkin İnsan Endotel Koloni Oluşturan Progenitör Hücreler

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Biyoloji

Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants

Mesenchymal stem cells (MSCs) have considerable therapeutic potential and attract increasing interest in the biomedical field. MSCs are originally isolated and characterized from bone marrow (BM), then acquired from tissues including adipose tissue, synovium, skin, dental pulp, and fetal appendages such as placenta, umbilical cord blood (UCB), and umbilical cord (UC). MSCs are a heterogeneous cell population with the capacity for (1) adherence to plastic in standard culture conditions, (2) surface marker expression of CD73+/CD90+/CD105+/CD45-/CD34-/CD14-/CD19-/HLA-DR- phenotypes, and (3) trilineage differentiation into adipocytes, osteocytes, and chondrocytes, as currently defined by the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Although BM is the most widely used source of MSCs, the invasive nature of BM aspiration ethically limits its accessibility. Proliferation and differentiation capacity of MSCs obtained from BM generally decline with the age of the donor. In contrast, fetal MSCs obtained from UC have advantages such as vigorous proliferation and differentiation capacity. There is no ethical concern for UC sampling, as it is typically regarded as medical waste. Human UC starts to develop with continuing growth of the amniotic cavity at 4-8 weeks of gestation and keeps growing until reaching 50-60 cm in length, and it can be isolated during the whole newborn delivery period. To gain insight into the pathophysiology of intractable diseases, we have used UC-derived MSCs (UC-MSCs) from infants delivered at various gestational ages. In this protocol, we describe the isolation and characterization of UC-MSCs from fetuses/infants at 19-40 weeks of gestation.

Human umbilical cord (UC) can be obtained during the perinatal period as a result of preterm, term, and postterm delivery. In this protocol, we describe the isolation and characterization of UC-derived mesenchymal stem cells (UC-MSCs) from fetuses/infants at 19-40 weeks of gestation.

Yalıtım ve insan göbek kordonu kaynaklı mezenkimal kök hücre erken Doğum ve terim bebekler karakterizasyonu

Mesenchymal stem cells (MSCs) have considerable therapeutic potential and attract increasing interest in the biomedical field. MSCs are originally ...

Isolation and Culture of Three Kinds of Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells

Umbilical cord mesenchymal stem cells (UC-MSCs) are an important cell source for regenerative medicine. UC-MSCs can be isolated from the umbilical cord Wharton's jelly, as well as from the umbilical arteries and umbilical vein. They are known as perivascular stem cells obtained from umbilical arteries (UCA-PSCs), perivascular stem cells obtained from the umbilical vein (UCV-PSCs), and mesenchymal stem cells obtained from Wharton's jelly (WJ-MSCs). UCA-PSCs and UCV-PSCs are pericytes derived from perivascular regions that are progenitors of MSCs. Isolation and culture of the three kinds of cells is an important source for studying stem cell transplantation and repair. The present protocol focuses on the isolation and culture of cells through mechanical separation, adherent culture, and cell crawling out. Through this technique, the three different types of stem cells can be derived. Cell surface markers were detected by flow cytometry. The stem cells were detected for multilineage differentiation potential by adipogenic, osteogenic, and neural-like differentiation, which is consistent with the phenotype of MSCs. This experimental protocol expands the source of UC-MSCs. In addition, the cell isolation method provides a basis for further study of regenerative medicine and other applications.

The present protocol describes the isolation and culture of mesenchymal stem cells from the umbilical cord arteries, vein, and Wharton's jelly.

Umbilical cord mesenchymal stem cells (UC-MSCs) are an important cell source for regenerative medicine. UC-MSCs can be isolated from the umbilical cord ...

Phenotypic and Functional Characterization of Endothelial Colony Forming Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood

Longstanding views of new blood vessel formation via angiogenesis, vasculogenesis, and arteriogenesis have been recently reviewed1. The presence of circulating endothelial progenitor cells (EPCs) were first identified in adult human peripheral blood by Asahara et al. in 1997 2 bringing an infusion of new hypotheses and strategies for vascular regeneration and repair. EPCs are rare but normal components of circulating blood that home to sites of blood vessel formation or vascular remodeling, and facilitate either postnatal vasculogenesis, angiogenesis, or arteriogenesis largely via paracrine stimulation of existing vessel wall derived cells3. No specific marker to identify an EPC has been identified, and at present the state of the field is to understand that numerous cell types including proangiogenic hematopoietic stem and progenitor cells, circulating angiogenic cells, Tie2+ monocytes, myeloid progenitor cells, tumor associated macrophages, and M2 activated macrophages participate in stimulating the angiogenic process in a variety of preclinical animal model systems and in human subjects in numerous disease states4, 5. Endothelial colony forming cells (ECFCs) are rare circulating viable endothelial cells characterized by robust clonal proliferative potential, secondary and tertiary colony forming ability upon replating, and ability to form intrinsic in vivo vessels upon transplantation into immunodeficient mice6-8. While ECFCs have been successfully isolated from the peripheral blood of healthy adult subjects, umbilical cord blood (CB) of healthy newborn infants, and vessel wall of numerous human arterial and venous vessels 6-9, CB possesses the highest frequency of ECFCs7 that display the most robust clonal proliferative potential and form durable and functional blood vessels in vivo8, 10-13. While the derivation of ECFC from adult peripheral blood has been presented14, 15, here we describe the methodologies for the derivation, cloning, expansion, and in vitro as well as in vivo characterization of ECFCs from the human umbilical CB.

Endothelial colony forming cells (ECFCs) are circulating endothelial cells with robust clonal proliferative potential that display intrinsic in vivo vessel forming ability. Phenotypic and functional characterization of outgrowth endothelial cells derived from CB are important to identify and isolate bona fide ECFCs for potential clinical application in repairing damaged tissues.

Endotel Colony Forming Hücrelerinin Fenotipik ve Fonksiyonel Karakterizasyonu İnsan Göbek Kordonu Kanı türetilen

Longstanding views of new blood vessel formation via angiogenesis, vasculogenesis, and arteriogenesis have been recently reviewed1. The presence of ...

Çözünebilir Mikro Taşıyıcılara Dayalı Yapışık Hücrelerin Kapalı Sistem Üretimi

Large-Scale Cell Production Based on GMP-Grade Dissolvable Porous Microcarriers

Researchers in the cell and gene therapy (CGT) industry have long faced a formidable challenge in the efficient and large-scale expansion of cells. To address the primary shortcomings of the two-dimensional (2D) planar culturing system, we innovatively developed an automated closed industrial scale cell production (ACISCP) platform based on a GMP-grade, dissolvable, and porous microcarrier for the 3D culture of adherent cells, including human mesenchymal stem/stromal cells (hMSCs), HEK293T cells, and Vero cells. To achieve large-scale expansion, a two-stage expansion was conducted with 5 L and 15 L stirred-tank bioreactors to yield 1.1 x 1010 hMSCs with an overall 128-fold expansion within 9 days. The cells were harvested by completely dissolving the microcarriers, concentrated, washed and formulated with a continuous-flow centrifuge-based cell processing system, and then aliquoted with a cell filling system. Compared with 2D planar culture, there are no significant differences in the quality of hMSCs harvested from 3D culture. We have also applied these dissolvable porous microcarriers to other popular cell types in the CGT sector; specifically, HEK293T cells and Vero cells have been cultivated to peak cell densities of 1.68 x 107 cells/mL and 1.08 x 107 cells/mL, respectively. This study provides a protocol for using a bioprocess engineering platform harnessing the characteristics of GMP-grade dissolvable microcarriers and advanced closed equipment to achieve the industrial-scale manufacturing of adherent cells.

Yazar Spotlight: Çözünebilir Mikro Taşıyıcılarla Hücre Tedavisi Üretimini İlerletmek 

Here, we present a protocol to achieve the large-scale manufacturing of adherent cells through a fully closed system based on GMP-grade dissolvable microcarriers. The cultivation of human mesenchymal stem cells, HEK293T cells, and Vero cells was validated and met both quantity demands and quality criteria for the cell and gene therapy industry.

GMP Sınıfı Çözünebilir Gözenekli Mikro Taşıyıcılara Dayalı Büyük Ölçekli Hücre Üretimi

Researchers in the cell and gene therapy (CGT) industry have long faced a formidable challenge in the efficient and large-scale expansion of cells. To ...

İnsan Göbek kordonu İzolasyon ve Hayvan Serum Genişleme Mezenkimal stromal hücreler (MKH) ve endotel Koloni Oluşturan Progenitör Hücreler (ECFCs) Türetilmiş

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

İnsan Mezenkimal Kök Hücre İzolasyonu ve Gözenekli Kemik Matrix kendi Yetiştirme

İnsan Plasenta Doku türetilen İzolasyon ve mezenkimal kök Genişleme / Stromal hücreler

İnsan göbek bağı ve fetal plasentadan Mezenkimal Stromal Hücre İzolasyonu ve Vasıflandırılması

Yalıtım endotelyal Progenitor Hücre insan göbek kordon kanı

İzolasyon ve Büyük Ölçekli Genişleme Yetişkin İnsan Endotel Koloni Oluşturan Progenitör Hücreler

Yalıtım ve insan göbek kordonu kaynaklı mezenkimal kök hücre erken Doğum ve terim bebekler karakterizasyonu

Isolation and Culture of Three Kinds of Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells

Endotel Colony Forming Hücrelerinin Fenotipik ve Fonksiyonel Karakterizasyonu İnsan Göbek Kordonu Kanı türetilen

GMP Sınıfı Çözünebilir Gözenekli Mikro Taşıyıcılara Dayalı Büyük Ölçekli Hücre Üretimi

GMP Sınıfı Çözünebilir Gözenekli Mikro Taşıyıcılara Dayalı Büyük Ölçekli Hücre Üretimi