دال Sames شكرا وهارولد G. &amp; Y. ليلى ماذرز الخيرية والمبادرات في جامعة كولومبيا في العلوم والهندسة. دال Sames وسولزر D. أشكر مؤسسة ماكنايت للابتكارات التكنولوجية في ماكنايت جائزة العلوم العصبية دال سولزر الشكر النداء ، NIMH ، وPicower المؤسسات ومرض باركنسون. H. بفضل تشانغ NARSAD. RH ادواردز يشكر مايكل جيه فوكس ، ومؤسسة باركنسون المؤسسة الوطنية ، والمعهد الوطني NIMH. نشكر روبرت بورك لمدة 6 - OHDA الحقن والمشورة ، Sonders مارك للمناقشة مفيدة ، Merek سيو للبرمجة التحليل والتصوير ، وSchmoranzer يناير للحصول على الدعم التقني مع الإعداد TIRF المجهري.

وقد استخدم هذا الأسلوب في البحث عنها في <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/full/324/5933/1441">Gubernator وآخرون ، علم 324 (5933). 1441-1444 (2009)</a> . 1. إعداد شرائح مخططي الحاد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل إعداد شرائح مخططي الحاد ، لا بد من الأوكسجين السائل النخاعي الاصطناعي (ASCF) والبرد مع الثلج لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل استخراج المخ. الحفاظ على الجليد الباردة ACSF والاوكسيجين خلال التشريح. ACSF (مم) : كلوريد الصوديوم 125 ، بوكل 2.5 ، NaHCO 3 26 ، 2 CaCl 2.4 ، 1.3 MgSO4 ، KH 2 PO 4 0.3 ، الجلوكوز 10 ، HEPES 5 ؛ 7،3-7،4 درجة الحموضة ، mOsm 290-295. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع رأس الفأر الذكور دون تخدير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخراج الدماغ كله من الماوس ، وتركيبها على درج vibratome المفروضة على استخدام vibratome Krazy ® الغراء. ويجب أن يتم استخراج خلايا المخ والمتصاعدة داخل 2 دقيقة. خلال هذا الوقت ، تأكد للحفاظ على البرودة والجليد ACSF الاوكسيجين للحفاظ على الأنسجة السليمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الاكليلية شرائح سمك في الدماغ مخططي 250μm bregma بين 1،54-0،62 1. وسيتم الحصول على ثلاث شرائح بأكملها ومن ثم يمكن مقطعة إلى شرائح half 6 مع إبرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان شرائح الدماغ في ACSF الاوكسيجين في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تقل عن 1 ساعة قبل تحميل التحقيق. عرض شرائح جيدة FFN511 التحميل وتظل نشطة لتصوير تصل إلى 4 ساعات بعد إعداد شريحة. </li></ol> 2. تحميل FFN511 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد FFN511 حل التحميل (10μM FFN511 في ACSF) ، وتعد أيضا 100μM ADVASEP - 7 في ACSF. وينبغي إعداد جميع الحلول الطازجة والاوكسيجين على الأقل 15 دقيقة قبل التحميل الى شرائح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان شريحة على حدة مع حل FFN511 التحميل لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم إزالة الصبغة منضمة إلى الأنسجة خارج الخلية التي يحتضنها شريحة تحميلها في الاوكسيجين ACSF ADVASEP - 7 100μM لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة 2. شرائح هي الآن جاهزة للتصوير. </li></ol> 3. التصوير FFN511 في شرائح الدماغ يتم إجراء تصوير FFN511 في شرائح باستخدام مجهر الليزر multiphoton المسح. نحن نستخدم الليزر أولتيما المرج المسح multiphoton المجهر (كنا باستخدام LSM زايس 510 NLO مجهر المسح الضوئي ليزر multiphoton سبق وتم الحصول على بعض النتائج مع المجهر زايس). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع شريحة FFN511 محملة في غرفة التسجيل (RC - 27L ، وارنر) ، وsuperfuse ACSF مع الاوكسيجين في معدل تدفق 1-2 مل في الدقيقة الواحدة. ثم ضع القيثارة البلاتين مع سلاسل من النايلون على أعلى شريحة لتقليل الحركة أثناء التجربة. لمزيد من تقليل الحركة ، والسماح للشريحة لتحقيق الاستقرار في ما لا يقل عن 10 دقيقة في غرفة قبل التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصور وتحديد المخطط الظهري مع التلألؤ مجال مشرق في ظل الهدف الماء الغمر 10X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان وموقف أقطاب القطبين التنغستن الملتوية في هذه المنطقة اذا إجراء تجربة التحفيز. وتقع منطقة التصوير المثالي على مسافة 300 ميكرون في بين اثنين من نصائح القطب القطبين محفزة. وضع هذه المنطقة في وسط الميدان البصري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صورة FFN511 المسمى مخططي المحطات تحت الماء الهدف 63x (0.9 NA) فوق البنفسجية الغمر. هو متحمس FFN511 نانومتر في 760 مع ليزر ماي تاي من الفيزياء ومضان الطيفي الأمثل لمحطات مخططي وينظر من خلال شريط تمرير ترشيح (480-520 نانومتر). يتم التقاط الصور في 12 بت تنسيق مع 75 ميكرون 75 × المناطق ذات الاهتمام في القرار 512 × 512 بكسل. لحفز التجارب destaining ، ويتم الحصول على تعويض عن ض محور التحول ، A - Z سلسلة من الصور 5-7 ، مفصولة 1 ميكرومتر في Z - الطائرة ، لكل فترة زمنية. </li></ol> 4. FFN511 Destaining ويمكن تسمية destained FFN511 إما عن طريق تركيز عال من بوكل (70 نستخدم بوكل مم) ، (+) - المنشطات كبريتات (AMPH ، 20 ميكرون) ، أو التحفيز الكهربائي. في التجربة destaining بوكل ، عندما يتم تطبيق ACSF البوتاسيوم عالية حل لشريحة الدماغ ، وتسمية destains FFN511 داخل 2 دقيقة. سجل XYZ - T الصور إلى المسار FFN511 destaining مع مرور الوقت. فيما يلي وصف لالتحفيز الكهربائية التي تعتمد على محطة destaining الدوبامين : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتعقب FFN511 destaining بمرور الوقت ، يتم تسجيل XYZ - T الصور. وينبغي الحصول على ضمان الحد الأدنى من الحركة من شريحة (أقل من 4 ميكرون في محور ض) وليس photobleaching بواسطة الليزر والصور تحكم سلسلة زمنية من ض المكدس للحصول على ما لا يقل عن 5 دقائق قبل التحفيز. خلاف ذلك ، وضبط قوة الليزر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هذه الصور التالية السيطرة ، ومواصلة التصوير XYZ - T في حين بدء التحفيز على ترددات من 1 أو 4 أو 20 هرتز. يتم تطبيق حوافز هرتز في 1 و 4 أو 20 (300 ميكرو ثانية × 1 مللي أمبير) إلى المخطط محليا عن طريق التحفيز المعزل ISO - فليكس سببها الرئيسي - 8 مولد النبض (AMPI ، القدس ، إسرائيل) باستخدام أقطاب القطبين. للحد منالاختلاف في الاستقطاب من مواقع الإطلاق ، لقد اعتدنا على بروتوكول تحفيز تطبيق 150 ٪ من شدة الإثارة القصوى التي يحددها voltammetry دوري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام البرمجيات المناسبة لتحليل التصوير. في المختبر ، ونحن نستخدم صورة J (وين Rosband والمعاهد الوطنية للصحة ، روكفيل ، دكتوراه في الطب) ، وبرامج مخصصة مكتوب في IDL (بحوث النظم ، بولدر ، كولورادو) لقياس نقاط ومضان والتغييرات مع time3. </li></ol> Represenative النتائج الشكل 1 يبين FFN511 التحميل في شريحة مخططي اكتمال الآن. وتظهر الصور باستخدام ممثل الهدف 60x 10x وفي Fig.1. ويمكن وسم destained الانتقائي لمحطات الدوبامين التي المنشطات ميكرومتر 20. ويبين الشكل 2 destaining FFN511 من العلامات التي بوكل عالية. ويبين الشكل 3 destaining FFN511 من العلامات التي التحفيز الكهربائي المحلي. <img src="/files/ftp_upload/1562/1562fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1 FFN511 تسميات محطات الدوبامين في الجسم المخطط شرائح القشرية ، يعيش الحاد (A) التي وصفها FFN511 الحادة في شريحة القشرية المخططية - العيش :. التوسيم وفرة في المخطط (STR) ، ووضع العلامات تشتت في القشرة (CTX) ، وليس في تسمية الجسم الثفني (CC). شريط الحجم : 100 ميكرون (B) من Destaining FFN511 من المخطط بواسطة المنشطات. لوحات اليسار : قبل المنشطات ؛ لوحات اليمين : بعد 20 دقيقة من المنشطات ميكرومتر 20. شريط الحجم : 10 ميكرون. <img src="/files/ftp_upload/1562/1562fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. Destaining FFN511 من العلامات التي بوكل عالية. هو destained FFN511 العلامات داخل التطبيق 2 دقيقة من بوكل 70 ملم في ACSF. شريط النطاق : 10μm. <img src="/files/ftp_upload/1562/1562fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. الترددات المعتمدة من destaining FFN511 الوسم في المخطط (أ) أدى التحفيز المحلية في 4 هرتز في destaining من المحطات. بدأت في تحفيز ر = 0. مقياس شريط : 5 ميكرون (B) من Destaining FFN511 في 4 هرتز هو كا 2 + -- والتي تعتمد على الترددات. تلقت لا تسيطر التحفيز (153 نقاط وشرائح من 3). Destaining مع كلوريد الكادميوم (200 ميكرومتر) كان مطابقا للضوابط unstimulated (475 نقاط وشرائح من 5). وكانت تناسب منحنيات destaining لكل تردد التحفيز عن طريق الاضمحلال الأسي وظيفة واحدة ونصف الحياة (ر 1 / 2) القيم المحسوبة على النحو τ X 0.693 (1 هرتز : 765 نقاط وشرائح من 9 ، 4 هرتز : 410 نقاط وشرائح من 7 ، 20 هرتز : 416 نقاط وشرائح من 6). يرجى الرجوع إلى الفيديو صورة مجهرية من 2 الفوتون المجهري من خلال FFN511 destaining إيماس في إعداد شريحة الدماغ الجسم المخطط.

<ol>
	<li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The mouse brain in stereotaxi coordinators. , (1997).</li><li>Kay, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+synaptic+activity+in+intact+brain+and+slices+with+FM1-43+in+C.+elegans,+lamprey,+and+rat.">Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1-43 in C. elegans, lamprey, and rat.</a> Neuron. 24, 8098-8117 (1999).</li><li>Bamford, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterosynaptic+dopamine+neurotransmission+selects+sets+of+corticostriatal+terminals.">Heterosynaptic dopamine neurotransmission selects sets of corticostriatal terminals.</a> Neuron. 42, 653-653 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

في هذا الفيديو ، ونحن يبرهن على وجود طريقة لتصور بصريا العصبي باستخدام الدوبامين النظير الفلورسنت. FFN511 هو الجيل الأول من FFNs قمنا بتطويرها. على الرغم من أنه تم تصميمه من خلال استهداف الخلايا العصبية نقل مونوامين الحويصلي (VMAT2) الذي يحمل مونوامين الناقلات العصبية من السيتوبلازم إلى الحويصلات متشابك ، وتسميات محطات تحديدا الدوبامين في المخطط ويفترض الكاتيكولامينات و / أو محطات السيروتونين في القشرة (كما هو موضح في العلوم الورق) ، فترة التحميل المناسبة أمر بالغ الأهمية لخصوصية منذ FFN511 هو مسعور نسبيا. وجدنا أن الحضانة لمدة أطول من 40 دقيقة وسوف يؤدي إلى تلطيخ اللانوعي شرائح واسعة في الجسم المخطط. ويمكن تحديدها بشكل مباشر على خصوصية destaining بواسطة استخدام تركيزات عالية من بوكل ، الذي ينبغي أن يتسبب في انطلاق FFN داخل الحويصلات متشابك وظيفية. وسوف تعرض على شريحة FFN511 لأقل من 15 دقيقة نتيجة في إشارة الفلورسنت ضعيفة نظرا لعدم كفاية تحميل الصبغة في المحطات. في هذا البروتوكول ، ونحن نستخدم 100μM ADVASEP - 7 لإزالة الصبغة منضمة إلى الأنسجة خارج الخلية. هذه الخطوة غير ضرورية ، ولكن إذا تم حذفها ، فشل في ذلك الوقت ACSF يحتاج إلى فترة طويلة. باختصار ، اعتمادا على إعداد اخترت ، وسوف تحتاج إلى تعديل فترة الاعتقال والتحميل لتحديد العلامات الأمثل.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>FFN511 (8-(2-Amino-ethyl)-2,3,5,6-tetrahydro-1H,4H-11-oxa-3a-aza-benzo[de]anthracen-10-one)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dalibor Sames&#x2019;s laboratory at Columbia University</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ADVASEP-7 </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>CyDex, Overland Park, KS</td>
<td>AR-OA7-005</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RC-27L Recording chamber</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Warner Instrument</td>
<td>64-0375</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PELCO PrepEze 6-Well Holder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ted Pella, Inc.</td>
<td>36157-1</td>
<td>For slice incubation</td>
</tr>
<tr>
<td>Master-8 pulse stimulator and Iso- Flex stimulus isolator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AMPI, Jerusalem, Israel</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

dopamine release at individual presynaptic terminals visualized with ffns

الجهاز العصبي بإرسال إشارات بين الخلايا العصبية عن طريق الافراج عن العصبي خلال انصهار حويصلة متشابك. لمراقبة امتصاص الناقل العصبي ، والإفراج عن محطات قبل المشبكي فردية مباشرة ، قمنا بتصميم العصبية كاذبة الفلورسنت بمثابة ركائز للنقل حويصلة متشابك مونوامين. باستخدام هذه التحقيقات إلى الإفراج عن الدوبامين الصورة في المخطط ، قدمنا ​​العديد من الملاحظات ذات الصلة اللدونة متشابك. وجدنا أن نسبة ضئيلة من الحويصلات متشابك الافراج العصبي في التحفيز كانت تعتمد على وتيرة التحفيز. ولم يلاحظ وجود متميزة kinetically &quot;احتياطي&quot; السكان حويصلة متشابك في ظل هذه الظروف التجريبية. وقد كشفت عدم التجانس التي تعتمد على تردد المحطات قبل المشبكي التي كانت تعتمد في جزء منها على مستقبلات الدوبامين D2 ، مشيرا الى آلية لتواتر التي تعتمد على اختيار الترميز قبل المشبكي. ساهم هوي تشانغ ونيكو Gubernator G. بالتساوي على هذا العمل.

Watch this Scientific Journal Video about Dopamine Release at Individual Presynaptic Terminals Visualized with FFNs at JoVE.com

Dopamine Release at Individual Presynaptic Terminals Visualized with FFNs

وسائل جديدة لقياس العصبي الدوبامين بصريا باستخدام النظير الفلورسنت.

متصور النسخة الدوبامين في محطات قبل المشبكي فردية مع FFNs

The nervous system transmits signals between neurons via neurotransmitter release during synaptic vesicle fusion. To observe neurotransmitter uptake and ...

dopamine-release-at-individual-presynaptic-terminals-visualized-with

Research

JoVE Journal

Biology

24.7K Views.  Columbia University. وسائل جديدة لقياس العصبي الدوبامين بصريا باستخدام النظير الفلورسنت.

Video: Dopamine Release at Individual Presynaptic Terminals Visualized with FFNs

Loading Drosophila Nerve Terminals with Calcium Indicators

Calcium plays many roles in the nervous system but none more impressive than as the trigger for neurotransmitter release, and none more profound than as the messenger essential for the synaptic plasticity that supports learning and memory. To further elucidate the molecular underpinnings of Ca2+-dependent synaptic mechanisms, a model system is required that is both genetically malleable and physiologically accessible. Drosophila melanogaster provides such a model. In this system, genetically-encoded fluorescent indicators are available to detect Ca2+ changes in nerve terminals. However, these indicators have limited sensitivity to Ca2+ and often show a non-linear response. Synthetic fluorescent indicators are better suited for measuring the rapid Ca2+ changes associated with nerve activity. Here we demonstrate a technique for loading dextran-conjugated synthetic Ca2+ indicators into live nerve terminals in Drosophila larvae. Particular emphasis is placed on those aspects of the protocol most critical to the technique's success, such as how to avoid static electricity discharges along the isolated nerves, maintaining the health of the preparation during extended loading periods, and ensuring axon survival by providing Ca2+ to promote sealing of severed axon endings. Low affinity dextran-conjugated Ca2+-indicators, such as fluo-4 and rhod, are available which show a high signal-to-noise ratio while minimally disrupting presynaptic Ca2+ dynamics. Dextran-conjugation helps prevent Ca2+ indicators being sequestered into organelles such as mitochondria. The loading technique can be applied equally to larvae, embryos and adults.

Calcium is a ubiquitous messenger in the nervous system, essential for triggering neurotransmitter release and changes in synaptic strength. Here we demonstrate a technique for loading Ca2+-indicators into Drosophila nerve terminals. We also demonstrate fabrication of the required apparatus and emphasize points critical for the technique's success.

محطات التحميل العصب ذبابة الفاكهة مع مؤشرات الكالسيوم

Calcium plays many roles in the nervous system but none more impressive than as the trigger for neurotransmitter release, and none more profound than as ...

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative medicine. A non-invasive method to monitor the transplanted stem cells repeatedly in vivo would greatly enhance our ability to understand the mechanisms that control stem cell death and identify trophic factors and signaling pathways that improve stem cell engraftment. MR imaging has been proven to be an effective tool for the in vivo depiction of stem cells with near microscopic anatomical resolution. In order to detect stem cells with MR, the cells have to be labeled with cell specific MR contrast agents. For this purpose, iron oxide nanoparticles, such as superparamagnetic iron oxide particles (SPIO), are applied, because of their high sensitivity for cell detection and their excellent biocompatibility. SPIO particles are composed of an iron oxide core and a dextran, carboxydextran or starch coat, and function by creating local field inhomogeneities, that cause a decreased signal on T2-weighted MR images. This presentation will demonstrate techniques for labeling of stem cells with clinically applicable MR contrast agents for subsequent non-invasive in vivo tracking of the labeled cells with MR imaging.

For the evaluation of new stem cell therapies it is important to non-invasively track the injected cells in vivo. This video will show you how to label human mesenchymal and embryonic stem cells with iron oxide based contrast agents in vivo for subsequent MR imaging in vivo.

ووضع العلامات hESCs hMSCs مع أوكسيد الحديد النانوية لعدم الغازية في تعقب المجراة مع التصوير بالرنين المغناطيسي

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

وسم الخلايا الجذعية مع الأصباغ نيون للمنظمات غير الغازية مع الكشف عن التصوير الضوئي

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation from systemic input from elsewhere in the brain. In our lab, we use these neurons to assess dopamine release kinetics using carbon fiber amperometry, as well as expression levels of dopamine related genes and proteins using quantitative PCR and immunocytochemistry. In this video, we show you how we generate these cultures from rodent neonates.
The process involves several steps, including the plating of cortical glial astrocytes, the conditioning of neuronal cell culture media by the glial substrate, the dissection of the midbrain in neonates, the digestion, extraction and plating of dopamine neurons and the addition of neurotrophic factors to ensure cell survival.
The applications suitable for such a preparation include electrophysiology, immunocytochemistry, quantitative PCR, video microscopy (i.e., of real-time vesicular fusion with the plasma membrane), cell viability assays and other toxicological screens.

Primary dissociated midbrain dopamine cell cultures allow for the study of presynaptic characteristics of dopamine neurons. They can be used to monitor real-time dopamine release kinetics and protein/mRNA levels of regulators of dopamine exocytosis. Here, we show you how to generate these cultures from rodent neonates.

الدماغ المتوسط ​​الدوبامين الابتدائي الثقافات خلية ينفصل عن الولدان القوارض

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation ...

Murine Model for Parkinson's Disease: from 6-OH Dopamine Lesion to Behavioral Test

Parkinson's disease (PD) affects at least 6.5 million people worldwide, irrespective of gender, social, ethnic, economic, or geographic boundaries. Key symptoms, such as tremor, rigidity and bradikinesia, develop when about 3/4 of dopaminergic cells are lost in the substantia nigra, and fail to provide for the smooth, coordinated regulation of striatal motor circuits. Depression and hallucinations are common, and dementia eventually occurs in 20% of patients. At this time, there is no treatment to delay or stop the progression of PD. Rather, the medications currently available aim more towards the alleviation of these symptoms. New surgical strategies may reversibly switch on the functionally damaged circuits through the electrical stimulation of deep brain structures, but although deep brain stimulation is a major advance, it is not suitable for all patients. It remains therefore necessary to test new cell therapy approaches in preclinical models.
Selective neurotoxic disruption of dopaminergic pathways can be reproduced by injection of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) or MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tertahydropyridine) whereas depleting drugs and oxidative-damaging chemicals may also reproduce specific features of PD in rodents. Unlike MPTP, 6-OHDA lesions cause massive irreversible neuronal loss, and can be uni- or bilateral. The 6-OHDA lesion model is reliable, leads to robust motor deficits, and is the most widely used after 40 years of research in rats1. As interactions between grafted cells and host can now be studied more thoroughly in mice rather than in rats, the model has been transposed to mice2,3, where it has been recently characterized4.
In this video, we demonstrate how to lesion the left nigro-striatal pathway of anesthetized mice by slowly delivering 2.0 &mu;L of 6-OHDA through a stereotaxically inserted micro-syringe needle. The loss of dopaminergic input occurs within days, and the functional impairments can be monitored over post-operative weeks and months by rating animal rotations induced by dopaminergic agents5. Here, we show full-body contralateral rotations occurring 10 minutes after a single subcutaneous administration of apomorphine, measured one month after the lesion. Outcomes and drawbacks are discussed below.

Murine Model for Parkinson&#039;s Disease: from 6-OH Dopamine Lesion to Behavioral Test

Parkinson disease is caused by loss of dopaminergic innervation to the striatum, which can be experimentally induced by 6-OH-dopamine. We describe how to perform a stereotaxic lesion and to monitor apomorphine-induced rotational behavior in mice. This model is useful and reliable for testing new therapies for Parkinson disease.

فأري النموذجي لمرض باركنسون : من آفة الدوبامين 6 - OH إلى اختبار السلوكية

Parkinson's disease (PD) affects at least 6.5 million people worldwide, irrespective of gender, social, ethnic, economic, or geographic boundaries. Key ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves application of short high-voltage electric pulses to cells that are in close contact. Application of short, high-voltage electric pulses causes destabilization of cell plasma membranes. Destabilized membranes are more permeable for different molecules and also prone to fusion with any neighboring destabilized membranes. Electrofusion is thus a convenient method to achieve a non-specific fusion of very different cells in vitro. In order to obtain fusion, cell membranes, destabilized by electric field, must be in a close contact to allow merging of their lipid bilayers and consequently their cytoplasm. In this video, we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method. In this method, cells are allowed to attach only slightly to the surface of the well, so that medium can be exchanged and cells still preserve their spherical shape. Fusion visualization is assessed by pre-labeling of the cytoplasm of cells with different fluorescent cell tracker dyes; half of the cells are labeled with orange CMRA and the other half with green CMFDA. Fusion yield is determined as the number of dually fluorescent cells divided with the number of all cells multiplied by two.

In this video we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method using electroporation and the subsequent detection of fused cells visualization with fluorescence microscopy.

متصور الكهربائي زنزانة مع مضان المجهري

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

The unique composition and spatial arrangement of RNA-binding proteins (RBPs) on a transcript guide the diverse aspects of post-transcriptional regulation1. Therefore, an essential step towards understanding transcript regulation at the molecular level is to gain positional information on the binding sites of RBPs2.
Protein-RNA interactions can be studied using biochemical methods, but these approaches do not address RNA binding in its native cellular context. Initial attempts to study protein-RNA complexes in their cellular environment employed affinity purification or immunoprecipitation combined with differential display or microarray analysis (RIP-CHIP)3-5. These approaches were prone to identifying indirect or non-physiological interactions6. In order to increase the specificity and positional resolution, a strategy referred to as CLIP (UV cross-linking and immunoprecipitation) was introduced7,8. CLIP combines UV cross-linking of proteins and RNA molecules with rigorous purification schemes including denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. In combination with high-throughput sequencing technologies, CLIP has proven as a powerful tool to study protein-RNA interactions on a genome-wide scale (referred to as HITS-CLIP or CLIP-seq)9,10. Recently, PAR-CLIP was introduced that uses photoreactive ribonucleoside analogs for cross-linking11,12.
Despite the high specificity of the obtained data, CLIP experiments often generate cDNA libraries of limited sequence complexity. This is partly due to the restricted amount of co-purified RNA and the two inefficient RNA ligation reactions required for library preparation. In addition, primer extension assays indicated that many cDNAs truncate prematurely at the crosslinked nucleotide13. Such truncated cDNAs are lost during the standard CLIP library preparation protocol. We recently developed iCLIP (individual-nucleotide resolution CLIP), which captures the truncated cDNAs by replacing one of the inefficient intermolecular RNA ligation steps with a more efficient intramolecular cDNA circularization (Figure 1)14. Importantly, sequencing the truncated cDNAs provides insights into the position of the cross-link site at nucleotide resolution. We successfully applied iCLIP to study hnRNP C particle organization on a genome-wide scale and assess its role in splicing regulation14.

The spatial arrangement of RNA-binding proteins on a transcript is a key determinant of post-transcriptional regulation. Therefore, we developed individual-nucleotide resolution UV crosslinking and immunoprecipitation (iCLIP) that allows precise genome-wide mapping of the binding sites of an RNA-binding protein.

iCLIP -- Transcriptome على صعيد رسم الخرائط من البروتين RNA التفاعلات مع القرار الفردي النكليوتيد

The unique composition and spatial arrangement of RNA-binding proteins (RBPs) on a transcript guide the diverse aspects of post-transcriptional ...

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, cell differentiation and organogenesis 1. Correct preparation of the experimental samples is a crucial, often neglected, step. The goal of preparation is to ensure physiological relevance and to establish optimal imaging conditions. To maintain tissue viability, it is critical to avoid dehydration, hypoxia, overheating or medium deterioration 2. 
 The Drosophila egg chamber is a well established system for examining questions relating, but not limited, to body patterning, mRNA localization and cytoskeletal organization 3,4. For early- and mid-stage egg chambers, mounting in halocarbon oil is good for survival in that it allows free diffusion of oxygen, prevents dehydration and hypoxia and has superb optical properties for microscopy. Imaging of fluorescent proteins is possible through the introduction of transgenes into the egg chamber or physical injection of labeled RNA, protein or antibodies 5-7. For example, addition of MS2 constructs to the genome of animals enables real time observation of mRNAs in the oocyte 8. These constructs allow for in vivo labeling of mRNA through utilization of the MS2 bacteriophage RNA stem loop interaction with its coat protein 9. 
 Here, we present a protocol for the extraction of ovaries as well as isolating individual ovarioles and egg chambers from the female Drosophila. For a detailed description of Drosophila oogenesis see Allan C. Spradling (1993, reprinted 2009) 10.

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

The Drosophila egg chamber is an excellent model for studying the mechanisms of mRNA localization. In order to capture the dynamic events that underpin the processes of localization, rapid high resolution imaging of live tissue is required. Here, we present a protocol for dissection and imaging of live samples with minimal disruption.

إعداد فردية ذبابة الفاكهة البيض غرف للتصوير لايف

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

البروتين البروتين التفاعلات تصور من قبل ثنائي الجزيء الإسفار التكملة في Protoplasts التبغ وأوراق

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in the x-y plane. Here a summary of the FIONA technique is reported and examples of research that have been performed using FIONA are briefly described. First, how to set up the required equipment for FIONA experiments, i.e., a total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), with details on aligning the optics, is described. Then how to carry out a simple FIONA experiment on localizing immobilized Cy3-DNA single molecules using appropriate protocols, followed by the use of FIONA to measure the 36 nm step size of a single truncated myosin Va motor labeled with a quantum dot, is illustrated. Lastly, recent effort to extend the application of FIONA to thick samples is reported. It is shown that, using a water immersion objective and quantum dots soaked deep in sol-gels and rabbit eye corneas (&#62;200 &#181;m), localization precision of 2-3 nm can be achieved.

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Single fluorophores can be localized with nanometer precision using FIONA. Here a summary of the FIONA technique is reported, and how to carry out FIONA experiments is described.

التصوير مضان مع نانومتر دقة واحدة (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...