D. Sames graças A Harold G. &amp; Leila Y. Mathers Fundação de Caridade e Iniciativas da Universidade de Columbia em Ciência e Engenharia. D. Sames e D. Sulzer agradecer à Fundação McKnight para as inovações tecnológicas em McKnight Prêmio Neuroscience D. Sulzer graças NIDA, NIMH, e os Picower e Fundações da doença de Parkinson. Graças H. Zhang NARSAD. RH Edwards graças a Michael J. Fox Foundation, a National Parkinson Foundation, NIDA e NIMH. Agradecemos a Robert Burke por 6-OHDA injeções e conselho, Mark Sonders para discussão útil, Merek Siu para imagens de análise, programação e Schmoranzer Jan de apoio técnico com a configuração de microscopia TIRF.

Este método foi utilizado na pesquisa, publicada na <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/full/324/5933/1441">Gubernator et al. Ciência 324 (5933). 1441-1444 (2009)</a> . 1. Preparando aguda fatias estriatais <ol><li> Antes de preparar fatias estriatal aguda, deve-se oxigenar o líquido cefalorraquidiano artificial (ASCF) e chill-lo com gelo por pelo menos 15 minutos antes da extração de cérebro. Manter o frio do gelo ACSF e oxigenado durante a dissecção. ACSF (em mM): NaCl 125, KCl 2.5, NaHCO 3 26, CaCl 2 2,4, MgSO4 1,3, KH 2 PO 4 0,3, glicose 10, HEPES 5; pH 7,3-7,4, 290-295 mOsm. </li><li> Decapitar rato macho sem anestesia. </li><li> Extrair todo o cérebro do rato, e montá-la na bandeja vibratome colocados no vibratome usando Krazy Glue ®. Extração de cérebro e de montagem deve ser feita dentro de 2 minutos. Durante este tempo, certifique-se para manter o frio do gelo ACSF e oxigenado para manter os tecidos saudáveis. </li><li> Corte coronal fatias do cérebro estriado na espessura 250μm bregma entre 1,54-0,62 1. Três fatias inteiras serão obtidos que podem então ser cortada em 6 fatias meia com uma agulha. </li><li> Incubar as fatias de cérebro em ACSF oxigenada em temperatura ambiente por pelo menos 1 hora antes de carregá-sonda. Fatias de mostrar o carregamento FFN511 bom e permanecer ativo para geração de imagens de até 4 horas após a preparação fatia. </li></ol> 2. Carregando FFN511 <ol><li> Prepare FFN511 solução de carga (10μM FFN511 em ACSF); também preparar 100μM ADVASEP-7 em ACSF. Todas as soluções devem ser preparadas de fresco e oxigenado pelo menos 15 minutos antes do embarque para as fatias. </li><li> Individualmente incubar fatia com FFN511 solução de carga por 30 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Em seguida, retire o corante ligado ao tecido extracelular incubando a fatia carregada em oxigenado 100μM ADVASEP-7 ACSF por 30 minutos em temperatura ambiente 2. Fatias estão agora prontos para a imagem latente. </li></ol> 3. Imagem FFN511 no fatias de cérebro Imagem de FFN511 nos cortes é realizada utilizando multifotônica microscópio de varredura a laser. Estamos usando um Prairie Ultima multifotônica microscópio de varredura por laser (Estávamos usando uma Zeiss LSM 510 NLO multifotônica microscópio de varredura a laser antes e alguns resultados foram obtidos com o microscópio Zeiss). <ol><li> Coloque a fatia FFN511-carregado na câmara de gravação (RC-27L, Warner) e superfuse com ACSF oxigenado a um fluxo de 1-2 ml por minuto. Em seguida, coloque uma harpa de platina com cordas de nylon em cima da fatia para minimizar o movimento durante o experimento. Para minimizar ainda mais o movimento, permitir que a fatia para estabilizar por pelo menos 10 minutos na câmara antes da imagem. </li><li> Visualizar e localizar o striatum dorsal, com luminescência campo brilhante sob a objetiva de 10x imersão em água. </li><li> Lugar e posição do bipolar torcida eléctrodos de tungsténio na região se realizar um experimento de estimulação. A área de imagem ideal está localizado dentro de 300 mm entre as duas pontas do eléctrodo bipolar estimulante. Coloque esta região no centro do campo visual. </li><li> Imagem FFN511 marcado terminais estriatal em um (0,9 NA) O objectivo da água por ultravioleta 63x de imersão. FFN511 está animado com 760 nm com um laser de Mai Tai Física Spectral e fluorescência ideal de terminais estriatal é visto através de um filtro passa-banda (480-520 nm). As imagens são capturadas no formato de 12-bit com 75 x 75 mM regiões de interesse em 512 pixels de resolução x 512. Estimulado para experimentos de descoloração, para compensar a mudança do eixo z, z uma série de imagens 07/05, separados por 1 mícron no plano z, é obtido para cada período de tempo. </li></ol> 4. FFN511 Descoloração A etiqueta pode ser descorados FFN511 quer por alta concentração de KCl (70 mM usamos KCl), (+)-anfetamina sulfato (AMPH, 20 mM), ou estimulação elétrica. No experimento de descoloração KCl, quando uma solução ACSF alta de potássio é aplicado à fatia do cérebro, o FFN511 destains label dentro de 2 minutos. Registro xyz-t imagens para acompanhar FFN511 descoloração ao longo do tempo. A seguir descreve estimulação elétrica dependente de descoloração terminal dopamina: <ol><li> Para acompanhar FFN511 descoloração ao longo do tempo, xyz-t as imagens são gravadas. Para garantir movimento mínimo da fatia (menos do que 4 mm no eixo z) e não fotobranqueamento pelo laser, controle de imagens de séries temporais do z-stack deve ser obtido por pelo menos 5 minutos antes da estimulação. Caso contrário, ajustar a potência do laser. </li><li> Após essas imagens de controle, continuam a imagem xyz-t, enquanto começam a estimulação nas freqüências de 1, 4 ou 20 Hz. Estímulos em 1, 4 ou 20 Hz (300 mS x 1 mA) são aplicados para o estriado localmente por um isolador de estímulo Iso-Flex acionada por um gerador de Mestre-8 de pulso (Ampi, Jerusalém, Israel) através de eletrodos bipolares. Para minimizara variação da despolarização dos locais de lançamento, temos usado um protocolo de estimulação aplicando 150% da intensidade de estimulação máxima determinada por voltametria cíclica. </li><li> Usar o software adequado para análise de imagem. Em nosso laboratório, usamos Image J (Wayne Rosband, National Institutes of Health, Rockville, MD) e custom-written software em IDL (Research Systems, Boulder, CO) para quantificar a fluorescência puncta e as mudanças com Time3. </li></ol> Resultados Represenative A Figura 1 mostra o carregamento na FFN511 fatia estriatal está concluída. Imagens representativas utilizando objetiva de 10x e 60x são mostrados na Fig.1. A rotulagem seletiva de terminais de dopamina pode ser descorados por 20 mM de anfetamina. A Figura 2 mostra de descoloração de rotulagem FFN511 por KCl elevado. A Figura 3 mostra descoloração de rotulagem FFN511 por estimulação elétrica local. <img src="/files/ftp_upload/1562/1562fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1 FFN511 rótulos terminais de dopamina no estriato-cortical viver fatias aguda (A) de rotulagem, pela FFN511 em aguda córtico-estriatal fatia ao vivo:.. Rotulagem abundante no corpo estriado (STR), rotulagem esparsa no córtex (CTX), e sem rótulo no corpo caloso (CC). Barra de escala:. 100 mm (B) Descoloração de FFN511 do striatum por anfetamina. Painéis da esquerda: antes de anfetaminas; painéis direita: após 20 minutos de 20 de anfetamina mM. Barra de escala: 10 mM. <img src="/files/ftp_upload/1562/1562fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Descoloração de FFN511 rotulagem por KCl elevado. Rotulagem FFN511 é descorados dentro de 2 min de aplicação de 70 mM KCl em ACSF. Barra de escala: 10μm. <img src="/files/ftp_upload/1562/1562fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Dependente da freqüência de descoloração de rotulagem em FFN511 striatum. (A) estimulação local em 4 Hz resultou na descoloração dos terminais. Estimulação começou em t = 0. Barra de escala: 5 mm (B) Descoloração de FFN511 a 4 Hz é Ca 2 + - e dependente da freqüência.. Controles não receberam estimulação (153 puncta de 3 fatias). Descoloração com cloreto de cádmio (200 mM) foi idêntico aos controles não estimuladas (475 puncta de 5 fatias). As curvas de descoloração para cada freqüência de estimulação foram ajustados por uma função de decaimento exponencial simples e meia-vida (t 1 / 2) valores calculados como τ x 0,693 (1 Hz: 765 puncta de 9 fatias, 4 Hz: 410 puncta de 7 fatias, 20 Hz: 416 puncta de 6 fatias). Consulte a micrografia de vídeo de dois fótons de microscopia de FFN511 descoloração durante exocitose numa preparação estriado cerebral fatia.

<ol>
	<li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The mouse brain in stereotaxi coordinators. , (1997).</li><li>Kay, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+synaptic+activity+in+intact+brain+and+slices+with+FM1-43+in+C.+elegans,+lamprey,+and+rat.">Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1-43 in C. elegans, lamprey, and rat.</a> Neuron. 24, 8098-8117 (1999).</li><li>Bamford, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterosynaptic+dopamine+neurotransmission+selects+sets+of+corticostriatal+terminals.">Heterosynaptic dopamine neurotransmission selects sets of corticostriatal terminals.</a> Neuron. 42, 653-653 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Neste vídeo, demonstramos um método de visualizar usando análogos opticamente neurotransmissão da dopamina fluorescente. FFN511 é a primeira geração de FFNs temos desenvolvido. Embora tenha sido projetado visando o transportador vesicular neuronal monoamina (VMAT2), que transporta neurotransmissores monoamina do citoplasma em vesículas sinápticas e, especificamente, etiquetas terminais de dopamina no estriado e catecolaminas presumido e / ou terminais de serotonina no córtex (como mostrado na Ciência papel), um período de carga adequado é fundamental para a especificidade desde FFN511 é relativamente hidrofóbica. Descobrimos que a incubação por mais de 40 minutos irá resultar em coloração inespecífica extensa em fatias estriatais. A especificidade pode ser diretamente determinada pela descoloração usando uma alta concentração de KCl, o que deve provocar a libertação de FFN funcional dentro de vesículas sinápticas. Exposição da fatia para FFN511 para menos de 15 minutos irá resultar em sinal fluorescente fraco devido à carga insuficiente do corante nos terminais. Neste protocolo, usamos 100μM ADVASEP-7 para remover o corante ligado ao tecido extracelular. Este passo não é necessário, mas se ele for omitido, o tempo de washout em ACSF precisa ser prolongada. Em resumo, dependendo da preparação que você escolheu, você precisará modificar o período de concentração e de carga para determinar rotulagem ideal.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>FFN511 (8-(2-Amino-ethyl)-2,3,5,6-tetrahydro-1H,4H-11-oxa-3a-aza-benzo[de]anthracen-10-one)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dalibor Sames&#x2019;s laboratory at Columbia University</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ADVASEP-7 </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>CyDex, Overland Park, KS</td>
<td>AR-OA7-005</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RC-27L Recording chamber</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Warner Instrument</td>
<td>64-0375</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PELCO PrepEze 6-Well Holder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ted Pella, Inc.</td>
<td>36157-1</td>
<td>For slice incubation</td>
</tr>
<tr>
<td>Master-8 pulse stimulator and Iso- Flex stimulus isolator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AMPI, Jerusalem, Israel</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

dopamine release at individual presynaptic terminals visualized with ffns

O sistema nervoso transmite sinais entre neurônios através de liberação de neurotransmissores durante a fusão das vesículas sinápticas. Para observar a absorção e liberação de neurotransmissores a partir de terminais pré-sinápticos individuais diretamente, nós projetamos fluorescentes neurotransmissores falsa como substratos para o transportador das vesículas sinápticas monoamina. Usando estas sondas para liberar imagem de dopamina no estriado, fizemos várias observações pertinentes a plasticidade sináptica. Descobrimos que a fração de vesículas sinápticas liberando o neurotransmissor por estímulo foi dependente da freqüência de estímulo. A cineticamente distintas &quot;reserva&quot; da população das vesículas sinápticas não foi observada nessas condições experimentais. A heterogeneidade dependente da freqüência de terminais pré-sinápticos foi revelado que era dependente, em parte, os receptores de dopamina D2, indicando um mecanismo para dependente da freqüência de codificação da seleção pré-sináptica. Hui Zhang e Niko Gubernator G. contribuíram igualmente para este trabalho.

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Dopamine Release at Individual Presynaptic Terminals Visualized with FFNs

Um novo meio de medir a neurotransmissão opticamente usando análogos de dopamina fluorescente.

Liberação de dopamina no Individual Terminais Pré-Sinápticas visualizado com FFNs

The nervous system transmits signals between neurons via neurotransmitter release during synaptic vesicle fusion. To observe neurotransmitter uptake and ...

dopamine-release-at-individual-presynaptic-terminals-visualized-with

Research

JoVE Journal

Biology

24.6K visualizações.  Columbia University. Um novo meio de medir a neurotransmissão opticamente usando análogos de dopamina fluorescente.