يتضمن هذا البروتوكول نهجا مباشرا لتبسيط خطوات الاستزراع ، والحصول على نباتات عالية الجودة وسيساهم في استكشاف وكشف النقاب عن الآليات الجزيئية لخلايا القوقعة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي الحد الأدنى من التعامل المباشر مع الأعضاء من خلال تنسيق خطوات التشريح ، وطلاء سطح البوليمر المناسب ، والحجم المتوسط الأمثل ، ووقت التعلق بالنباتات. تمثل هذه التقنية نهجا شائعا في المختبر لدراسة فقدان السمع الحسي العصبي.
يمكن استخدام هذا لإنشاء نماذج سامة للأذن ، وإجراء التحليل الهيكلي ، وتقييم مسارات الإشارات ، وإجراء دراسات فحص الأدوية. من حيث المبدأ ، يمكن أن تنطبق هذه الطريقة على الأنسجة المختلفة. يمكن استخدامه أيضا في أبحاث الأذن الداخلية لاكتساب نظرة ثاقبة لمراحل النمو الجنينية.
للبدء ، ضع رأس الجرذ مقطوع الرأس على الوسادة المعقمة. استخدم المقص والملقط لإزالة الفك السفلي ، ثم ارفع الجلد وقشره مرة أخرى من الجمجمة. ضع الملقط في التجاويف المدارية لتثبيت الجمجمة.
باستخدام شفرة مشرط حادة ، قم بقطع الجمجمة بعناية على طول الخيط السهمي ثم منطقة الخياطة الإكليلية دون إتلاف القوقعة. الآن ، قم بإزالة الدماغ من نصفي الجمجمة. تحت المجهر ، قم بتوطين القوقعة في العظم الصدغي ، وقم بفك الأنسجة المحيطة بين القوقعة والعظم الصدغي.
ثم ضع الملقط في القناة نصف الدائرية العلوية. اسحب العظم الصدغي برفق بعيدا عن قوقعة الأذن وأمسك القوقعة المتصلة بالدهليز بالعظم الصدغي. أدخل أطراف الملقط في منطقة القمة التي يمكن رؤيتها كخط أبيض ، وقم بإزالة كبسولة القوقعة الغضروفية قطعة قطعة لكشف قناة القوقعة.
ضع الملقط تحت القوقعة ، وافصلها عن العضو الدهليزي والعظم الصدغي. انقل القوقعة إلى طبق جديد بحجم 60 ملم يحتوي على برنامج تلفزيوني مثلج. لعزل أعضاء كورتي المزروعة ، أمسك العضو في القاعدة وقناة القوقعة في منطقة الخطاف القاعدي ، وقم بفك قناة القوقعة برفق من modiolus دون تمزيقها.
ثم أمسك قناة القوقعة عند القاعدة واسحب الرباط الحلزوني والأوعية الدموية السطورية. لعزل نباتات القوقعة الصناعية ، استخدم ملقط لفصل العقدة الحلزونية عن الصفيحة الحلزونية العظمية ، وفك الموديولوس أثناء الانفصال. باستخدام الملقط ، أمسك منطقة الخطاف وأزل الرباط الحلزوني باستخدام الأوعية الدموية السطورية.
علاوة على ذلك ، اسحب غشاء رايسنر قطعة قطعة. لنقل نباتات القوقعة ، اغمس ملعقة مختبر في الطبق الذي يحتوي على الزرع. ارفع الزرع مع توجيه خلايا الشعر لأعلى مع بضعة ميكرولترات من برنامج تلفزيوني عن طريق التلويح بملعقة.
ضع الزرع في شريحة من ثماني حفر عن طريق التلويح بالملعقة برفق في المنتصف. اسمح للزرع بالانزلاق إلى الغرفة. باستخدام ماصة سعة 100 ميكرولتر ، قم بإزالة 80 ميكرولترا من الوسط وتخلص منه.
تحقق من رؤية خلايا الشعر والخلايا العصبية العقدية الحلزونية تحت المجهر. إذا لزم الأمر ، استخدم ملقط لدفع الأنسجة المتداخلة بعيدا. قم بإزالة الوسط المتبقي من البئر.
سوف تقع المزرعة الآن بشكل مسطح على سطح الغرفة. بعد 10 ثوان ، تقوم الماصة بإرجاع قطرة أو قطرتين من الوسط بجوار النبات مباشرة ، والوسط المتبقي على بعد مسافة لتجنب انفصال الزرع. تأكد من أن النباتات الخارجية لا تتحرك أثناء إضافة الوسيط.
احتضان الغرفة لمدة ساعتين لربط الأعضاء بإحكام بقاع الغرفة. بعد الحضانة ، نضح الوسط. وباستخدام ماصة 100 أو 200 ميكرولتر ، أضف بعناية 300 ميكرولتر من الوسط الكامل الطازج الذي تم تسخينه مسبقا.
أظهرت الصور المجهرية متحدة البؤر للقرص الدوار أن الفئران Organ of Corti explants حافظت على هيكلها وطولها الإجمالي في ظل الظروف العادية والمجهدة. بالإضافة إلى ذلك ، أظهر المجهر البؤري الماسح وجود خلايا شعرية باقية من النباتات من أعضاء الفئران جنبا إلى جنب مع خلايا الشعر التي تخضع لموت الخلايا المبرمج. مكن البروتوكول من مراقبة المعالجات البيولوجية في خلايا القوقعة الحية باستخدام مجسات مناسبة منفذة للخلايا ومجهر متحد البؤر للقرص الدوار.
تعزز زراعة هذه النباتات القوقعة تحليل التفاعل بين خلايا الشعر وخلايا العقدة الحلزونية. تم الكشف عن خلايا الشعر في غرسات القوقعة الصناعية باستخدام علامة خلايا الشعر ، MYO7A. وبالمثل ، تم تحديد أجسام الخلايا العقدية الحلزونية السليمة والتالفة والخلايا العصبية باستخدام العلامة العصبية ، Tuj 1.
في النظرة العامة المكبرة ، كانت أجسام خلايا الخلايا الموسومة بالجسم المضاد MYO7A مرئية. تم التعرف على الأهداب المجسمة لخلايا الشعر الخارجية ، والصور غير المعقدة للأهداب الفراغية لخلايا الشعر الداخلية الفردية الموسومة بالقضيب. يجب توخي الحذر أثناء الإجراءات تحت المجهر ، خاصة عند فصل العقدة الحلزونية عن الصفيحة الحلزونية العظمية.
يجب نقل النباتات السليمة ومواءمتها بعناية. قام هذا البروتوكول بتحسين الدراسات في المختبر على نباتات الأذن الداخلية. يمكن أن توجه نتائج هذه الدراسات ، مثل مسارات الإشارات وسمية الدواء ، تصميم دراسات أبعد في الجسم الحي.
