تهتم مجموعتي بالآليات التي تنظم التعبير الجيني في الخلايا السلفية العصبية للقشرة المخية الحديثة النامية. وعلى وجه الخصوص ، نحن نركز على الآليات اللاجينية هذه مهمة لإمكانات الخلايا السلفية العصبية للتكاثر والتمايز ، وبالتالي لنمو الدماغ ووظيفته بشكل صحيح.
العضيات القشرية هي نماذج جديدة ومثيرة تسمح لنا بدراسة تطور الدماغ البشري. كما أنها تسمح لنا بنمذجة تطور أنواع الرئيسيات الأخرى. في هذا البروتوكول ، نصف التثقيب الكهربائي للعضيات القشرية البشرية لدراسة وظيفة الجينات.
يتم تقطيع العضيات مع الاهتزاز ، مما يجعلها متاحة بشكل خاص للحقن والتثقيب الكهربائي. يمثل التثقيب الكهربائي للعضيات القشرية البشرية تقنية قوية لدراسة وظيفة الجينات. لقد استخدمنا الطريقة لدراسة عامل النمو السريع للرئيسيات EPIREGULIN ، والذي يتورط في نمو الدماغ وتطوره.
استخدمنا أيضا الطريقة لدراسة نشاط مناطق المحسنة من أنواع مختلفة من الرئيسيات. للبدء ، قم بتضمين العضيات القشرية البشرية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان في 3٪ من agarose نقطة انصهار منخفضة. قم بتقطيع العضيات على الاهتزاز إلى أقسام بسمك 500 ميكرومتر.
بعد التقطيع ، استمر في زراعة العضيات في صفيحة تعلق منخفضة للغاية مكونة من ستة آبار تحتوي على أربعة متوسطات دماغية ثلاثة على شاكر مداري عند 120 دورة في الدقيقة. بعد ذلك ، اضبط مجتذب الشعيرات الدموية الدقيقة على الإعدادات المحددة لسحب الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات للحقن. بعد السحب ، قم بتخزين الشعيرات الدموية في طبق بتري كبير وقم بتثبيتها بشريط لاصق.
في يوم التثقيب الكهربائي ، قم بتسخين محلول Tyrode مسبقا إلى 37 درجة مئوية وقم بإعداد CRISPR Cas9 RNP بتركيز نهائي يبلغ 24 ميكرومولار. أضف بلازميد pCAG-GFP ومحلول Fast Green 0.1٪ في الماء إلى مزيج الحقن النهائي. حدد العضيات القشرية البشرية ذات الهياكل الشبيهة بالبطين المتطورة وتخلص من العضيات التي تفتقر إلى هذه الهياكل.
انقل ما يصل إلى 10 عضويات إلى طبق بتري بحجم 6 سم يحتوي على محلول Tyrode. باستخدام طرف ماصة اللودر الدقيق، املأ الشعيرات الدموية الدقيقة الزجاجية ب 10 ميكرولتر من محلول الحقن. افتح الشعيرات الدموية عن طريق الضغط على الطرف الرفيع بالملاقط.
تحقق مما إذا كانت الشعيرات الدموية مفتوحة عن طريق إطلاق بعض مزيج الحقن في محلول Tyrode. أدخل الشعيرات الدموية في وسط الهياكل الشبيهة بالبطين ، واضغط على مفتاح القدم الخاص بالحاقن الدقيق لحقن 0.2-0.5 ميكرولتر من المزيج. استخدم ملقطا دقيقا لدفع العضوي لتقييد حركته دون الإمساك به.
بعد الحقن، باستخدام طرف ماصة عريض التجويف، انقل واحدا إلى اثنين من العضيات المحقونة إلى غرفة التثقيب الكهربائي التي تحتوي على محلول Tyrode. قم بتوجيه العضيات المحقونة نحو الأقطاب الكهربائية ، مع التأكد من أن الخلايا الدبقية القمية الشعاعية والمناطق الشبيهة بالبطين تواجه الخارج. قم بتوصيل الكابلات بغرفة التثقيب الكهربائي بحيث يكون الجانب المحقون من العضو العضوي مواجها للقطب الموجب.
اضغط على زر النبض الموجود على المثقب الكهربائي لتوصيل خمس نبضات بجهد 38 فولت لمدة 50 مللي ثانية لكل منها على فترات ثانية واحدة. بعد التثقيب الكهربائي ، أعد العضيات القشرية البشرية إلى الدماغ الأربعة المتوسطة الثلاثة ، وزرعها دون اهتزاز لمدة 24 ساعة. بعد التثبيت والتقطيع بالتبريد للعضيات القشرية البشرية المثقلة بالكهرباء ، قم بإجراء استرجاع المستضد في مخزن السترات لمدة ساعة واحدة عند 70 درجة مئوية في حمام مائي للتحليل الكيميائي المناعي.
اغسل الأقسام مرة واحدة في PBS لمدة خمس دقائق. ثم جفف الشرائح لفترة وجيزة واستخدم قلم شمع لوضع دائرة حول الأقسام. قم بإخماد الأقسام باستخدام 0.1 مولار جلايسين في PBS لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
ثم اغسل الأقسام مرتين باستخدام PBS لمدة خمس دقائق لكل منهما. أضف المخزن المؤقت المانع على الأقسام واحتضنه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم احتضان القسم في الأجسام المضادة الأولية طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
في اليوم التالي ، اغسل الأقسام ثلاث مرات باستخدام PBS لمدة خمس دقائق لكل منها. احتضان الأقسام بالأجسام المضادة الثانوية و DAPI في مخزن مؤقت مانع لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد غسل القسم باستخدام PBS ، قم بتركيب الشريحة بوسيط التثبيت وقم بتصوير الأقسام باستخدام مجهر الفلورسنت.
كشفت الكيمياء المناعية للعضيات الكهربائية عن بطينات مستهدفة متعددة داخل عضوية قشرية كهربائية مع ثقب كهربائي مثالي يستهدف الهياكل الشبيهة بالبطين الموجودة في المناطق الخارجية من العضوية. يعد استكشاف الأخطاء وإصلاحها ضروريا إذا لوحظ موت الخلايا المفرط. قد يكون سبب ذلك تركيزات البلازميد العالية أو إعدادات التثقيب الكهربائي دون المستوى الأمثل.
غالبا ما يكون تفسير التثقيب الكهربائي الذي يواجه الجزء الداخلي من العضوية أكثر صعوبة بسبب اندماج المناطق الشبيهة بالصفيحة القشرية مع البطينين المجاورين. قد يحدث اضطراب في السطح القمي عند استخدام حجم الحقن المفرط أو النبضات الكهربائية القوية ، مما يؤدي إلى تمزق البطين وتفريغ الخلايا. تم تأكيد خروج المغلوب من بروتين PCGF4 المركب القمعي Polycomb 1 بواسطة الكيمياء المناعية ، مما أظهر انخفاض شدة الإشارة في الخلايا الإيجابية GFP.
كشف تحليل شدة الإشارة للخلايا الإيجابية ل GFP عن انخفاض كبير في مستويات بروتين PCGF4 في عينات خروج المغلوب مقارنة بالضوابط.
