الكتاب نشكر الاستاذ. كيارا كامبانيلا وعمرة مركز الاختصاص ، جامعة نابولي فيدريكو الثاني ، نابولي ، ايطاليا ، لتزويدهم استخدام microdissector الليزر ، والسيد فينتشنزو Vicidomini للحصول على مساعدة سخية في الرسوم المتحركة 3D.

الجزء 1. إعداد أقراص جناح ذبابة الفاكهة خضعت لتخيلي رني محددة والمترجمة. والمواد البيولوجية ، استخدمنا أقراص الجناح تخيلي ذبابة الفاكهة التي تم الحصول عليها من يرقات وراثيا تخضع لإسكات جينات معينة والمترجمة عن طريق نظام GAL4/UAS 1. هذا النسل اليرقات orginates من كرة عرضية الوراثية التي تنطوي على خطين الوالدين : واحد يحمل السائق GAL4 ، والثانية في الرد UAS. بالإضافة إلى التعبير عن GAL4 في نمط زمنية محددة و / أو المكاني ، والخط سائق يحمل مراسل UAS - GFP التي تسمح لتصور المجال GAL4 التعبير. سطر المستجيب UAS يعرب تحت سيطرة تسلسل UAS ، وهو منعطف حاد إسكات الحمض النووي الريبي (hpRNA) قادرة على استهداف الجين على وجه التحديد مختارة من الفائدة (الذي يطلق عليه جين X) 2. وأعرب مرة واحدة في الخلية ، هو المشقوق العاشر hpRNA لتوليد الحمض النووي الريبي التدخل الصغيرة (سيرنا) قادرا على الصمت تحديدا الجين المحدد. في ذرية اليرقات ، التي تحمل كلا من السائق والمستجيب الجينات المحورة ، يتم نسخها فقط بناء UAS - إسكات تلك الخلايا في التعبير عن بروتين GAL4 ، وبالتالي فهي قادرة على إحداث إسكات مقيدة مكانيا من تحديد الجين X. من بين مجموعة متنوعة من التطبيقات الممكنة ، طبقنا هذا النهج لإسكات الجين مختارة من مصلحتنا (الجينات X) تحت سيطرة GAL4 - engrailed (عربي) سائق ، والتي يمكن أن تؤدي إلى إسكات محددة في المقصورة الخلفية من القرص الجناح 3 ، تميزت الأراضي التي كتبها للتعبير عن التحوير UAS - GFP. كانت تصمت أقراص الجناح تخيلي تشريح اليد ، مع الحرص على إزالة الأنسجة المحيطة الملوثة ، ولا سيما الالتزام القصبات. ثم كان كل قرص الجناح معزولة بسرعة وبلطف نقلها إلى الإطار سبق علاجها ريبونوكلياز ، تشريح مجانية ليزر microdissection الفوري لمناطق مختارة. الجزء 2. microdissection ليزر من مناطق مختارة من المقصورات (الأمامية) أسكت (الخلفي) وunsilenced من القرص الجناح. كان يوما القرص الجناح على الغشاء ، microdissection الليزر من المجالات المحددة من إسكات (الخلفي ؛ GFP المسمى) وunsilenced (الأمامي ؛ GFP - لا تحمل علامات) وقد تحقق المقصورات. تم تنفيذ ذلك من خلال رسم المنطقة التي يمكن أن تناسب بسهولة في كلا ، ان الجانبين GFP الإيجابية والسلبية GFP من القرص. تحت microdissector ، ركزنا أولا شعاع الليزر على النسيج GFP إيجابية ، مما يجعل من خفض طول محيط المحدد. عائدات microdissector مع خفض في سرعة تحديد والسلطة ، ولكن من الممكن لصقل القطع يدويا ، وحتى منطقة مختارة من الأنسجة يقع في أنبوب تحت. هذا الأنبوب يحتوي على كمية صغيرة من الكاشف TRI ، بحيث النسيج GFP إيجابية على استعداد لاستخراج الحمض النووي الريبي لاحقة. انتقلنا بعد ذلك إلى منطقة القطع على العكس ، GFP - الجانبية السلبية للقرص الجناح ، من أجل تشريح أرض ما يعادلها من النسيج unsilenced GFP سلبية. مرة أخرى ، بعد أن قطع التلقائي ، مضينا في صقل قطع يدويا. مرة واحدة وقد تم خفض ، كما تم العثور على الأنسجة GFP سلبية في الكاشف TRI ، وعلى استعداد لاستخراج الحمض النووي الريبي. الجزء 3. RNA استخراج والتنميط النسخ من المناطق Microdissected الأنسجة. نحن نسج أنابيب لفصل السوائل من قبعة وأضاف الكاشف TRI يصل إلى 1 مل ثم اجرى استخراج الحمض النووي الريبي بعد بروتوكول الكاشف TRI القياسية. لجمع ما يكفي من المواد ، كررنا هذا الإجراء على 100 قطع أقراص الجناح تخيلي. بدءا من 100 منطقة من حوالي 2 لكل 5000 ميكرون ، وكان العائد لدينا من 1.5 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي. ثم كانت تسيطر دقة التشريح دليل التعبير عن طريق فحص عينات GFP في إسكات وunsilenced بواسطة RT - PCR ، وذلك باستخدام سوبر السيناريو الثالث (Invitrogen) لتجميع [كدنا] مع Hexamers عشوائية. وأجريت التحاليل الكمية لاحقة تركز على تحديد مستويات التعبير الجيني للX إسكاته ، جنبا إلى جنب مع تلك الأهداف المفترضة لمسار التنظيمي ، وذلك في الوقت الحقيقي باستخدام RT - PCR ماجستير ميكس (Invitrogen).

<ol>
	<li>Elliott, D. A., Brand, A. H., Dahmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GAL4+System+A+Versatile+System+for+the+Expression+of+Gene.">The GAL4 System A Versatile System for the Expression of Gene.</a> , (2008).</li><li>Klein, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wing+disc+development+in+the+fly:+the+early+stages.+.">Wing disc development in the fly: the early stages. .</a> Current Opinion in Genetics &#38; Development. 11, 470-475 (2001).</li><li>Dietzl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+transgenic+RNAi+library+for+conditional+gene+inactivation+in+Drosophila.">A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila.</a> Nature. 448, 151-U1-151-U1 (2007).</li><li>Martin, F. A., Morata, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartments+and+the+control+of+growth+in+the+Drosophila+wing+imaginal+disc.">Compartments and the control of growth in the Drosophila wing imaginal disc.</a> Development. 133, 4421-4426 (2006).</li><li>Tabata, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+morphogen+gradients.">Genetics of morphogen gradients.</a> Nature Reviews Genetics. 2, 620-630 (2001).</li><li>Moreno, E. &. a. m. p. ;. a. m. p., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dMyc+transforms+cells+into+super-competitors.">dMyc transforms cells into super-competitors.</a> Cell. 117, 117-129 (2004).</li></ol>

فيما يتعلق مستوياتها التعبير القاعدية التي تحققت في المقصورات الأمامية / الخلفية من أقراص الجناح unsilenced ، تم العثور على نشاط الجين المحدد X خفضت الى 40 ٪ عند إسكات. في المقابل ، تم العثور على واحد من أهدافها المفترضة (الجينات Y) بشكل ملحوظ التنظيم (7 أضعاف الزيادة) ، مما يؤ...

سلالات ذبابة ويمكن الحصول على ذبابة الفاكهة UAS - إسكات من خطوط VDRC رني جمع 2. مجموعة من الخطوط سائق GAL4 يتوفر في مركز ألبوم ذبابة الفاكهة بلومينغتون (انديانا ، الولايات المتحدة). معدات وتشمل المعدات المطلوبة ليزر microdissector (لايكا LMD6000) ، 22R Microfuge كولتر (بيكمان) ، PCR (BIO - RAD Cycler بلدي) ، ريال مدريد PCR الوقت (BIO - RAD iQ5). أدوات الأدوات المطلوبة وتشمل : زجاج الآبار ، والفرشاة ، وملقط microdissection ، والشرائح قطرة شنقا ، ودبابيس الحشرات التي شنت على إبر المحاقن ، والإطارات المعدنية مع غشاء الدائرة ، وأنابيب بلاستيكية (50 مل ، 05 مل ، 0.25 مل).

laser microdissection applied to gene expression profiling of subset of cells from the drosophila wing disc

وقد ثبت الطبيعة غير المتجانسة للأنسجة ليكون عاملا يحد من كمية المعلومات التي يمكن توليدها من العينات البيولوجية ، وتحليلات المساس المصب. النظر في الجمعيات المعقدة والديناميكية الخلوية الموجودة داخل العديد من الأنسجة ، من أجل أن ألخص في التفاعلات الجزيئية فيفو تحليل دقيق يجب على المرء أن يكون قادرا على تحليل السكان خلية معينة ضمن سياقها الأصلي. ويمكن بوساطة الليزر microdissection تحقيق هذا الهدف ، مما يسمح تحديد لا لبس فيها والحصاد الناجح للخلايا من الفائدة في ظل التصور المجهري المباشر مع المحافظة على سلامة الجزيئية. لقد طبقنا هذه التكنولوجيا لتحليل الجينات داخل مناطق محددة من القرص النامية جناح ذبابة الفاكهة ، وهو ما يمثل نظام نموذجي لدراسة المفيد مراقبة النمو ، وتمايز الخلايا وorganogenesis. وتنقسم precociously أقراص تخيلي اليرقات داخل المقصورات الأمامية والخلفية ، والظهري البطني بواسطة تقييد حدود النسب. الاستفادة من محرض GAL4 - UAS نظام ثنائي التعبير ، ويمكن لكل من هذه المقصورات المسمى تحديدا في الذباب المعدلة وراثيا إبداء التحوير UAS - GFP تحت سيطرة المناسبة GAL4 سائق بناء. في الأقراص المعدلة وراثيا ، ويمكن على وجه التحديد التنميط الجيني التعبير عن مجموعات فرعية منفصلة من الخلايا يتحدد بعد بوساطة الليزر microdissection ، وذلك باستخدام إشارة GFP الفلورسنت لتوجيه الليزر قطع. من بين مجموعة متنوعة من التطبيقات المصب ، وركزنا على التنميط النص بعد تدخل الحمض النووي الريبي RNA مترجم (رني). مع ظهور التكنولوجيا رني ، يمكن أن يترافق مع وضع العلامات GFP ضربة قاضية المترجمة من جين معين ، مما يسمح للاستجابة الترانسكربتي الحاسم للسكان الخلية المنفصلة إلى إسكات جينات معينة. للتحقق من صحة هذا النهج ، ونحن تشريح المناطق يعادل القرص من الخلفي (المسمى من قبل التعبير GFP) ، والأمامي (لا تحمل علامات) مقصورة على إسكات الإقليمية في المقصورة ف من الجينات على خلاف ذلك أعرب بتواجد مطلق تم استخراج الحمض النووي الريبي من microdissected المناطق أسكت وunsilenced والمقارنة التنميط التعبير الجيني التي تحددها الكمية في الوقت الحقيقي RT - PCR. يمكن أن نظهر هذه الطريقة فعالة لتطبيقها transcriptomics دقيقة من مجموعات فرعية من الخلايا داخل أقراص تخيلي ذبابة الفاكهة. في الواقع ، في حين ضخمة إعداد القرص كمصدر من الحمض النووي الريبي يفترض عموما التجانس الخلية ، فمن المعروف جيدا أن التعبير يمكن أن تختلف اختلافا كبيرا الترانسكربتي داخل هذه الهياكل في ذلك المعلومات الموضعية. باستخدام مترجم إشارة GFP الفلورسنت لتوجيه الليزر قطع ، يمكن إجراء تحليلات أكثر دقة والترانسكربتي تطبيق مربح لتطبيقات متباينة ، بما في ذلك التنميط نص الأنساب خلية مستقلة ضمن سياقها الأصلي.

Watch this Scientific Journal Video about Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc at JoVE.com

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

تم تطبيق الليزر لتحليل الجينات microdissection التنميط التعبير في مقصورات معينة من القرص جناح ذبابة الفاكهة تتعرض لرني المترجمة<em&gt; في الجسم الحي</em&gt;. وقد تم تحليل الحمض النووي الريبي المستخرج من مناطق يعادل المقصورات وإسكات unsilenced بواسطة RT - PCR الكمي لتحديد ملامح التعبير الجيني المقارن في سياق microecology الأنسجة الأصلية.

التطبيقية ليزر Microdissection التنميط التعبير الجيني للخلايا من المجموعة الثانوية من ذبابة الفاكهة جناح القرص

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

laser-microdissection-applied-to-gene-expression-profiling-subset

Research

JoVE Journal

Biology

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

11.1K Views.  University of Naples. تم تطبيق الليزر لتحليل الجينات microdissection التنميط التعبير في مقصورات معينة من القرص جناح ذبابة الفاكهة تتعرض لرني المترجمة في الجسم الحي. وقد تم تحليل الحمض النووي الريبي المستخرج من مناطق يعادل المقصورات وإسكات unsilenced بواسطة RT - PCR الكمي لتحديد ملامح التع?...

Video: Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. LMD techniques rely on a thermo labile membrane placed either on top of, or underneath, the tissue section. In one method, focused laser energy is used to melt the membrane onto the underlying cells, which can then be lifted out of the tissue section. In the other, the laser energy vaporizes the foil along a path "drawn" on the tissue, allowing the selected cells to fall into a collection device. Each technique allows the selection of cells with a minimum resolution of several microns. DNA, RNA, protein, and lipid samples may be isolated and analyzed from micro-dissected samples. In this video, we demonstrate the use of the Leica AS-LMD laser microdissection instrument in seven segments, including an introduction to the principles of LMD, initializing the instrument for use, general considerations for sample preparation, mounting the specimen and setting up capture tubes, aligning the microscope, adjusting the capture controls, and capturing tissue specimens. Laser-capture micro-dissection enables the investigator to isolate samples of pure cell populations as small as a few cell-equivalents. This allows the analysis of cells of interest that are free of neighboring contaminants, which may confound experimental results.

الليزر Microdissection القبض على أنسجة الثدييات

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

التحضير لزراعة الخلايا المكونة للدم الابتدائية من نخاع عظام الفئران لElectroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

باستخدام الجينات Electroporation MXcell بولسير النظام لTransfect الخلايا الأولية ذات الكفاءة العالية

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

باستخدام خلية مكافحة الآلي لتبسيط دراسات التعبير الجيني : ضربة قاضية سيرنا من IL - 4 التعبير الجيني في الخلايا التابعة Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

البارافين ، جزءا لا يتجزأ من والمجمدة أقسام ذبابة الفاكهة</emالعضلات الكبار>

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

إعادة إعماره في المختبر من أحدث T. castaneum تيلوميراز

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene expression in these tissues. Thus, to analyze cell-specific gene expression profiles from Drosophila tissues, it may be necessary to isolate specific cell types with high purity and at sufficient yields for downstream applications such as transcriptional profiling and chromatin immunoprecipitation. However, the irregular cellular morphology in tissues such as the central nervous system, coupled with the rare population of specific cell types in these tissues, can pose challenges for traditional methods of cell isolation such as laser microdissection and fluorescence-activated cell sorting (FACS). Here, an alternative approach to characterizing cell-specific gene expression profiles using affinity-based isolation of tagged nuclei, rather than whole cells, is described. Nuclei in the specific cell type of interest are genetically labeled with a nuclear envelope-localized EGFP tag using the Gal4/UAS binary expression system. These EGFP-tagged nuclei can be isolated using antibodies against GFP that are coupled to magnetic beads. The approach described in this protocol enables consistent isolation of nuclei from specific cell types in the Drosophila larval central nervous system at high purity and at sufficient levels for expression analysis, even when these cell types comprise less than 2% of the total cell population in the tissue. This approach can be used to isolate nuclei from a wide variety of Drosophila embryonic and larval cell types using specific Gal4 drivers, and may be useful for isolating nuclei from cell types that are not suitable for FACS or laser microdissection.

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila tissues often contain a heterogeneous mixture of cell types.&#160;To examine gene expression in specific cell types from a particular tissue, nuclei can be genetically tagged and subsequently isolated using an affinity-based approach. Isolated nuclei can be used for downstream applications such as gene expression analysis and chromatin immunoprecipitation.

عزل القائم على تقارب من معلم النواة من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأنسجة لتحليل التعبير الجيني

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

تحليل الحمض النووي الريبي العالمي التجميعي على مستوى خلية واحدة نقص الأكسجة التالي

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

سيرنا فحص لتحديد اليوبيكويتين واليوبيكويتين مثل المنظمين نظام مقررات تمهيدية البيولوجية في خلايا الثدييات مثقف

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.