DPP تؤثر على مصير الخلية عن طريق مستقبلات ملزمة وإرسال إشارة داخل الخلايا للتأثير على النسخ. إذا تم إنتاج DPP ولكن لم يتم إصداره ، فإنه لا يملك إمكانية الوصول إلى المستقبلات وبالتالي لا يمكنه أداء أدواره. هذه التقنية تجعل من الممكن تصور إطلاق DPP مما يتيح للباحثين فحص العوامل الوراثية والبيئية التي تغير ديناميكيات إطلاق DPP.
يتم الحفاظ على مسار إشارة BMP من الذباب إلى البشر لذلك نتوقع أن تكون الآلية التي تملي إطلاق DPP ذات صلة أيضًا بالتنمية البشرية والتجدد. تبدأ عن طريق عبور 30 إلى 40 عذراء أنثى DPP GAL4 الذباب مع 10 إلى 15 الذباب الذكور UAS DPP-GFP الذباب. تشجيع وضع البيض عن طريق إضافة كمية صغيرة من معجون الخميرة إلى قارورة طازجة من الطعام.
لجمع البيض، قم بقلب الذباب المتقاطع في القارورة والسماح لهم بالتمدد لمدة ثلاث إلى أربع ساعات قبل إزالتها. حافظ على قارورة جمع البيض عند 25 درجة مئوية لمدة 144 ساعة تقريبًا حتى تكون اليرقات في المرحلة الثالثة من النجوم. ثم حدد اليرقات المناسبة للتشريح.
أولاً، اختر اليرقات غير السل التي ستكون طول طبيعي بدلاً من قصيرة والدهون. لتحديد DPP-GFP التعبير عن اليرقات، وعرضها تحت المجهر ستيريو الفلوريسنس. وسيكون لجميع اليرقات غير السل بعض الفلور، ولكن GFP يقتصر على أقراص الجناح وأقل إشراقا على يرقات DPP-GFP.
إعداد وسائل الإعلام HL3 المعدلة وفقا لاتجاهات المخطوطات التي سوف تبقي أقراص الجناح على قيد الحياة للتصوير. ضبط درجة الحرارة إلى 7.1 مع HEPES ثم تصفية من خلال مرشح ميكرومتر 0.22. ضع قطعتين من عديم اللون عرض الشريط على الوجهين من الحكمة عبر شريحة المجهر ترك مساحة من حوالي خمسة ملليمترات بينهما والتأكد من أن نهايات الشريط مسح مع حواف الشريحة.
استخدم حافة مسطحة للضغط على الشريط بقوة إلى الشريحة. إضافة 25 ميكروليترس من الوسائط HL3 المعدلة بين قطعتي الشريط. عندما يتم تركيب قرص الجناح في وسائل الإعلام، فإن قطع الشريط تمنعه من السحق بواسطة الغطاء.
لتشريح اليرقة ، ضعها في وسائط HL3 المعدلة وتمزيقها بلطف إلى نصفين باستخدام زوجين من ملقط. تخلص من النصف الخلفي ، ثم فهم منتصف النصف الأمامي مع زوج واحد من ملقط واستخدام الزوج الآخر لدفع السنانير الفم مرة أخرى إلى اليرقة حتى يتم عكس ذلك تماما. ابحث عن الانحناءات الحادة في اثنين من أغمق الفروع الأولية الملونة من القصبة الهوائية التي تسيل أسفل جانبي اليرقة.
أقراص الجناح تقع مباشرة تحتها. قم بإزالة الأقراص بلطف ووضعها في وسائط HL3 على الشريحة المعدة للتأكد من عدم وجود قطع من القصبة الهوائية لا تزال متصلة بالاسطوانات. ترتيب أقراص الجناح بحيث الجانب حولية من الحقيبة الجناح تواجه صعودا مع القرص الكذب شقة.
تغطية الجناح مع غطاء وختم مع طلاء الأظافر. بمجرد أن يجف البولندية ، والمضي قدما على الفور مع التصوير. صورة القرص الجناح المركب باستخدام مجهر ليزر التفحص confocal مع هدف النفط 40X و488 نانومتر الليزر.
جمع الصور بسرعة اثنين من هيرتز لمدة دقيقتين. للحصول على أفضل النتائج، تعيين قوة الليزر قوية بما يكفي للحصول على صورة واضحة للخلايا DPP الإفراج لتجنب أكثر من التبييض. جمع الصور كسلسلة زمنية وتصديرها كملفات AVI للحصول على فيديو لإطلاق سراح DPP.
عندما يكون البروتوكول ناجحاً، يظهر DPP-GFP كقعر أسفل وسط القرص الجناح مع النوى مرئية كدوائر غير فلورية. يُرى إطلاق DPP-GFP مثل الـ puncta الفلورسنت التي تظهر وتختفي داخل وخارج أجسام الخلايا. ومن المرجح أن تكون البوتكا المتميزة في السيتونات أو في نقاط الاشتباك العصبي السيتونية.
يتم تركيب أقراص الجناح بحيث يتم التصوير من الجانب حولي. إذا تم تصوير القرص الجناح من الجانب العكسي، فإن الفلوراس DPP-GFP سوف تظهر من التركيز والقرار سيكون ضعيفا. عندما لا يتم دمج GFP إلى DPP، لا يتم ملاحظة أي puncta خارج من أجسام الخلايا.
يوضح عنصر التحكم هذا سلوك DPP-GFP بشكل مختلف عن GFP وحدها. وعلاوة على ذلك، لا تظهر أي فلورسنت بونتا عندما لا يتم التعبير عن DPP-GFP. أثناء هذا الإجراء، من المهم أن يتم تحميل القرص الجناح الجانب حولية.
إذا كان القرص الجناح بشكل غير صحيح الموجهة، DPP-GFP سوف تظهر خارج التركيز. ويمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة الإفراج عن غيرها من الإشارات التنموية يغاندس مثل الجناح أو القنفذ. يمكننا استكشاف جميع العوامل البيئية والجينية المختلفة التي قد تؤثر على إطلاق DPP.
وبالإضافة إلى ذلك، يمكننا تكييف هذه الطريقة لدراسة إطلاق BMP من أنواع الخلايا الأخرى.
