ونود أن نشكر السفن للدعم المالي المقدم لهذا المشروع، ماريانا Di Doménico لها المساعدة التقنية مع الفحص المجهري [كنفوكل]؛ لخوسيه ليوناردو باييز التصويبات مخطوطة له؛ لكوريا لوتشيانو لتفانيه في خدمة إنشاء الفيديو؛ إلى ناتاليا Rosano للإقراض صوتها للفيديو و المورفولوجية بلومينغتون مركز الأوراق المالية توفير الأرصدة المستخدمة في هذه الدراسة. حصل من الضفة هيبريدوما الدراسات الإنمائية (دشب) تحت إشراف NICHD Apa1 [مونوكلونل] مكافحة--المؤسسة العامة للاتصالات المتقدمة من إيزابيل غيريرو ويحتفظ بها جامعة آيوا، قسم العلوم البيولوجية، 52242 مدينة آيوا، ألف.

1 يوم
1-جمع واستزراع الخوادر.
<ol>
	<li>إزالة ح 0 بعد تشكيل بوباريوم (APF) أو بريبوباي باستخدام الرسام رطب من قنينات مثقف ووضعها في قارورة جديدة لإكمال فترة التنمية تقريبا (انظر 2-1 و 2، 2). 
	ملاحظة: ينبغي الإبقاء على صحة سكان من الذباب باستخدام البروتوكولات القياسية تثقيف. بعد ثلاثة أو أربعة أيام التي وضعت البيض، يمكن إزالة الكبار من قنينات للسماح تنمية مثلى للأفراد. أنها المحافظة على درجة حرارة ثابتة حتى تبدأ يرقات الطور الثالث بوبيشن. الانتقال اليرقات/الخوادر يتسم بتشكيل بريبوبا تعتبر ح 0 الإدارة العامة الاتحادية. بريبوبا هو يرقة بيضاء غير متحرك يحتوي مستطيل، مستديرة الشكل مع بروز spiracles الأمامي.</li>
</ol>
2 يوم
2-نقل والتشريح والتثبيت.
<ol>
	<li>نقل الخوادر (2 ح قبل الوقت التنمية كاملة) مع الرسام، إلى الشريحة المجهر مع الشريط على الوجهين التقيد بذلك. ضع الخوادر على شكل صف مع الجانبين الظهرية الرأسي وحتى ينتهي تواجه نفس الاتجاه.</li>
	<li>إرجاع الشريحة المجهر إلى درجة حرارة ثابتة والسماح الخوادر لإكمال الوقت الإنمائية المناسبة (أي 24-30 ح الاتحادية). 
	ملاحظة: وستكون الشريحة المجهر مع الشريط على الوجهين منصة تشريح عابرة لإزالة حالة الخوادر (انظر أدناه). مرور الوقت على الشريحة المجهر (خارج القنينة) يساعد على الجاف للقضية الخوادر يجعلها قابلة للكسر بسهولة بالملقط.</li>
	<li>إزالة operculum من حالة الخوادر باستخدام الملقط.</li>
	<li>كسر الحالة مع الملقط (كما هو موضح في الفيديو) مما يجعل خط على طول الجانب من الخادرة إلى نهاية والذيلية. من الممكن مع الإضاءة المناسبة للكشف عن الشكل الداخلي لعذراء مما يجعل من الواضح مساحة فقط فوق المفصل الجناح الخوادر. هذه المساحة بمثابة دليل لإجراء فتح دون الأضرار عذراء.</li>
	<li>قم بإزالة أجزاء من القضية، التقاط لهم بفتح الحدود وتقلهم إلى الجانب الآخر حيث تعقد لهم الشريط على الوجهين. في نهاية التشريح سيكون الخوادر تقريبا "عارية"، فقط قطعة صغيرة من القضية سوف تغطي الحافة الخلفية. ملاحظة: الغرض من ترك كمية صغيرة من القضية في نهاية والذيلية العلوي لضمان إصدار سلسة من القضية على الشريحة مع الشريط على الوجهين. الأسباب الكامنة وراء هذا الإجراء لأنه إذا قمت بإزالة كثيرا القضية إلى حد كبير خطر الأضرار عذراء. من ناحية أخرى إذا قمت بإزالة القليل جداً، الخادرة لن بسهولة تأتي خالية من القضية.</li>
	<li>دفع إلى الأسفل (مع الملقط) ما تبقى القضية. سوف تثير هذه الحركة نهاية الأمامي من عذراء، السماح لكل من الرأس والصدر على البقاء في وضع تفضيلي إلى الالتزام وإلى نقلها في الخطوة اللاحقة.</li>
	<li>تأخذ شريحة جديدة مع الشريط على الوجهين وعكس ذلك على عذراء أو صف الخوادر. نوصي بتنفيذ هذا النهج عن طريق مراقبة التحركات مع المعونة من ستيريوميكروسكوبي منع الكسر الخوادر.</li>
	<li>اضغط قليلاً لجعل الخوادر العصا إلى الشريط وتنزلق الشريحة بلطف من أجل إزالة الخوادر من بقية الحالات. عكس الشريحة المجهر: سوف يكون عالقاً في الخوادر في الجهة الظهرية على مستوى رؤوسهم/منطقة الصدر.</li>
	<li>تغطي جميع الخوادر عارية مع بارافورمالدهيد 4% وانتظر 10 دقائق. في تجربتنا، هذه الفترة الزمنية مع مثبت يساعد على تغيير اتساق بشرة يجعلها ثابتة وأقل لزجة وسهلة للتعامل. 
	ملاحظة: القيام باستخراج الحمض النووي الريبي (الرنا)، بارافورمالدهيد بديل للفوسفات مخزنة المالحة (PBS) مع رناسي مجانية المياه وإزالة أجنحة الخوادر صنع قطع (مع معونة مقص) قرب النقطة المفصل لكل طرف من أطرافهم. باستخدام الملقط، نقل الجناح الخوادر لأنبوب ميكروسينتريفوجي مع 1 مل كاشف ثيوسيانات والفينول جوانيدينيوم. بعد تجميع مجموعة أجنحة 50-80، تخزين أنبوب ميكروسينتريفوجي في-80 درجة مئوية حتى أداء10،استخراج الحمض النووي الريبي11.</li>
	<li>إجراء شق صغير في منطقة المفصل الجناح أو القريبة منها. تسمح مثبت للوصول إلى ظهارة الجناح. استخدام ماصة (p200) تدفق مثبت على الجناح. عند مسح استبدال يحملق الملوثة مع الجديد. بعد التنظيف، إبقاء الجناح في مثبت لمدة 5 دقائق. 
	ملاحظة: على الرغم من أن هذه المناورة يساعد على مسح بعيداً غالبية الأنسجة تلويث، بعض هيموسيتيس وقطرات الدهون يمكن أن تبقى حبيسة بين طبقات طلائي الظهري والبطني الجناح (انظر الشكل 1A).</li>
	<li>المسيل للدموع بالملقط من حدود بشرة (كما هو موضح في الفيديو) توسيع الثقب ويتيح الإفراج عن ظهارة الجناح من الكيس بشرة. حالما يتم تحرير الأنسجة الجناح، اتركه في حل بارافورمالدهيد لإكمال التثبيت و 30 دقيقة.</li>
	<li>نقل أجنحة ثابتة لواحد الصحن البلاستيك 4-وليد مليئة ببست (Triton X-100 0.05%). مخزن بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.</li>
</ol>
3 يوم
3-الابتدائي جسم الحضانة.
<ol>
	<li>بيرميبيليزي الأنسجة تفرخ أجنحة الخوادر في ببست (Triton X-100 0.2 ٪) لمدة 15 دقيقة باستخدام منصة هزاز لتسهيل حركة متوسطة سائل لطيف. 
	ملاحظة: حتى تركيب العينات، ينبغي إجراء الخطوات باستخدام منصة هزاز.</li>
	<li>كتلة العينات باستخدام ببستا (جيش صرب البوسنة 3 ٪، X-100 تريتون 0.1 ٪) ح 1.</li>
	<li>استخدم نفس المخزن المؤقت لتمييع جسم الأولية (الماوس المضادة-المؤسسة العامة للاتصالات، 1: 100)، واحتضان أجنحة الخوادر بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.</li>
</ol>
4 يوم
4-الثانوية جسم الحضانة.
<ol>
	<li>تغسل العينات 4 × 10 دقيقة كل مع ببست (Triton X-100 0.05%)</li>
	<li>احتضان مع جسم الثانوية (مثلاً، الماوس المضادة مترافق ل fluorochrome) المخفف بتركيز مناسب في ببستا (جيش صرب البوسنة 3 ٪، X-100 تريتون 0.1 ٪) في درجة حرارة الغرفة في الظلام، وعن ح 2. 
	ملاحظة: إذا كان من المناسب، استخدام 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) و/أو فالويدين كونتيرستين الأنسجة. إضافة هذه المسابر مع الأجسام المضادة الثانوية مع مراعاة الطول الموجي الانبعاثات من فلوروتشروميس لمنع تداخل الإشارات.</li>
	<li>تغسل العينات 4 × 10 دقيقة كل مع ببست (Triton X-100 0.05%)</li>
</ol>
5-تركيب
<ol>
	<li>إعداد شريحة عينة بوضع النقاط 4 من طلاء الأظافر الشفاف على الشريحة المجهر كما لو كانت القمم ساحة.</li></ol>تكون النقاط حيث ستقع كوفيرسليبس، المساعدة على تفادي سحق الأنسجة.
	<li>مكان 30 ميليلتر من تركيب وسائط (الجلسرين/تريس-HCl 80 في المائة) في وسط ساحة النقاط المقدمة مع طلاء الأظافر دون لمس أي من الزوايا (النقاط). تأخذ ماصة مع تلميح اقتصاص أصفر وتحميل بعض وسائل الإعلام المتزايدة ورسم ثم في عدة أجنحة الخوادر.</li>
	<li>نقل أجنحة الخوادر إلى النقطة من تركيب وسائط على شريحة المجهر. مع المعونة من تلميح، انتشار وسائل الإعلام المتزايدة وتغرق أجنحة الخوادر لمنعها من الطفو. وستبقى مورفولوجية النسيج إذا بقيت الأجنحة شقة عندما يتم وضع زجاج الغطاء على. قبل وضع زجاج الغطاء، قم بإزالة فقاعات الهواء.</li>
	<li>أقل ساترة على العينات التي تحاول منع توليد فقاعات الهواء. يمكن أن يتم هذا التحرك بمساعدة الملقط.</li>

<ol>
	<li>Serrano, N., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limb+morphogenesis:+connections+between+patterning+and+growth.">Limb morphogenesis: connections between patterning and growth.</a> Curr Biol. 7 (3), R186-R195 (1997).</li><li>Blair, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartments+and+appendage+development+in+Drosophila.">Compartments and appendage development in Drosophila.</a> Bioessays. 17 (4), 299-309 (1995).</li><li>Klein, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wing+disc+development+in+the+fly:+the+early+stages.">Wing disc development in the fly: the early stages.</a> Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 470-475 (2001).</li><li>Beira, J. V., Paro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+legacy+of+Drosophila+imaginal+discs.">The legacy of Drosophila imaginal discs.</a> Chromosoma. 125 (4), 573-592 (2016).</li><li>De Celis, J. F., Diaz-Benjumea, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+basis+for+vein+pattern+variations+in+insect+wings.">Developmental basis for vein pattern variations in insect wings.</a> Int J Dev Biol. 47 (7-8), 653-663 (2003).</li><li>Blair, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wing+vein+patterning+in+Drosophila+and+the+analysis+of+intercellular+signaling.">Wing vein patterning in Drosophila and the analysis of intercellular signaling.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 293-319 (2007).</li><li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drawing+lines+in+the+Drosophila+wing:+initiation+of+wing+vein+development.">Drawing lines in the Drosophila wing: initiation of wing vein development.</a> Curr Opin Genet Dev. 10 (4), 393-398 (2000).</li><li>De Celis, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+the+Drosophila+wing:+The+development+of+the+veins.">Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins.</a> Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).</li><li>Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Drosophila+pupal+wing+morphogenesis.">Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis.</a> Methods Mol Biol. 420, 265-275 (2008).</li><li>Bolatto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+distribution+of+Patched-related+protein+in+the+Drosophila+embryo.">Spatial and temporal distribution of Patched-related protein in the Drosophila embryo.</a> Gene Expr Patterns. 19 (1-2), 120-128 (2015).</li><li>Zuniga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+encoding+novel+secreted+and+transmembrane+proteins+are+temporally+and+spatially+regulated+during+Drosophila+melanogaster+embryogenesis.">Genes encoding novel secreted and transmembrane proteins are temporally and spatially regulated during Drosophila melanogaster embryogenesis.</a> BMC Biol. 7, 61 (2009).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

يمكن استخدام طريقة التشريح الموصوفة في هذا الفيديو لتحضير عينات ذات جودة عالية من أجنحة المورفولوجية الخوادر من مراحل التنمية المختلفة لأنواع كثيرة من التقنيات (مثلاً، الفلورة، كدنا توليف لفحوصات بكر، في المختبر الجناح التنمية). فيما يتعلق بهذه الطريقة قد استخدمت العلماء...

يتم تطوير أجنحة المورفولوجية من أقراص إيماجينال الجناح. البدائي لهذه الأقراص الجناح جانبا أثناء التطور الجنيني كمجموعات صغيرة من الخلايا إيماجينال 20-30 التي إينفاجيناتي من ظهارة الجنينية. بينما تنمو اليرقة إلى مرحلة الطور الثالث، يحدث الانقسام في الخلايا إيماجينال في أوقات محددة مميزة رفع عدد أعضائها (حوالي 50000 الخلايا) وتشكيل الجناح القرص1،2،3، 4. كما تتكاثر الخلايا، أنها أزياء من ظهارة أنبوبي، أدى إلى تصاعد ضغط ذاتية قابلة لطي. أثناء بوباتيون، ظهارة القرص التلسكوبات خارجاً للجناح شكل الطبقات اثنين وعروق طولية تبدأ كثغرات بينهما، الذي يحدث مرتين خلال الجناح الإنمائية5،6.
وقد ترتيب الأوردة دائماً نمط مماثل؛ القدرة على التعرف بسهولة على كل تغيير في تشكيل الأوردة يجعل الطفرات مرئية جداً (مثلاً مفقودة أو إضافية الأوردة، تغييرات في مواقف الوريد، إلخ.). من المثير للاهتمام، اختلافات النمط الظاهري هي عادة أدلة الطفرات في المكونات المعروفة أو الرواية من إشارات المسارات ذات الصلة لتطوير الجناح. واحد من المسارات التي تلعب دوراً في تحديد الموقف والحفاظ على السياق والأراضي إينتيرفين هو القنفذ (ح ح) المسار6،،من78.
ونظرا لأهمية الجناح الخوادر كنظام نموذجي، سيكون من المهم الحصول على عينات ذات نوعية جيدة للعمل مع. في الماضي، لم تول العلماء التي نشرت البروتوكولات تشريح أجنحة المورفولوجية دليلاً مناسباً لتحقيق نماذج قابلة للتطبيق. دون التوجيه من باحث واحد لا يمكن تصور وضوح العملية. في هذه النهج البديل تشريح تقسيم اثنين، الفصل بين الجناح من الأنسجة المحيطة عذراء وغسلها مرارا وتكرارا لإزالة الأنقاض. يلوث هذا النوع من النهج المطالبات بمغادرة الجناح مجاناً للكن العملية أبطأ بسبب التجربة السابقة وهناك فرصة أكبر للمساس بهيكل أجنحة هشة9.
وقد وضعته الإجراء الموضح هنا الطلب لإيجاد وسيلة سريعة وفعالة للحصول على عينات الجناح الخوادر مناسبة للكشف عن بروتينات محددة أو النصوص باستخدام بروتوكولات إيمونوديتيكتيون أو فحوصات بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (PCR). ولتوضيح ذلك، التعبير والترجمة من مرقع (المؤسسة العامة للاتصالات أو مستقبلات المتعارف عليه المسار سمو) تكتشف في عينات الجناح الخوادر، توفير بروتوكول يتضمن التفاصيل ذات الصلة القيام بنجاح الكامل الإجراء.

<table><tbody><tr><td>Stereomicroscope with cool light illumination</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td>SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>Rocking platform</td><td>Biometra (WT 16)</td><td>042-500</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>StarFrost</td><td>8037/1</td><td></td></tr><tr><td>Cover glasses (24 x 32 mm)</td><td>Deltalab</td><td>D102432</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>F.S.T</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Lawton</td><td>63-1400</td><td></td></tr><tr><td>Multi-well plastic dish</td><td>Thermo Scientific</td><td>144444</td><td></td></tr><tr><td>p100 or p200 pipette</td><td>Finnpipette (Labsystems)</td><td>9400130</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS (Dulbecco)</td><td>Gibco</td><td>21600-010</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Bio Basic INC.</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Mallinckrodt</td><td>5092</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>497</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Ambion</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>DEPC treated water</td><td>MO.BIO</td><td>17011-200</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG (H+L), 2 mg/mL&lt;br/&gt; (working dilution 1/800)</td><td>Invitrogen</td><td>A11030</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal anti-Ptc (Apa-1) 54 &amp;mu;g/mL&lt;br/&gt; (working dilution 1/100)</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td><td></td><td>By Isabel Gerrero from DSHB under the auspices of the NICHD and maintained by The University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI, 1 mg/mL&lt;br/&gt; (working dilution 1/5000)</td><td>Invitrogen</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin conjugated to Alexa 488, 300 U/1.5 mL methanol&lt;br/&gt; (1/600 working dilution)</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Canton S (fly stock)</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a rapid and efficient method to dissect pupal wings of drosophila suitable for immunodetections or pcr assays

وضع الجناح في melanogaster المورفولوجية نموذجا مثاليا لدراسة morphogenesis على مستوى الأنسجة. تطوير هذه الملاحق من مجموعة من الخلايا المسماة الجناح أقراص imaginal شكلت أثناء التطور الجنيني. في مراحل اليرقات تنمو أقراص إيماجينال، زيادة في عدد الخلايا وتشكيل هياكل طلائي مونولاييريد. داخل القضية الخوادر، برعم بأقراص إيماجينال وإضعاف في بيلاييرس على طول خط يصبح الهامش مستقبلا من الجناح. أثناء هذه العملية، تنشأ العروق الطولية بريموديا الخلايا المنطلق على السطوح الظهرية والبطني المحتملين من الجناح. خلال مرحلة الخوادر المشارب الخلايا الوريد لكل سطح الاتصال من أجل إنشاء أنابيب ضيقة؛ في الوقت نفسه، تبدأ عبر الأوردة تكونها.
بمساعدة الواسمات الجزيئية الملائمة، من الممكن تحديد العناصر الرئيسية يؤلف الجناح أثناء تطورها. ولهذا السبب، القدرة على دقة الكشف عن وقائع أو البروتينات في هذا الهيكل حاسم بالنسبة للذين يدرسون وفرة والتعريب المتصلة بعملية التنمية للجناح.
ووصف الإجراء هنا يركز على التلاعب بأجنحة الخوادر، توفير إرشادات مفصلة حول كيفية تشريح الجناح خلال مرحلة الخوادر. تشريح الأنسجة الخوادر أكثر صعوبة لأداء نظرائهن في يرقات الطور الثالث. وهذا السبب في وضع هذا النهج، للحصول على عينات سريع وكفاءة عالية الجودة. وترد تفاصيل عن كيفية إيمونوستين وجبل هذه العينات الجناح، للسماح للتصور من البروتينات أو مكونات الخلية، في البروتوكول. مع القليل من الخبرة من الممكن جمع 8-10 أجنحة الخوادر ذات جودة عالية في فترة قصيرة من الزمن.

ويوفر البروتوكول وسيلة مباشرة للحصول على عينات الجناح الخوادر التي تحتفظ مورفولوجية مألوفة للجناح. من هذه الأعمال التحضيرية من الممكن الحصول على أكوام من الصور التي يمكن أن يكون المتوقع كثنائي الأبعاد أو ثلاثي الأبعاد، للتحقيق في توزيع و/أو في إثراء البروتينات خلال الت...

Watch this Scientific Journal Video about A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays at JoVE.com

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

القدرة على الكشف عن دقة النصوص أو البروتينات في الأنسجة المورفولوجية أمر بالغ الأهمية لدراسة ما وفرة والتعريب المتصلة بعملية التنمية. هنا هو وصف لإجراءات واضحة تشريح أجنحة الخوادر. يمكن استخدام هذه الأجنحة كعينات في العديد من التقنيات (إيمونوهيستوتشيميستري، وفحص PCR، إلخ).

طريقة سريعة وفعالة لتشريح أجنحة المورفولوجية مناسبة إيمونوديتيكشنز أو فحوصات بكر الخوادر

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells ...

a-rapid-efficient-method-to-dissect-pupal-wings-drosophila-suitable

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

8.0K Views.  Laboratorio de Biología del Desarrollo. القدرة على الكشف عن دقة النصوص أو البروتينات في الأنسجة المورفولوجية أمر بالغ الأهمية لدراسة ما وفرة والتعريب المتصلة بعملية التنمية. هنا هو وصف لإجراءات واضحة تشريح أجنحة الخوادر. يمكن استخدام هذه الأجنحة كعينات في العديد من التقنيات (إيمونوهيستوتشيميست...

Video: A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology, which all influence muscle development and myofibrillogenesis. Omics data, such as those generated by mass spectrometry or deep sequencing, can provide important mechanistic insights into these biological processes. For such approaches, it is beneficial to analyze tissue-specific samples to increase both selectivity and specificity of the omics fingerprints. Here we present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched muscle samples for omics applications. We first describe how to dissect flight muscles at early pupal stages (&#60;48 h after puparium formation [APF]), when the muscles are discernable by green fluorescent protein (GFP) labeling. We then describe how to dissect muscles from late pupae (&#62;48 h APF) or adults, when muscles are distinguishable under a dissecting microscope. The accompanying video protocol will make these technically demanding dissections more widely accessible to the muscle and Drosophila research communities. For RNA applications, we assay the quantity and quality of RNA that can be isolated at different time points and with different approaches. We further show that Bruno1 (Bru1) is necessary for a temporal shift in myosin heavy chain (Mhc) splicing, demonstrating that dissected muscles can be used for mRNA-Seq, mass spectrometry, and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) applications. This dissection protocol will help promote tissue-specific omics analyses and can be generally applied to study multiple biological aspects of myogenesis.

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology. We present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched samples ideal for proteomics and deep-sequencing. These samples can offer important mechanistic insights into diverse aspects of muscle development.

تشريح العضلات الطائرة الصباغية لنهج الomics

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and ...

Genetics

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

تصور في Proprioceptors<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; يرقات وشرانق

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Neuroscience

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and behavioral evolution. Drosophila olfactory tissues house the olfactory receptor neurons (ORNs) that detect volatile chemical cues in addition to hydro- and thermo-sensory neurons. In this protocol, we describe the dissection of developing peripheral olfactory tissue of the adult Drosophila species. We first describe how to stage and age Drosophila larvae, followed by the dissection of the antennal disc from early pupal stages, followed by the dissection of the antennae from mid-pupal stages and adults. We also show methods where preparations can be utilized in molecular techniques, such as the RNA extraction for qRT-PCR, RNAseq, or immunohistochemistry. These methods can also be applied to other Drosophila species after species-specific pupal development times are determined, and respective stages are calculated for appropriate aging.

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

Here, we present a protocol to stage and dissect developing olfactory tissue from Drosophila species. The dissected tissue can later be used for molecular analyses, such as quantitative RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) or RNA sequencing (RNAseq), as well as in vivo analyses such as immunohistochemistry or in situ hybridization.

إعداد وضع الأنسجة حاسة الشم الطرفية الجزيئية والتحليل المناعي في المورفولوجية

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a reliable protocol for the dissection of the delicate Drosophila pupal retina. Our surgical approach utilizes readily-available microdissection tools to open pupae and precisely extract eye-brain complexes. These can be fixed, subjected to immunohistochemistry, and retinas then mounted onto microscope slides and imaged if the goal is to detect cellular or subcellular structures. Alternatively, unfixed retinas can be isolated from brain tissue, lysed in appropriate buffers and utilized for protein gel electrophoresis or mRNA extraction (to assess protein or gene expression, respectively). Significant practice and patience may be required to master the microdissection protocol described, but once mastered, the protocol enables relatively quick isolation of mainly undamaged retinas.

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

This paper presents a surgical method for dissecting Drosophila pupal retinas along with protocols for the processing of tissue for immunohistochemistry, western analysis, and RNA-extraction.&#160;

تشريح الشبكية الخوادر المورفولوجية إيمونوهيستوتشيميستري والتحليل الغربي، وعزل الحمض النووي الريبي

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

The transforming Growth Factor-beta (TGF-&#946;) superfamily is essential for early embryonic patterning and development of adult structures in multicellular organisms. The TGF-&#946; superfamily includes TGF-&#946;, bone morphogenetic protein (BMPs), Activins, Growth and Differentiation Factors, and Nodals. It has long been known that the amount of ligand exposed to cells is important for its effects. It was thought that long-range concentration gradients set up embryonic pattern. However, recently it has become clear that the timing of exposure to these ligands is also important for their downstream transcriptional consequences. A TGF-&#946; superfamily ligand cannot have a developmental consequence until it is released from the cell in which it was produced. Until recently, it was difficult to determine when these ligands were released from cells. Here we show how to measure the release of a Drosophila BMP called Decapentaplegic (Dpp) from the cells of the wing primordium or wing disc. This method could be modified for other systems or signaling ligands.

Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

The timing of exposure to ligands may impact their developmental consequences. Here we show how to image release of a Drosophila bone morphogenetic protein (BMP) called Dpp from cells of the wing disc.

التصوير التقدمي الإفراج عن القرص الجناح دروفيا

The transforming Growth Factor-beta (TGF-&#946;) superfamily is essential for early embryonic patterning and development of adult structures in ...

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, compromising downstream analyses. Considering the complex and dynamic cellular associations existing within many tissues, in order to recapitulate the in vivo interactions thorough molecular analysis one must be able to analyze specific cell populations within their native context. Laser-mediated microdissection can achieve this goal, allowing unambiguous identification and successful harvest of cells of interest under direct microscopic visualization while maintaining molecular integrity. We have applied this technology to analyse gene expression within defined areas of the developing Drosophila wing disc, which represents an advantageous model system to study growth control, cell differentiation and organogenesis. Larval imaginal discs are precociously subdivided into anterior and posterior, dorsal and ventral compartments by lineage restriction boundaries. Making use of the inducible GAL4-UAS binary expression system, each of these compartments can be specifically labelled in transgenic flies expressing an UAS-GFP transgene under the control of the appropriate GAL4-driver construct. In the transgenic discs, gene expression profiling of discrete subsets of cells can precisely be determined after laser-mediated microdissection, using the fluorescent GFP signal to guide laser cut. 
Among the variety of downstream applications, we focused on RNA transcript profiling after localised RNA interference (RNAi). With the advent of RNAi technology, GFP labelling can be coupled with localised knockdown of a given gene, allowing to determinate the transcriptional response of a discrete cell population to the specific gene silencing. To validate this approach, we dissected equivalent areas of the disc from the posterior (labelled by GFP expression), and the anterior (unlabelled) compartment upon regional silencing in the P compartment of an otherwise ubiquitously expressed gene. RNA was extracted from microdissected silenced and unsilenced areas and comparative gene expression profiling determined by quantitative real-time RT-PCR. We show that this method can effectively be applied for accurate transcriptomics of subsets of cells within the Drosophila imaginal discs. Indeed, while massive disc preparation as source of RNA generally assumes cell homogeneity, it is well known that transcriptional expression can vary greatly within these structures in consequence of positional information. Using localized fluorescent GFP signal to guide laser cut, more accurate transcriptional analyses can be performed and profitably applied to disparate applications, including transcript profiling of distinct cell lineages within their native context.

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser microdissection was applied to analyse gene expression profiling in specific compartments of Drosophila wing disc subjected to localised RNAi in vivo. RNA extracted from equivalent areas of silenced and unsilenced compartments was analysed by quantitative RT-PCR to determine comparative gene expression profiling within the context of native tissue microecology.

التطبيقية ليزر Microdissection التنميط التعبير الجيني للخلايا من المجموعة الثانوية من ذبابة الفاكهة جناح القرص

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

Biology

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic morphologies 1-3. During pupation, which spans approximately 96 hours (at 25 &deg;C), proliferating populations of imaginal cells replace the larval epidermis to generate the adult abdominal segments. These imaginal cells, born during embryogenesis, exist as lateral pairs of histoblast nests in each abdominal segment of the larvae. Four pairs of histoblast nests give rise to the adult dorsal cuticle (anterior and posterior dorsal nests), the ventral cuticle (ventral nests) and the spiracles associated with each segment (spiracle nests) 4. Upon puparation, these diploid cells (distinguishable by size from the larger polyploid larval epidermal cells- LECs) begin a stereotypical process of proliferation, migration and replacement of the LECs. Various molecular and genetic tools can be employed to investigate the contributions of genetic pathways involved in morphogenesis of the adult abdomen. Ultimate adult phenotypes are typically analyzed following dissection of adult abdominal cuticles. However, investigation of the underlying molecular processes requires immunohistochemical analyses of the pupal epithelium, which present unique challenges. Temporally dynamic morphogenesis and the interactions of two distinct epithelial populations (larval and imaginal) generate a fragile tissue prone to excessive cell loss during dissection and subsequent processing. We have developed methods of dissection, fixation, mounting and imaging of the Drosophila pupal abdominem epithelium for immunohistochemical studies that generate consistent high quality samples suitable for confocal or standard fluorescent microscopy.

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

Antibody staining of the Drosophila pupae can enhance genetic analyses of adult abdominal developmental genetics. We present our protocol for dissection, fixation and antibody staining of staged Drosophila pupal abdomen.

ذبابة الفاكهة المناعية العذراء البطن

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic ...

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called imaginal discs. These discs give rise to a high percentage of adult structures that are found within the adult fly. Here we describe a protocol that has been optimized to recover these discs and prepare them for analysis with antibodies, transcriptional reporters and protein traps. This procedure is best suited for thin tissues like imaginal discs, but can be easily modified for use with thicker tissues such as the larval brain and adult ovary. The written protocol and accompanying video will guide the reader/viewer through the dissection of third instar larvae, fixation of tissue, and treatment of imaginal discs with antibodies. The protocol can be used to dissect imaginal discs from younger first and second instar larvae as well. The advantage of this protocol is that it is relatively short and it has been optimized for the high quality preservation of the dissected tissue. Another advantage is that the fixation procedure that is employed works well with the overwhelming number of antibodies that recognize Drosophila proteins. In our experience, there is a very small number of sensitive antibodies that do not work well with this procedure. In these situations, the remedy appears to be to use an alternate fixation cocktail while continuing to follow the guidelines that we have set forth for the dissection steps and antibody incubations.

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

تشريح والمناعية من تخيلي أقراص من<em&gt; ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent adult integument. Their immobility and transparency make them ideal for in vivo live imaging experiments. Many studies have focused on the dorsal epithelial monolayer of the pupal&#160;notum because of its accessibility and relatively large size. In addition to the studies of epithelial mechanics and development, the notum has been an ideal tissue to study wound healing. After an injury, the entire epithelial repair process can be captured by live imaging over 6-12 h. Despite the popularity of the notum for live imaging, very few published studies have utilized fixed notum samples. Fixation and staining are common approaches for nearly all other Drosophila tissues, taking advantage of the large repertoire of simple cellular stains and antibodies. However, the pupal notum is fragile and prone to curling and distortion after removal from the body, making it challenging to complement live imaging. This protocol offers a straightforward method for fixing and staining the pupal notum, both intact and after laser-wounding. With this technique, the ventral side of the pupa is glued down to a coverslip to immobilize the pupa, and the notum is carefully removed, fixed, and stained. The notum epithelium is mounted on a slide or between two coverslips to facilitate imaging from the tissue&#39;s dorsal or ventral side.

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

The present protocol details the preparation and visualization of fixed tissue of the Drosophila pupal notum. It can be used for either intact or wounded tissue, and the original architecture of the tissue is preserved. The procedures for dissecting, fixing, and staining are all described in this article.

تشريح وإصلاح وتصور ذبابة الفاكهة العذراء Notum

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent ...

Drosophila Larva Imaginal Disc Dissection: A Method to Observe Developing Epithelia

Source: Morimoto, K. and Tamori, Y. <a href="https://www.jove.com/video/55901/" target="_blank">Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia</a>. J. Vis. Exp. (2017).
When staining Drosophila imaginal discs, often a rough dissection is performed where the discs are exposed but remain attached to the body. Once stained, the discs of interest are isolated and mounted. The example protocol demonstrates a procedure for wing imaginal disc dissection and mounting.

ذبابة الفاكهة تشريح القرص الخيالي لليرقة: طريقة لمراقبة الظهارة النامية

Source: Morimoto, K. and Tamori, Y. Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia. J. Vis. Exp. (2017).
When staining Drosophila ...

طريقة سريعة وفعالة لتشريح أجنحة المورفولوجية مناسبة إيمونوديتيكشنز أو فحوصات بكر الخوادر

Summary

Explore More Videos