1. إعداد وفرز الخلايا Namalwa <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الخلايا من قارورة الثقافة والطرد المركزي الخلايا لبيليه. إزالة الخلايا وطاف resuspend في حجم معروف من برنامج تلفزيوني. الخلايا المستخدمة في هذا البروتوكول هي خلايا التعليق. إذا كنت تستخدم الخلايا الملتصقة ستحتاج إلى جمع يعرض للتريبسين قبل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحديد عدد الخلايا الحية ، وصمة عار an قسامة لتعليق الخلية التي خلطها 01:01 بمحلول 0.4 ٪ أزرق التريبان والماصة 10 ميكرولتر من الخليط على شريحة العد ، ومن ثم إدراج شريحة في الخلية TC10 الآلي العداد (بيو راد مختبرات ، وشركة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سوف العداد الخلية TC10 أوتوفوكس أن أؤكد العد الأكثر دقة ، ومن ثم المضي قدما في فرز الأصوات. فإنه يحدد تلقائيا من كثافة الخلايا الحية وخلايا الكلية في العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد طريقة عرض الصورة لعرض الخلايا على viewscreen. ثم حدد الحاسبة لتخفيف العداد الخلية TC10 تلقائيا بحساب كمية خليط الخلية التي ستكون هناك حاجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هذه التجربة هو استخدام ما مجموعه ثلاثة siRNAs : واحد واثنين سيرنا السيطرة siRNAs مختلفة تستهدف الجين STAT6 ، بالإضافة إلى الضوابط untransfected. وهذا يتطلب 3.6 مل في تركيز النهائي من 5 X 10 في الخلايا 6 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أدخل التركيز المطلوب وقيم الحجم النهائي في تخفيف حاسبة ، ويحسب حجم التعليق الخلية المطلوبة استنادا إلى عدد الخلايا الحية لتلك العينة. بدلا من ذلك ، إجراء العملية الحسابية يدويا. ثم نقل حجم المطلوب من خليط الخلية لهذه التجارب في أنبوب جديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور مخاليط الخلية إلى خلايا بيليه وإزالة كل برنامج تلفزيوني. Resuspend في 3.6 مل من الجينات العازلة electroporation بولسير (بيو راد مختبرات). نقل 800 aliquots ميكرولتر في أنابيب تحتوي على مزيج siRNAs المناسبة وبلطف. الخلايا هي الآن جاهزة للelectroporation. </li></ol> 2. Electroporating الخلايا في 96 - جيدا لوحات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة electroporation 96 - جيدا يسمح لجميع العلاجات يعيد أربعة إلى أن electroporated معا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 150 ميكرولتر من تعليق خلية في الآبار الملائمة لوحة electroporation 96 - جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج لوحة في لوحة MXcell غرفة electroporation وإغلاق الغطاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Electroporate باستخدام إعدادات الأمثل للخط الخليوي والعازلة المستخدمة. وباستخدام هذه الخلايا electroporated موجة الانحلال الأسي مع ضبط أداة من 250 V ، μF 350 ، و 1000 Ω المقاومة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> electroporation بعد اكتمال ماصة بلطف صعودا وهبوطا في كل بئر إلى المزيج ثم نقل الخلايا إلى الأنسجة التي تحتوي على لوحة ثقافة ما قبل تحسنت وسائل الإعلام. وتزرع في خلايا Namalwa RPMI (الحياة تكنولوجيز) تستكمل مع FCS 7.5 ٪ و 1 ٪ البيروفات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتؤخذ عينات من الرقابة التي لم electroporated من الخلية تعليق المتبقية وإضافتها إلى الأطباق ثقافة مستنبت قبل تحسنت بشكل مطابق للخلايا electroporated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخلايا احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع نسبة 5 ٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 24 ساعة ، وكان بفعل مجموعة واحدة من الخلايا التي تحتوي على تركيز نهائي 10 نانوغرام / مل IL - 4 المؤتلف (R &amp; D أنظمة). المجموعة الثانية من الخلايا السيطرة لا يحصلون إلا على وسائل الاعلام إضافية. وحضنت كل الخلايا إضافية على مدار 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2. </li></ol> 3. استخراج والتحقق من الحمض النووي الريبي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ما مجموعه 48 ساعة من النمو ، وعدد الخلايا في كل بئر ، ونقل أحد قسامة من كل بئر إلى أنبوب microfuge لاستخراج الحمض النووي الريبي ، وتجميد قسامة الثاني لتحليل البروتين النشاف الغربية أو غيرها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي عينات لخلايا بيليه ، ثم إزالة ورفض كل من طاف الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المضي قدما في استخراج الحمض النووي الريبي. نحن عادة استخدام الحمض النووي الريبي مجموع أوروم مجموعة (بيو راد) وفقا لبروتوكول المدرجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند رصد الجين بوساطة سيرنا ضربة قاضية من المهم بصفة خاصة للتحقق من الحمض النووي الريبي RNA الجودة لان المتدهورة سوف تعطي نتائج مضللة. نسبة 260/280 لا يشير سلامة الحمض النووي الريبي لذلك فمن المهم لتشغيل العينات في مادة هلامية أو جهاز ميكروفلويديك لتأكيد الحمض النووي الريبي ليست متدهورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتقييم كل من كمية ونوعية في خطوة واحدة ، سيتم تحليل هذه العينات باستخدام نظام Experion الكهربائي الآلي (بيو راد). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أولا ، وعينات الحرارة. بعد ذلك ، رئيس الوزراء ، وتحميل ، ودوامة رقاقة الحمض النووي الريبي Experion. إدراج شريحة في محطة الكهربائي وبدء تشغيل Experion. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد اكتمال تشغيل ، يقوم البرنامج تلقائيا Experion عرض النتائج على شكل جدول مخطط رحلاني النتائج ، (الذي يعرض تركيز الحمض النووي الريبي ، ونسبة الريباسي ، ومؤشر جودة عدد RNA) ، وهلام الظاهرية (التي تبدو مماثلة لRNA التقليدية هلام). والجودة الشاملة عينات الحمض النووي الريبي عالية وعادة ما RQI من 8-10. </لى&gt; </ol> 4. في الوقت الحقيقي PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التحقق من نوعية الحمض النووي الريبي ، والمضي قدما مع ردود الفعل [كدنا]. تستخدم هذه التجربة خطوة واحدة iScript RT - PCR مزيج (بيو راد) من الجمع بين والتوليف [كدنا] PCR في الوقت الحقيقي في واحد رد الفعل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل مزيج الرئيسي يحتوي على جميع المكونات الأخرى من رد فعل القوالب RNA التمهيدي لكل مجموعة ، وتوزيع تلك في لوحة PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد إضعاف الحمض النووي الريبي لتركيز موحدة ، إضافة إلى عينات الحمض النووي الريبي الآبار المناسبة. تم تعيين كل رد فعل حتى في ثلاث نسخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم لوحة ، ووضعه في النظام CFX384 PCR الوقت الحقيقي (بيو راد). حدد البروتوكول المناسب والبدء في تشغيله. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد اكتمال تشغيل ، يتم تحديد الجينات بمقارنة التعبير الجيني للجينات لمصلحة تطبيع الجين في الخلايا المرجعية electroporated مع سيرنا التجريبية لتطبيع نفس الخلايا electroporated مع عنصر تحكم سيرنا. </li></ol> 5. تحليل ضربة قاضية سيرنا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تم رصد التعبير عن CCL17 باستخدام كمية PCR الوقت الحقيقي للتحقيق في دور المنشط في الترانسكربتي STAT6 IL - 4 تحريض تعتمد على CCL17. عن هذه التجربة ، كما تم استخدام GAPDH الجين المرجعية. ويمكن استخدام جينات مرجعية بديلة أو جينات متعددة في إشارة بنفس الطريقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> برنامج إدارة CFX تطبيع تلقائيا CCL17 التعبير ويتم التعبير عن الجينات مرجع من نفس العينة ومقارنة القيم الناتجة تلقائيا تطبيع للسيطرة على العلاجات ببساطة عن طريق اختيار GAPDH ك &quot;مرجع&quot; ومعاملة السيطرة (السيطرة دون سيرنا IL - 4 الاستقراء) كما &quot;السيطرة&quot; في التجربة نافذة إعدادات البرنامج مدير CFX. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> IL - 4 من دون ظل تحريض ، نسخ من CCL17 على المستويات المنخفضة التأسيسية مماثلة لمعاملة السيطرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وأظهرت الخلايا المستحثة مع IL - 4 ، والإبقاء على المسار الطبيعي STAT6 (أي سيطرة أو علاجات سيرنا السيطرة untransfected) 80-10 تحريض حظيرة CCL17 التعبير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وأظهرت الخلايا المستحثة مع IL - 4 ولكن مع التعبير STAT6 تثبطها إدخال إما سيرنا STAT6 سوى حوالي 2 أضعاف التعبير CCL17 من الخلايا uninduced تأكيد دور STAT6 في التعبير IL - 4 الناجم عن CCL17. </li></ol> 6. ممثل النتائج <img src="/files/ftp_upload/1904/1904fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. نظرة عامة على المسار IL - 4 الإشارة. ملزم) من IL - 4 إلى مستقبله يؤدي إلى dimerization وتفعيل STAT6. تنشيط STAT6 translocates إلى النواة وينشط النسخ من الجينات المستهدفة ، مثل CC17. ب) دون IL - 4 التعريفي ، ونسخ من CCL17 تظل عند مستويات منخفضة التأسيسية. C) بعد سيرنا بوساطة إسكات الجين STAT6 ، ينبغي أن المعاملة مع IL4 يؤدي إلى زيادة قليلة أو معدومة في CCL17 التعبير. <img src="/files/ftp_upload/1904/1904fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. تحريض CCL17 بواسطة IL4 تقاس ظروف مختلفة الكمية PCR الوقت الحقيقي. أ) قد نمت دون عينات IL - 4 على مستوى منخفض التأسيسية التعبير بغض النظر عن التعبير الجيني. ب) وردت عينات التحكم كما هو مبين باللون الأخضر والأزرق ، وعادة للعلاج مع IL - 4 ، مع الحث 8-10 حظيرة CCL17. ولكن ، مع خلايا transfected siRNAs استهداف STAT6 ، كما هو موضح باللون الأحمر والوردي ، وتقلص CCL17 التعبير ردا على IL - 4 ، ودعم الفكرة القائلة بأن STAT6 يلعب دورا في التعبير IL - 4 الناجم عن CCL17.

يعمل مقدم البلاغ بيو راد مختبرات التي تنتج الكواشف والأدوات المستخدمة في هذه المقالة.

وقد أثبتت هذه المقالة كيفية electroporate siRNAs إلى الصعب transfect خط التعليق الخلية وكيفية متابعة التعبير الجيني في هذه الخلايا. عندما تفعل هذا الإجراء فإنه من المهم أن نتذكر أن تبقي الأمور كما يتفق ممكن عبر جميع العينات.

using an automated cell counter to simplify gene expression studies: sirna knockdown of il-4 dependent gene expression in namalwa cells

استخدام بوساطة سيرنا ضربة قاضية الجين هو استمرار لتكون أداة مهمة في دراسة التعبير الجيني. وتجري دراسات سيرنا ليس فقط لدراسة آثار downregulating الجينات واحد ، ولكن أيضا لاستجواب مسارات الإشارات وغيرها من شبكات التفاعل المعقد. هذه التحليلات المسار يتطلب كلا من استخدام نماذج ذات الصلة الخلوية والأساليب التي تسبب أقل اضطراب في الفيزيولوجيا الخلوية. ويتزايد Electroporation تستخدم وسيلة فعالة لإدخال سيرنا والأحماض النووية الأخرى إلى الصعب transfect خطوط الخلايا والخلايا الأولية دون تغيير مسار الإشارات قيد التحقيق. هناك عدة خطوات حاسمة لتجربة ناجحة سيرنا ، وهناك طرق لتبسيط العمل وتحسين نوعية البيانات في مراحل تجريبية عدة. لمساعدتك على البدء مع المشروع الخاص بوساطة سيرنا ضربة قاضية الجينات ، وسوف نقوم شرح كيفية إجراء دراسة كاملة عن طريق جمع وفرز الخلايا قبل electroporation من خلال تحليل آخر ترنسفكأيشن PCR الوقت الحقيقي التعبير الجيني. الدراسة التالية تحقق في دور المنشط في الترانسكربتي STAT6 IL - 4 التعبير الجيني تعتمد على CCL17 في خلية سرطان الغدد الليمفاوية بيركيت خط (Namalwa). أثبتت تقنيات مفيدة لطائفة واسعة من سيرنا على أساس التجارب على كل من الخلايا الملتصقة والتعليق. وسوف نعرض أيضا كيفية تبسيط خلية العد مع العداد الآلي TC10 الخلية ، وكيفية electroporate عينات متعددة في وقت واحد باستخدام نظام electroporation MXcell ، وكيفية تقييم واحد RNA نوعية وكمية مع الكهربائي Experion النظام الآلي.

Watch this Scientific Journal Video about Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells at JoVE.com

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

يصف هذا الإجراء سير عمل سريعة وسهلة لإدخال سيرنا إلى الصعب transfect خطوط الخلايا والجينات التي تتبع في الوقت الحقيقي PCR. استخدام عداد الخلية الآلي ، وكذلك لوحة متعددة electroporation ، ومؤتمتة محطة الكهربائي تقديم نتائج سريعة وموثوق بها من دون الحاجة للتعامل مع آلية مكلفة.

باستخدام خلية مكافحة الآلي لتبسيط دراسات التعبير الجيني : ضربة قاضية سيرنا من IL - 4 التعبير الجيني في الخلايا التابعة Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

using-an-automated-cell-counter-to-simplify-gene-expression-studies

Research

JoVE Journal

Biology

15.4K Views.  Bio-Rad Laboratories.  中文 

Video: Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

التحليل الجرثومي التعبير الجيني عن طريق ميكروأرس]

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

التحضير لزراعة الخلايا المكونة للدم الابتدائية من نخاع عظام الفئران لElectroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

الحبل الشوكي الكهربية

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

باستخدام الجينات Electroporation MXcell بولسير النظام لTransfect الخلايا الأولية ذات الكفاءة العالية

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods presented here utilize the green fluorescent protein (gfp) gene for continual monitoring of gene expression in the same pieces of tissues, over time. The gfp gene was placed under regulatory control of different promoters and introduced into lima bean cotyledonary tissues via particle bombardment. Cotyledons were then placed on a robotic image collection system, which consisted of a fluorescence dissecting microscope with a digital camera and a 2-dimensional robotics platform custom-designed to allow secure attachment of culture dishes. Images were collected from cotyledonary tissues every hour for 100 hours to generate expression profiles for each promoter. Each collected series of 100 images was first subjected to manual image alignment using ImageReady to make certain that GFP-expressing foci were consistently retained within selected fields of analysis. Specific regions of the series measuring 300 x 400 pixels, were then selected for further analysis to provide GFP Intensity measurements using ImageJ software. Batch images were separated into the red, green and blue channels and GFP-expressing areas were identified using the threshold feature of ImageJ. After subtracting the background fluorescence (subtraction of gray values of non-expressing pixels from every pixel) in the respective red and green channels, GFP intensity was calculated by multiplying the mean grayscale value per pixel by the total number of GFP-expressing pixels in each channel, and then adding those values for both the red and green channels. GFP Intensity values were collected for all 100 time points to yield expression profiles. Variations in GFP expression profiles resulted from differences in factors such as promoter strength, presence of a silencing suppressor, or nature of the promoter. In addition to quantification of GFP intensity, the image series were also used to generate time-lapse animations using ImageReady. Time-lapse animations revealed that the clear majority of cells displayed a relatively rapid increase in GFP expression, followed by a slow decline. Some cells occasionally displayed a sudden loss of fluorescence, which may be associated with rapid cell death. Apparent transport of GFP across the membrane and cell wall to adjacent cells was also observed. Time lapse animations provided additional information that could not otherwise be obtained using GFP Intensity profiles or single time point image collections.

We report a method for introduction, tracking and quantitative analysis of GFP expression in plant cells. This method utilizes a custom-designed robotics system for semi-continuous image collection from large numbers of samples, over time. We also demonstrate the use of ImageJ and ImageReady for analysis of image series.

الروبوتات والتحليل الديناميكي صورة للدراسات في التعبير الجيني في أنسجة النبات

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

البارافين ، جزءا لا يتجزأ من والمجمدة أقسام ذبابة الفاكهة</emالعضلات الكبار>

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

إعادة إعماره في المختبر من أحدث T. castaneum تيلوميراز

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Preparation of Cell-lines for Conditional Knockdown of Gene Expression and Measurement of the Knockdown Effects on E4orf4-Induced Cell Death

Functional inactivation of gene expression in mammalian cells is crucial for the study of the contribution of a protein of interest to various pathways1,2. However, conditional knockdown of gene expression is required in cases when constitutive knockdown is not tolerated by cells for a long period of time3-5. Here we describe a protocol for preparation of cell lines allowing conditional knockdown of subunits of the ACF chromatin remodeling factor. These cell lines facilitate the determination of the contribution of ACF to induction of cell death by the adenovirus E4orf4 protein6. Sequences encoding short hairpin RNAs for the Acf1 and SNF2h subunits of the ACF chromatin remodeling factor were cloned next to a doxycycline-inducible promoter in a plasmid also containing a gene for the neomycin resistance gene. Neomycin-resistant cell clones were selected in the presence of G418 and isolated. The resulting cell lines were induced by doxycycline treatment, and once Acf1 or SNF2h expression levels were reduced, the cells were transfected with a plasmid encoding E4orf4 or an empty vector. To confirm the specific effect of the shRNA constructs, Acf1 or SNF2h protein levels were restored to WT levels by cotransfection with a plasmid expressing Acf1 or SNF2h which were rendered resistant to the shRNA by introduction of silent mutations. The ability of E4orf4 to induce cell death in the various samples was determined by a DAPI assay, in which the frequency of appearance of nuclei with apoptotic morphologies in the transfected cell population was measured7-9.
The protocol described here can be utilized for determination of the functional contribution of various proteins to induction of cell death by their protein partners in cases when constitutive knockdown may be cell lethal.

Contribution of the ACF chromatin remodeling factor to E4orf4-induced cell death was measured. The protocol includes selection of cell clones in which doxycycline treatment induces conditional knockdown of the ACF subunits Acf1 and SNF2h, and use of the DAPI assay to measure E4orf4-induced cell death in the inducible cell lines.

إعداد خطوط الخليوي لضربة قاضية شرطي في التعبير الجيني وقياس تأثيرات ضربة قاضية على الموت الناتج عن خلية E4orf4

Functional inactivation of gene expression in mammalian cells is crucial for the study of the contribution of a protein of interest to various ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

تحليل الحمض النووي الريبي العالمي التجميعي على مستوى خلية واحدة نقص الأكسجة التالي

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

سيرنا فحص لتحديد اليوبيكويتين واليوبيكويتين مثل المنظمين نظام مقررات تمهيدية البيولوجية في خلايا الثدييات مثقف

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...