1. הכנה ספירת התאים Namalwa <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת תאים מן הבקבוק תרבות צנטריפוגות את התאים גלולה. הסרת תאים supernatant ו resuspend בנפח ידוע של PBS. התאים השתמשו בפרוטוקול זה הם תאים ההשעיה. אם אתה משתמש תאים חסיד תצטרך trypsinize לפני איסוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבוע את מספר תאים חיים, כתם aliquot ההשעיה התא על ידי ערבוב זה 01:01 עם פתרון 0.4% כחול ו 10 trypan pipet μl של התערובת לשקופית של מנייה ולאחר מכן להכניס את השקופית לתוך התא TC10 האוטומטית לדלפק (Bio-Rad Laboratories, Inc). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מונה TC10 תא פוקוס אוטומטי יהיה להבטיח את הספירה המדויקת ביותר, ולאחר מכן להמשיך לספור. הוא קובע באופן אוטומטי את הצפיפות של תאים חיים ותאים הכולל במדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר להציג תמונה להציג את התאים על מרקע. לאחר מכן בחר את המחשבון דילול יש הדלפק תא TC10 לחשב באופן אוטומטי את כמות התערובת התא יהיה צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניסוי זה היא באמצעות מסך של שלושה siRNAs: אחד siRNA השליטה ושני siRNAs שונה מיקוד הגן STAT6, בתוספת שולטת untransfected. זה דורש 3.6 מ&quot;ל בריכוז הסופי של 5 X 10 6 תאים לכל מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן את הריכוז הרצוי וערכים נפח הסופי לתוך המחשבון הדילול, והיא מחשבת את נפח תא ההשעיה צורך על בסיס לספור את תא חי למדגם זה. לחילופין, לבצע את החישוב באופן ידני. ואז להעביר את נפח הנדרש תערובת תאים לניסויים אלה לתוך צינור חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין תערובות התא גלולה התאים ולהסיר את כל PBS. Resuspend ב 3.6 מ&quot;ל של חיץ Pulser electroporation ג&#39;ין (Bio-Rad Laboratories). העברת 800 aliquots μl לתוך צינורות המכילים את siRNAs המתאים ומערבבים בעדינות. התאים מוכנים כעת עבור electroporation. </li></ol> 2. Electroporating התאים 96-גם צלחות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת 96-electroporation גם מאפשר משכפל עבור כל ארבעת הטיפולים electroporated להיות ביחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 150 μl של השעיה התא לתוך בארות המתאים צלחת electroporation 96-היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את הצלחת הקאמרית צלחת electroporation MXcell ולסגור את המכסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Electroporate באמצעות הגדרות מותאמות לקו התא חיץ בשימוש. תאים אלה הם electroporated באמצעות גל דעיכה מעריכית עם הגדרות המכשיר של 250 V, 350 μF, ו 1000 התנגדות Ω. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר electroporation תושלם, פיפטה למעלה ולמטה בעדינות היטב כל לערבב ולאחר מכן להעביר תאים לצלחת רקמה תרבות המכילה מראש חימם התקשורת. תאים Namalwa מגדלים RPMI (Life Technologies) בתוספת 7.5% ו FCS pyruvate 1%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות בקרה שלא היה electroporated לקוחים ההשעיה תא הנותרים נוספו מנות התרבות של המדיום מראש חימם תרבות זהה את התאים electroporated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים דגירה לילה בשעה 37 ° C עם 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות, קבוצה אחת של תאים הושרה עם ריכוז 10 סופי ng / ml IL-4 רקומביננטי (R &amp; D מערכות). הסט השני של תאים לשלוט רק לקבל מדיה נוספים. כל התאים מודגרת 24 שעות נוספות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li></ol> 3. חלץ ולבדוק RNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר סך של 48 שעות של צמיחה, ספירת התאים היטב כל אחד, העברה חד aliquot מכל טוב צינור microfuge להפקת RNA, הקפאת aliquot השני ניתוח חלבון המערבי סופג או אחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות גלולה התאים, ולאחר מכן להסיר למחוק את supernatant מצינור אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך מיצוי RNA. אנחנו בדרך כלל להשתמש RNA סך אאורום Kit (Bio-Rad) על פי פרוטוקול כלל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר ניטור מציאה בתיווך siRNA גן חשוב במיוחד כדי לאמת את איכות RNA RNA מושפל כי ייתן תוצאות מטעה. יחס 260/280 אינו מציין שלמות RNA ולכן חשוב להפעיל את דוגמאות על ג&#39;ל או מכשיר microfluidic לאשר RNA אינם מושפל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להעריך הן איכות וכמות בצעד אחד, דגימות אלה ינותחו באמצעות מערכת אוטומטית Experion אלקטרופורזה (Bio-Rad). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, דגימות חום. לאחר מכן, הממשלה, עומס, והמערבולת שבב RNA Experion. הכנס את השבבים לתוך התחנה אלקטרופורזה Experion ולהתחיל לרוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ריצה תושלם, התוכנה תציג תוצאות Experion אוטומטית בצורת טבלה, electropherogram התוצאות (המציג ריכוז RNA, יחס ריבוזומלי, ומספר מדד איכות RNA), וכן ג&#39;ל וירטואלית (אשר דומה ל-RNA המסורתית ג&#39;ל). איכות גבוהה הכולל דגימות רנ&quot;א יהיו בדרך כלל בעלי RQI של 8-10. </li&gt; </ol> 4. בזמן אמת PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר בדיקת איכות RNA, להמשיך עם התגובות cDNA. בניסוי זה השתמשו צעד אחד iScript RT-PCR לערבב (Bio-Rad) לשלב סינתזה cDNA בזמן אמת PCR בתגובה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תערובת מאסטר המכיל את כל מרכיבי התגובה מלבד תבניות רנ&quot;א עבור כל קבוצה פריימר, ולהפיץ אותם לתוך הצלחת PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דילול RNA ריכוז אחידה, מוסיפים את דגימות רנ&quot;א של בארות המתאים. התגובה של כל מוגדר בשלושה עותקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את הצלחת, ולמקם אותו לתוך מערכת CFX384 PCR בזמן אמת (Bio-Rad). בחר את הפרוטוקול המתאים ולהתחיל לרוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ריצה תושלם, ביטוי גנים נקבע על ידי השוואת ביטוי הגנים של הגן של עניין מנורמל לגן התייחסות בתאים electroporated עם siRNA ניסיוני לנורמליזציה זהה של תאים electroporated עם שליטה siRNA. </li></ol> 5. ניתוח מציאה siRNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הביטוי של CCL17 היה פיקוח באמצעות כמותי בזמן אמת PCR לחקור את תפקידם של activator תעתיק STAT6 ב אינדוקציה IL 4 תלויי של CCL17. לצורך ניסוי זה, GAPDH שימש הגן התייחסות. גנים התייחסות חלופית או גנים מרובים התייחסות ניתן להשתמש באותו אופן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוכנת מנהל CFX מנורמל אוטומטית CCL17 ביטוי הביטוי של הגן התייחסות מן המדגם אותו בהשוואה אוטומטית את ערכי מנורמל כתוצאה לשלוט טיפולים פשוט על ידי בחירת GAPDH כמו &quot;התייחסות&quot; ואת הטיפול שליטה (siRNA לשלוט ללא אינדוקציה IL-4) כמו &quot;שליטה&quot; בחלון ההגדרות של התוכנה בניסוי מנהל CFX. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללא IL-4 אינדוקציה, שעתוק של CCL17 נשאר, רמות נמוכות מכוננת להשוות טיפול הביקורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים המושרה עם IL-4 ושמירה על מסלול נורמלי STAT6 (כלומר, siRNA שליטה או טיפולים מלאה untransfected) הראה 80-10 אינדוקציה לקפל הביטוי CCL17. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים המושרה עם IL-4 אבל עם ביטוי STAT6 מעוכבים על ידי הקדמה של siRNA STAT6 גם הראו ביטוי CCL17 רק על פי 2 גבוה יותר מאשר התאים uninduced המאשרת את תפקידו של STAT6 את הביטוי IL 4-Induced של CCL17. </li></ol> 6. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/1904/1904fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. סקירה כללית של מסלול IL-4 איתות. א) הכבילה של IL-4 לקולטן שלו מוביל dimerization והפעלה של STAT6. הופעל STAT6 translocates לגרעין ומפעיל שעתוק של גנים היעד שלה, כמו CC17. ב) בלי אינדוקציה IL-4, שעתוק של CCL17 יישארו, רמות נמוכות מכוננת. ג) לאחר השתקת siRNA בתיווך של הגן STAT6, הטיפול עם IL4 צריך להוביל להגדיל מעט או ללא בביטוי CCL17. <img src="/files/ftp_upload/1904/1904fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. אינדוקציה של CCL17 ידי IL4 נמדד על ידי תנאים שונים על ידי PCR כמותי זמן אמיתי. א) דוגמאות גדל ללא IL-4 הייתה רמה נמוכה של ביטוי מכוננת קשר של ביטוי גנים. ב) כפי שמוצג ירוק וכחול, דגימות בקרה הגיבו כלל לטיפול עם IL-4; עם גיוס של 8-10 לקפל CCL17. עם זאת, תאים transfected עם siRNAs מיקוד STAT6, באדום, ורוד, פחתה CCL17 ביטוי בתגובה IL-4, התומכים ברעיון STAT6 תפקיד הביטוי IL 4-Induced של CCL17.

הכותב הוא מועסק על ידי Bio-Rad Laboratories המייצרת ריאגנטים ומכשירים המשמשים במאמר זה.

מאמר זה הוכיח כיצד electroporate siRNAs לתוך קשה transfect התא קו ההשעיה וכיצד לעקוב אחר התבטאות גנים בתאים אלה. כאשר עושים את זה הליך זה חשוב לזכור לשמור את הדברים כפי עקבי ככל האפשר בכל הדגימות.

using an automated cell counter to simplify gene expression studies: sirna knockdown of il-4 dependent gene expression in namalwa cells

השימוש מציאה בתיווך siRNA הגן ממשיך להיות כלי חשוב במחקרים של ביטוי גנים. מחקרים siRNA נערכות לא רק כדי לחקור את ההשפעות של downregulating גנים בודדים, אלא גם כדי לחקור מסלולי איתות ושאר רשתות אינטראקציה מורכבת. ניתוחים אלה דורשים מסלול הן את השימוש במודלים הסלולר רלוונטי ושיטות שגורמים ההפרעות פחות הפיזיולוגיה התאית. Electroporation הוא יותר ויותר בשימוש כדרך יעילה להציג siRNA וחומצות גרעין אחרים לתוך קשה transfect שורות תאים תאים ראשוניים מבלי לשנות את מסלול איתות תחת חקירה. ישנם שלבים קריטיים מרובים ניסוי מוצלח siRNA, ויש דרכים לפשט את העבודה תוך שיפור איכות הנתונים בשלבים ניסיוניים מספר. כדי לעזור לך להתחיל עם הפרויקט שלך siRNA בתיווך גן מציאה, נדגים כיצד לבצע מחקר מסלול שלם של איסוף ספירת התאים לפני electroporation דרך transfection הודעה בזמן אמת, ניתוח גנטי PCR הביטוי. המחקר הבא חוקר את תפקידם של activator תעתיק STAT6 בביטוי IL-4 גנים תלויים של CCL17 של קו תא לימפומה Burkitt (Namalwa). טכניקות הפגינו שימושיים עבור מגוון רחב של siRNA מבוססי ניסויים חסיד והן תאים ההשעיה. אנו גם להראות כיצד לייעל את התא לספור עם דלפק תא TC10 האוטומטית, כיצד electroporate דגימות בו זמנית באמצעות מערכת electroporation MXcell, ואיך בו זמנית להעריך איכות וכמות RNA עם מערכת אוטומטית Experion אלקטרופורזה.

Watch this Scientific Journal Video about Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells at JoVE.com

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

הליך זה מתאר את זרימת עבודה קלה ומהירה להציג siRNA לתוך קשה transfect שורות תאים ופעל ביטוי גנים על ידי ה-PCR בזמן אמת. שימוש נגד תא אוטומטי, רב גם צלחת electroporation, ותחנת אלקטרופורזה אוטומטיות לספק תוצאות מהיר ואמין ללא צורך בטיפול רובוטית יקר.

שימוש מונה תא אוטומטי כדי לפשט את הביטוי מחקרים ג&#39;ין: siRNA מציאה הביטוי IL 4-Gene תלויים תאים Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

using-an-automated-cell-counter-to-simplify-gene-expression-studies

Research

JoVE Journal

Biology

15.4K Views.  Bio-Rad Laboratories.  中文 

Video: Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Gene Expression חיידקית ניתוח שימוש microarrays

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

הכנת ראשי בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine עבור electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

חוט השדרה Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

שימוש ג&#39;ין Pulser מערכת MXcell electroporation כדי Transfect תאים ראשוניים עם יעילות גבוהה

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods presented here utilize the green fluorescent protein (gfp) gene for continual monitoring of gene expression in the same pieces of tissues, over time. The gfp gene was placed under regulatory control of different promoters and introduced into lima bean cotyledonary tissues via particle bombardment. Cotyledons were then placed on a robotic image collection system, which consisted of a fluorescence dissecting microscope with a digital camera and a 2-dimensional robotics platform custom-designed to allow secure attachment of culture dishes. Images were collected from cotyledonary tissues every hour for 100 hours to generate expression profiles for each promoter. Each collected series of 100 images was first subjected to manual image alignment using ImageReady to make certain that GFP-expressing foci were consistently retained within selected fields of analysis. Specific regions of the series measuring 300 x 400 pixels, were then selected for further analysis to provide GFP Intensity measurements using ImageJ software. Batch images were separated into the red, green and blue channels and GFP-expressing areas were identified using the threshold feature of ImageJ. After subtracting the background fluorescence (subtraction of gray values of non-expressing pixels from every pixel) in the respective red and green channels, GFP intensity was calculated by multiplying the mean grayscale value per pixel by the total number of GFP-expressing pixels in each channel, and then adding those values for both the red and green channels. GFP Intensity values were collected for all 100 time points to yield expression profiles. Variations in GFP expression profiles resulted from differences in factors such as promoter strength, presence of a silencing suppressor, or nature of the promoter. In addition to quantification of GFP intensity, the image series were also used to generate time-lapse animations using ImageReady. Time-lapse animations revealed that the clear majority of cells displayed a relatively rapid increase in GFP expression, followed by a slow decline. Some cells occasionally displayed a sudden loss of fluorescence, which may be associated with rapid cell death. Apparent transport of GFP across the membrane and cell wall to adjacent cells was also observed. Time lapse animations provided additional information that could not otherwise be obtained using GFP Intensity profiles or single time point image collections.

We report a method for introduction, tracking and quantitative analysis of GFP expression in plant cells. This method utilizes a custom-designed robotics system for semi-continuous image collection from large numbers of samples, over time. We also demonstrate the use of ImageJ and ImageReady for analysis of image series.

רובוטיקה ניתוח תמונה דינאמית ללימודים של ביטוי גנים ברקמות הצמח

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

מדורים פרפין-Embedded קפואים של תסיסנית סקס שרירים

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

ב הכינון במבחנה של ט פעילים castaneum שהטלומרז

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Preparation of Cell-lines for Conditional Knockdown of Gene Expression and Measurement of the Knockdown Effects on E4orf4-Induced Cell Death

Functional inactivation of gene expression in mammalian cells is crucial for the study of the contribution of a protein of interest to various pathways1,2. However, conditional knockdown of gene expression is required in cases when constitutive knockdown is not tolerated by cells for a long period of time3-5. Here we describe a protocol for preparation of cell lines allowing conditional knockdown of subunits of the ACF chromatin remodeling factor. These cell lines facilitate the determination of the contribution of ACF to induction of cell death by the adenovirus E4orf4 protein6. Sequences encoding short hairpin RNAs for the Acf1 and SNF2h subunits of the ACF chromatin remodeling factor were cloned next to a doxycycline-inducible promoter in a plasmid also containing a gene for the neomycin resistance gene. Neomycin-resistant cell clones were selected in the presence of G418 and isolated. The resulting cell lines were induced by doxycycline treatment, and once Acf1 or SNF2h expression levels were reduced, the cells were transfected with a plasmid encoding E4orf4 or an empty vector. To confirm the specific effect of the shRNA constructs, Acf1 or SNF2h protein levels were restored to WT levels by cotransfection with a plasmid expressing Acf1 or SNF2h which were rendered resistant to the shRNA by introduction of silent mutations. The ability of E4orf4 to induce cell death in the various samples was determined by a DAPI assay, in which the frequency of appearance of nuclei with apoptotic morphologies in the transfected cell population was measured7-9.
The protocol described here can be utilized for determination of the functional contribution of various proteins to induction of cell death by their protein partners in cases when constitutive knockdown may be cell lethal.

Contribution of the ACF chromatin remodeling factor to E4orf4-induced cell death was measured. The protocol includes selection of cell clones in which doxycycline treatment induces conditional knockdown of the ACF subunits Acf1 and SNF2h, and use of the DAPI assay to measure E4orf4-induced cell death in the inducible cell lines.

הכנה של קווים סלולריים למציאה מותנית של ביטוי גנים ומדידה של השפעות על מציאת מות תאי E4orf4-induced

Functional inactivation of gene expression in mammalian cells is crucial for the study of the contribution of a protein of interest to various ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

ניתוח של גלובל RNA סינתזה ברמת התא בודד הבאות היפוקסיה

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

הקרנת siRNA לזיהוי יוביקוויטין ורגולטורים מערכת דמויות יוביקוויטין של מסלולים ביולוגיים בתאי יונקים בתרבית

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...