وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من البحوث للوقاية من العمى (جوائز التطوير الوظيفي لMEZ وASV ومنحة غير مقيد إلى قسم العيون) ، ومؤسسة ماتيلدا E. زيغلر (MEZ وASV) والمعهد الوطني للعيون / المعاهد الوطنية للصحة (MEZ والمنح وR01EY015748 R01EY017964).

الجزء الأول مجموعة المتابعة للالفحص ACT <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توج توليد الحمض النووي الريبي للحقن كما اقترح من قبل الشركة المصنعة ، وذلك باستخدام الفينول منها : طريقة تنقية كلوروفورم (مثل mMessage mMachine كيت ؛ النظم البيولوجية التطبيقية / Ambion ، أوستن ، تكساس). ويستخدم الحمض النووي الريبي الترميز بروتين فلوري باعتبارها المذنبة. نحن تدوين بروتين فلوري إما أصفر (YFP) أو mCherry 5 [كدنا] ، الذي هو في تعبير pCS2 ناقلات +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب أنابيب الزجاج البورسليكات الشعرية لتشكيل الزجاج نصائح مدبب باستخدام مجتذب micropipette. نستخدم سوتر Micropipette بولير ، P - 97 (سوتر الآلات ، وشركة ، نوفاتو ، كاليفورنيا) ، كما هو موضح سابقا 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل الحلول العقيمة في الجدول رقم 1 من 10 X مارك في لرينغر التعديل (MMR) حل سهم (10 ملي MgCl 2 و 20 ملي بوكل ، و 20 ملي CaCl 2 ؛ HEPES ملي 50 ؛ 1 م كلوريد الصوديوم ؛ تعديلها لدرجة الحموضة 7.5 ، تعقيمها وتخزينها في RT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل الخصيتين من الضفادع الذكور وتخزين الأنسجة عند درجة 4 في محلول معقم من لقاح MMR 1X / جنتاميسين (50 ميكروغرام / مل سلفات الجنتاميسين ؛ BioWhittaker ، القط # 17 - 518Z). يمكن القيام بذلك حتى قبل أسبوع من بدء التجربة لكنه يفقد فعاليته مع مرور الوقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن إجراء باعتبارها 8X الأسهم ، والتي ؛ : الحل البيض (7.6 درجة الحموضة تعديلها لكلوريد الصوديوم 150 ملم ، 2.62 ملم بوكل ، 0.8 ملي نا 2 هبو 4 و 20 ملي Trizma القاعدة ، 2.62 ملي NaHCO 3 و 4 ملي 2.75 MgSO 1X) يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية لمدة تصل الى أسبوعين. ملاحظة : احترس من التلوث في هذا الحل ، لأن هذا سوف يؤثر على نوعية البيض الخاص بك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء لوحات الحقن. للقيام بذلك ، ذوبان agarose 1 ٪ في معدل وفيات الأمهات 0.4X في الميكروويف ، إضافة ~ 6 مل حل agarose ذاب في لوحات عيار 60 ملم ، انبسط بلطف an العفن الاستومر (الشكل 1) على رأس من الحل لمنع الفقاعات والسماح لتبرد لحوالي 20 دقيقة في RT. لتحديد العدد المطلوب ، والنظر في عدد من الظروف التجريبية (مثل 1 ، YFP ؛ 2 ، YFP + رأس) ، ويحتاج إلى عدد من الأجنة المضيفة المزروعة. لتجاربنا ، ونحن لا يقل عن 20 توليد اجنة المضيف المزروعة لكل حالة تجريبية. في 18-19 وسوف درجة مئوية ، وتكون الأجنة في هذه المرحلة 15 لمدة ساعة تقريبا. إذا كان يستغرق ساعة واحدة لتنفيذ 20 عملية زرع ، ثم هناك حاجة إلى نقطتين وقت الإخصاب ، على افتراض الأجنة المضيفة قبول جميع عمليات زرع. ولذلك ، ستكون هناك حاجة أطباق الحقن الأربعة (2 × ظروف عملي وقت الإخصاب 2 نقطة = 4). تخزين لوحات في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء لوحات العزل باستخدام غطاء + 1 ٪ agarose 0.7X MMR مع قوالب بالنسبة للوحة الحقن. جعل العدد نفسه من العزلة سقف لوحات الحقن زائد واحد في الوقت الاضافي التسميد نقطة (4 + 2 نقطة التسميد الوقت = 6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن الإناث مع 500 وحدة موجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية في وقت متأخر من يوم قبل يوم microinjection. الإناث في مخزن 16-18 درجة مئوية خلال الليل. </li></ol> الجزء الثاني. RNA Microinjection الأجنة المورق القيطم ألف التحضير لmicroinjection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الإناث يسببها هرمونيا ووضعها في خزانات تحتوي على الفرد 1X حل البيض (ELS) ملاحظة : نحن لا نستخدم البيض الذي تم في ELS أكثر من ساعتين كما هو انخفاض جودة البيض. لذلك ، قبل نحو ساعة من التخصيب في المختبر ، ونحن تجاهل كل البيض من خزان بحيث يتم جمع البيض الطازج وضعت فقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الإبرة لmicroinjection بواسطة القص قبالة الطرف للحصول على قطر 25-35 ميكرومتر. وضع الإبرة على لpicoinjector ومعايرتها بحيث يوزع 10 في NL الحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مجموعة حاضنة إلى 14 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة وضعت الإناث البيض للإزالة ، على بعد حوالى ساعة من البيض من الدبابة باستخدام ماصة نقل ووضعها في أطباق بتري 60 مم. كما ELS إزالة الكثير من البيض واستبدالها ممكن مع 1X MMR. ويمكن إخصابها البيض على الفور أو البقاء في MMR 1X لمدة تصل إلى ساعة واحدة. لمقايسة زرع ، فمن الأفضل أن يخصب طبقين ، و 80 ٪ كاملة من طبقة واحدة من البيض في مدة تصل إلى ثلاث دفعات منفصلة عند حوالي الساعة 11 صباحا وظهرا ومساء 1. بعد الحقن ، سيتم وضعها في 14 درجة مئوية بحيث أنها ستنمو الى المراحل المطلوبة لعزل غطاء (مرحلة 8،5-9) وزرع (المرحلة 15 ، وانظر الجزء الأول ، # 6 أعلاه). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتحقق من جودة الخصيتين ، ونحن إجراء التلقيح في الصباح الباكر (~ 08:00) ، والذي يسمح لنا لاستخراج الخصيتين من جهة اخرى ذكر إذا كان من أول الحيوانات المنوية ليست قابلة للحياة. ملاحظة : نحن التجانس ~ 0.25 في الخصيتين MMR 1X 1 مل وإضافة ما يقرب من 5-7 نقاط لكل لوحة من البويضات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في المختبر تخصيب البويضات مع الخصيتين المتجانس ، وبعد ساعة ، وإزالة الطبقة الهلامية على البيض باستخدام دي هلام الحل (DTT 164μl 1M + 10ML 1M تريس ، ودرجة الحموضة 8.8 إلى 50 مل من الماء nanopure تعقيمها). انتظر حتى تصل إلى عامين لتبدأ مرحلة الخلية والفرز ، والذي يستغرق حوالي 2 ساعة على 18 درجة مئوية أو 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة (22 درجة مئوية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام transfإيه ماصة ، مصطبغة فرز الأجنة بشكل موحد وتقسيم بالتساوي ، كما هو مبين في الغطاء الحيواني اليسار في الشكل 3 ، في بئر حقن طبق مليء Ficoll + 0.4X MMR 6 ٪. </li></ol> باء Microinjection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Parafilm تمتد فوق الجزء العلوي من غطاء 60 مم طبق بيتري. ماصة 2 ميكرولتر من عينة الحمض النووي الريبي الخاص لأول مرة في Parafilm ونضح باستخدام PLI - 100 لملء الخاص إبرة الحقن. تأكد من التحقق من أن الإبرة الاستغناء NL يزال 10 من العينة قبل البدء في الحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن الأجنة 20-30 مرحلتين الخلية (سواء blastomeres) مع 500 RNA YFP بيكوغرام في صحن واحد والجين اهتمامكم (على سبيل المثال 20 بيكوغرام رأس RNA) ، بالإضافة إلى RNA YFP في طبق آخر 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100-200 مكان غير حقن الأجنة في نقطة زمنية أخرى في طبق مع حقن محلول Ficoll. نقلها داخل وخارج الحاضنة في نفس الوقت مع حقن الأجنة. هذه هي يستضيف لاستخدامها في الجزء الرابع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحقن ، واحتضان جميع الأجنة عند 14 درجة مئوية خلال الليل. أكرر للجميع نقاط الوقت. </li></ol> الجزء الثالث. عزل قبعات من أجنة الحيوانات حقن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يصل في وقت مبكر من صباح اليوم إلى مرحلة الأجنة. ينبغي أن تكون نقطة أقرب وقت ممكن في مرحلة 9. إزالة تلك التي لم تنج. المضي قدما في الخطوات التالية العمل مع كل نقطة في الوقت دفعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخلصي من حل Ficoll من كل لوحة وإضافة MMR 0.7X الخلفي / حل الجنتاميسين. لسقف صحن العزلة ، إضافة كمية سخية من حل MMR / جنتاميسين 0.7X. طرد الأجنة من آبارهم طبق الحقن باستخدام ماصة نقل ومكان في صحن سقف العزلة الطازجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبعات عزل الحيوانات في حل MMR 0.7X + جنتاميسين ، وحفظ أو 2 أو 3 أجنة سليمة لتنظيمه. ويمكن استخدام إما Gastromaster ، مزودة تلميح عازمة الأصفر إلى 400 ميكرون ، أو زوج من حاد ملقط 5 العدد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع القبعات مرة في 14 درجة مئوية حاضنة حتى اليوم التالي. يجب إزالة الأجنة المضيف من الحاضنة في الوقت نفسه للحفاظ على القبعات في هذه المرحلة التنموية نفس الأنسجة المانحة. </li></ol> الجزء الرابع. زرع القبعات على الخاصرة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة القبعات والأجنة من نقطة لأول مرة من الحاضنة 14 درجة مئوية ومرحلة الأجنة. الفرز للقبعات موحدة الفلورسنت إيجابية أصفر أو أحمر ، اعتمادا على حقن التتبع (الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب عدد من القبعات وإزالة مضاعفة عدد الأجنة لمرحلة 12-13 طبق حقن الطازجة مع MMR 0.7X / حل الجنتاميسين. بالملقط # 5 حادة ، وإزالة الغشاء المحي من كل. نقلها إلى اللوحة مع القبعات ، ولكن كن حذرا. دون أغشية المحية بها ، يمكن فصل الأجنة بسرعة على سطح الماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام gastromaster (نصيحة الصفراء ، والأسلاك 200 250μm عازمة ، أعلى الإعداد) أو # 5 الملقط ، إزالة 200 ميكرومتر مربع على جانب من الأجنة في مرحلة 14-15 (الشكل 3). ثم ، وخفض سقف في نصف (مع gastromaster أو ملقط # 5) ومكان النسيج في الحفرة التي أدلي بها في الجنين المضيف. تدوير الجنين ضد البئر للسماح للشفاء. كما تفعل ذلك لأجنة كثيرة كما يمكنك أثناء وجودهم في المرحلة 15. أكرر للجميع نقاط الوقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وسوف تلتئم الجنين عادة في غضون 30 دقيقة. إزالة الخلايا الميتة (أبيض) مع اقتراح لطيف بالفرشاة مع ملقط # 5. بزراعتها في 18 درجة مئوية خلال الليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت المجهر مضان تشريح والأجنة الفرز مع الأنسجة ، fluorescently المسمى المزروعة. وضعها من جديد في 18 درجة مئوية إلى النمو حتى مرحلة 42-43. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الحيوانات في tricaine. عند هذه النقطة ، يمكنك التقاط الصور تحت المجهر مضان تشريح. بعد الانتهاء ، الإصلاح ، والقسم immunostain أو تنفيذ في الموقع التهجين باستخدام علامات للأنسجة اهتمامك. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. تصميم شبكي لصب القالب الاستومر التي تستخدم في صنع أطباق عقد الجنين. A 38 × 38 ملم ذهابا ويحشر مربع (~ 5 ملم العميق) تم توجيهها من قطعة من زجاج شبكي أن 50 × 50 ملم مربع و 25 مم. وقد تم حفر دائرية ، وحفر الآبار متباعدة بشكل متساو (1.5 مم) 1 ملم عمق البلاستيك. لجعل العفن الاستومر للأطباق microinjection ، تدفقت علينا الاستومر Sylgard في زجاج شبكي وسمح لها لترسيخ ، وفقا لتعليمات الصانع. ويستخدم هذا القالب لجعل الاستومر الحقن وألواح العزل الغطاء. <img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. قبعة الحيوانية الفرز قبل الزرع هو المهم ، كما يمكن أن يختلف التعبير. قبعة الحيوان على اليسار عن mCherry بالتساوي في جميع أنحاء الأنسجة بينما يزدرع على حق التعبير ومتقطعا ، وسوف يتم التخلص منها. <img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. مضيف tadpوقد وضعت أوله بنية تشبه العين على حدودها من زرع الخلايا الحيوانية سقف ، وقد overlayed صورة الفلورسنت على الصورة brightfield.

<ol>
	<li>Smith, W. C., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+cloning+of+noggin,+a+new+dorsalizing+factor+localized+to+the+Spemann+organizer+in+Xenopus+embryos.">Expression cloning of noggin, a new dorsalizing factor localized to the Spemann organizer in Xenopus embryos.</a> Cell. 70, 829-840 (1992).</li><li>Lamb, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+induction+by+the+secreted+polypeptide+noggin.">Neural induction by the secreted polypeptide noggin.</a> Science. 262, 713-718 (1993).</li><li>Green, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Methods+in+Developmental+Biology:+Xenopus+&#38;+Zebrafish.">Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus &#38; Zebrafish.</a> Methods in Developmental Biology. , (1999).</li><li>Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+eyes+from+pluripotent+cells.">Generation of functional eyes from pluripotent cells.</a> PLoS Biol. 7, e1000174-e1000174 (2009).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2, 905-909 (2005).</li><li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+patch-pipettes+and+sharp+electrodes+with+a+programmable+puller.">Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Lan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noggin+Elicits+Retinal+Fate+in+Xenopus+Animal+Cap+Embryonic+Stem+Cells.">Noggin Elicits Retinal Fate in Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cells. , (2009).</li></ol>

في هذا الفيديو ، لقد أثبتنا لدينا نسخة من التقنيات التي يستخدمها علماء البيولوجيا الكلاسيكية القيطم ، ونحن ترتيبها لخلق غطاء زرع فحص الحيوانات. في درجة حرارة الغرفة ، والأجنة القيطم تتطور بسرعة كبيرة من خلال المراحل 9 و 15. عن طريق وضعها في 14 درجة مئوية وتباط?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>mMessage mMachine SP6 Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Applied Biosystems/Ambion</td>
<td>AM1340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Borosilicate Capillary Tubes (1.0mm OD x 0.5mm ID)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FHC, Inc</td>
<td>27-30-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sutter Micropipette Puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments, Inc.</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gentamicin sulfate [50 mg/ml]</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BW17-528Z</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sylgard/elastomer Kit 1.1lb</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>NC9644388</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>60 x 15 mm polystyrene petri dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USA Scientific</td>
<td>8609-0160</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>human chorionic gonadotropin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Intervet</td>
<td>22219</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pico-Injector Microinjection Systems</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>650003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Torrey Pines Scientific ECHOtherm Incubator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>11-680-21</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Transfer pipette</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Krackeler</td>
<td>6290-20635A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumostar #5 Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>11295-10</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

tissue determination using the animal cap transplant (act) assay in xenopus laevis

العديد من البروتينات تلعب دورا مزدوجا في التطور الجنيني. يمكن لتلك التي تنظم تقرير مصير الخلية في الأنسجة محددة تؤثر أيضا على تطوير أكبر منطقة جنين. هذا ما يجعل تحديد دورها في نسيج خاص يجعل من الصعب تحليلها. على سبيل المثال ،<em&gt; رأس</em&gt; في overexpression<em&gt; القيطم المورق</em&gt; الأجنة يؤدي التوسع في المنطقة الأمامية بأكملها ، بما في ذلك العين<sup&gt; 1،2</sup&gt;. من هذه النتيجة ، ليس معروفا ما إذا كان رأس يلعب دورا مباشرا في تحديد العين أو التي تسبب توسعا في الأنسجة العصبية ، ويؤثر بشكل غير مباشر تشكيل رأس العين. وجود هذا النمط الظاهري المعقدة تجعل الدراسة في العين الخاصة دور في تقرير مصير الخلايا الصعب تحليلها. طورنا مقايسة أن يتغلب على هذه المشكلة. الاستفادة من الطبيعة المحفزة لل<em&gt; القيطم المورق</em&gt; الحيوان قبعة<sup&gt; 3</sup&gt; ، طورنا مقايسة لاختبار قدرة المنتج الجين (ق) ، مثل<em&gt; رأس</em&gt; أو عوامل النسخ العين الميدان (EFTFs) ، لتحويل مباراة دولية في أنسجة معينة أو أنواع الخلايا عن طريق زرع هذا النسيج على الجانب الجنين<sup&gt; 4</sup&gt;. في حين أننا وجدنا معاملة إما بروتين رأس أو مجموعة من عوامل النسخ يمكن تحديد مصير الخلايا الشبكية في مباراة الحيوان ، يمكن أن تستخدم هذا الإجراء لتحديد الجين المنتج (ق) المشاركة في تحديد الأنسجة الأخرى كذلك.

Watch this Scientific Journal Video about Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis at JoVE.com

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

يتم زرع الجينات الحيوانية القبعات overexpressing منتج (ق) إلى الجهة تطوير<em&gt; القيطم المورق</em&gt; أجنة من أجل تحديد ما إذا كان يتم تحديد الأنسجة.

تحديد الأنسجة باستخدام زرع رسملة الحيوان (ACT) في الفحص القيطم المورق</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

tissue-determination-using-animal-cap-transplant-act-assay-xenopus

Research

JoVE Journal

Biology

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

12.1K Views.  SUNY Upstate Medical University. يتم زرع الجينات الحيوانية القبعات overexpressing منتج (ق) إلى الجهة تطوير القيطم المورق أجنة من أجل تحديد ما إذا كان يتم تحديد الأنسجة.

Video: Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

This video demonstrates the technique used for preparation of organizer and animal pole explants from Xenopus laevis embryos, including the use of the eyebrow knife - a specialized dissection tool made of one's eyebrow. The protocol for assembling an adhesion assay is also given, which probes for the presence of key adhesion molecules present on the surface organizer or animal pole cells that are critical for proper development.

تشريح المنظم وExplants القطب الحيواني من أجنة القيطم المورق وجمعية خلية الفحص الالتصاق

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

البلاستيك وتضمينها Sectioning الجنين المورق القيطم

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

الحصول على البيض من الإناث المورق القيطم

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

إعداد والتقطير من البيض مقتطفات القيطم المورق

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microinjection من البويضات المورق القيطم

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Mammary Epithelial Transplant Procedure

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, followed by the mammary epithelial transplant procedure. The mammary transplant procedure is widely used by mammary biologists because it takes advantage of the fact that significant development of the mammary epithelium doesn't occur until after puberty. At 3 weeks of age, growth of the mammary epithelial tree is confined to the vicinity of the nipple and the fat pad is largely devoid of mammary epithelium, but by 7 weeks of age the epithelial ductal tree extends throughout the entire fat pad. Therefore, if this small portion of the fat pad containing epithelium, the region between the nipple and the lymph node, is removed at 3 weeks of age, the endogenous epithelium will never populate the mammary fat pad and the fat pad is described as "cleared". At this time, mammary epithelium from another source can be transplanted in the cleared fat pad where it has the potential to extend mammary ductal trees through out the fat pad. This procedure has been utilized in many experimental models including the examination of tumor phenotype in transgenic mammary epithelial tissue without the confounding effects of genotype on the entire animal3, in the identification of mammary stem cells by transplanting cells in limited dilution4,5, determining if hyperplastic nodules proceed to mammary tumors6, and to assess the effect of prior hormone exposure on the behavior of the mammary epithelium7,8.
Three week old host mice are anesthetized, cleaned and restrained on a surgical stage. A mid-sagittal incision is made through the skin, but not the peritoneum, extending from the pubis to the sternum. Oblique cuts are made through the skin from the mid-sagittal incision across the pelvis toward each leg. The skin is pulled away from the peritoneum to expose the 4th inguinal mammary gland. The fat pad is cleared by removing the fat pad tissue anterior to the lymph node. Epithelium fragments or epithelial cells are transplanted into the remaining cleared fat pad and the mouse is closed.

This article demonstrates the procedure developed by DeOme KB et al. (1959) and the sparing procedure developed by Brill B et al. (2008) for clearing the 4th inguinal mammary fat pad of a pubescent mouse in preparation for transplantation of mammary fragments, mammary epithelial cells, or mammary tumor cells.

زرع الثدي الداخلي طلائي

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later stages of embryonic development, and to define how enhancers and promoters regulate gene expression within the embryo. The protocol demonstrated here can be used to efficiently produce transgenic Xenopus laevis embryos. This transgenesis approach involves three parts: 1. Sperm nuclei are isolated from adult X. laevis testis by treatment with lysolecithin, which permeabilizes the sperm plasma membrane. 2. Egg extract is prepared by low speed centrifugation, addition of calcium to cause the extract to progress to interphase of the cell cycle, and a high-speed centrifugation to isolate interphase cytosol. 3. Nuclear transplantation: the nuclei and extract are combined with the linearized plasmid DNA to be introduced as the transgene and a small amount of restriction enzyme. During a short reaction, egg extract partially decondenses the sperm chromatin and the restriction enzyme generates chromosomal breaks that promote recombination of the transgene into the genome. The treated sperm nuclei are then transplanted into unfertilized eggs. Integration of the transgene usually occurs prior to the first embryonic cleavage such that the resulting embryos are not chimeric. These embryos can be analyzed without any need to breed to the next generation, allowing for efficient and rapid generation of transgenic embryos for analyses of promoter and gene function. Adult X. laevis resulting from this procedure also propagate the transgene through the germline and can be used to generate lines of transgenic animals for multiple purposes.

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

This video protocol demonstrates a method for generating transgenic Xenopus laevis by introduction of transgenes into sperm nuclei followed by nuclear transplantation into unfertilized eggs.

إنتاج المعدلة وراثيا القيطم المورق عن طريق تقييد أنزيم التكامل وساطة وزرع النووية

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

زرع الوجه في<em&gt; القيطم المورق</em&gt; الأجنة

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of neurulation, migrates extensively towards various organs, and differentiates into many types of derivatives (neurons, glia, cartilage and bone, pigmented and endocrine cells). In this protocol, we describe how to dissect the premigratory cranial NC from Xenopus laevis embryos, in order to study NC development in vivo and in vitro. The frog model offers many advantages to study early development; abundant batches are available, embryos develop rapidly, in vivo gain and loss of function strategies allow manipulation of gene expression prior to NC dissection in donor and/or host embryos. The NC explants can be plated on fibronectin and used for in vitro studies. They can be cultured for several days in a serum-free defined medium. We also describe how to graft NC explants back into host embryos for studying NC migration and differentiation in vivo.

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

This protocol describes how to dissect premigratory cranial neural crest (NC) from Xenopus laevis neurulas. These explants can be plated on fibronectin and cultured in vitro, or grafted back into host embryos. This technique allows studying the mechanisms of NC epithelium-to-mesenchyme transition, migration, and differentiation.

تشريح<em&gt; القيطم المورق</em&gt; العصبية كريست ل<em&gt; في المختبر</em&gt; يزدرع الثقافة أو<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; زرع

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and widely-utilized +TIPs for analyzing MT dynamics is the End-Binding protein, EB1, which binds all growing MT plus-ends, and thus, is a marker for MT polymerization1. Many studies of EB1 behavior within growth cones have used time-consuming and biased computer-assisted, hand-tracking methods to analyze individual MTs1-3. Our approach is to quantify global parameters of MT dynamics using the software package, plusTipTracker4, following the acquisition of high-resolution, live images of tagged EB1 in cultured embryonic growth cones5. This software is a MATLAB-based, open-source, user-friendly package that combines automated detection, tracking, visualization, and analysis for movies of fluorescently-labeled +TIPs. Here, we present the protocol for using plusTipTracker for the analysis of fluorescently-labeled +TIP comets in cultured Xenopus laevis growth cones. However, this software can also be used to characterize MT dynamics in various cell types6-8.

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

The MATLAB-based, open source software package, plusTipTracker, can be used to analyze image series of fluorescently-labeled +TIPs to quantify microtubule dynamics.

plusTipTracker باستخدام برنامج لقياس ديناميكية في أنيبيب<em&gt; القيطم المورق</em&gt; المخاريط النمو

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...