Эта работа была поддержана грантами от исследований в области профилактики слепоты (по развитию карьеры награждения МЭЗ и АСВ и неограниченный предоставляют отделения офтальмологии), Е. Матильда Зиглер Foundation (МЭЗ и АСВ) и Национального Института глаза / NIH (МЭЗ , гранты R01EY015748 и R01EY017964).

Часть I. Настройка для ACT Пробирной <ol><li> Создание ограничен РНК для инъекций в соответствии с предложением производителя, используя свои фенол: хлороформ метод очистки (например, mMessage mMachine Kit; Applied Biosystems / Амбион, Остин, Техас). РНК кодирования флуоресцентный белок используется в качестве индикатора. Мы транскрибировать либо желтый флуоресцентный белок (YFP) или mCherry 5 кДНК, которая находится в вектор экспрессии pCS2 +. </li><li> Вытяните боросиликатного стекла капилляров с образованием конической советы стекла, используя съемник микропипетки. Мы используем Саттер микропипетки Puller, Р-97 (Саттер Instruments, Inc, Новато, Калифорния), как описано выше 6. </li><li> Сделать стерильных растворов в таблице 1 от 10 X Марка изменения Рингера (MMR) маточного раствора (10 мМ MgCl 2, 20 мМ KCl, 20 мМ CaCl 2, 50 HEPES мМ, 1 М NaCl, доводили до рН 7,5, автоклавировать и хранить при RT). </li><li> Изолировать яички от мужчин лягушку и хранить ткани при температуре 4 ° С в стерильный раствор 1X MMR / гентамицин (50 мкг / мл гентамицина сульфата; BioWhittaker, Cat # 17-518Z). Это может быть сделано в течение недели до начала эксперимента, но она теряет свою эффективность с течением времени. </li><li> Яйцо укладки раствор (1X: 150 мМ NaCl, 2,62 мМ KCl, 0,8 мМ Na 2 HPO 4, 20 мМ Trizma базы, 2,62 мМ NaHCO 3 и 2,75 мМ MgSO 4, доводили до рН 7,6) могут быть сделаны как 8X акции, которые можно хранить при температуре 4 ° С до двух недель. Примечание: следите за загрязнение в этом решении, так как это повлияет на качество вашего яйца. </li><li> Создание инъекции пластин. Для этого растопите 1% агарозном в 0.4X MMR в микроволновой печи, добавьте ~ 6 мл расплавленного решение агарозы на 60 мм пластинами, слегка раскатать эластомера форму (рис. 1) в верхней части решение, чтобы избежать пузырей и дайте остыть в течение приблизительно 20 минут при комнатной температуре. Для определения количества необходимости, рассмотреть ряд экспериментальных условиях (например, 1, YFP, 2, YFP + Ноггин) и количество пересаженных эмбрионов хост необходимо. Для наших экспериментов, мы создаем не менее 20 пересаженных эмбрионов хост для каждой экспериментальной состоянии. На 18-19 ° C, эмбрионы будут на стадии 15 около часа. Если это занимает один час для проведения 20 трансплантаций, то две точки оплодотворения время необходимы, предполагая, что хозяин эмбрионов принять все трансплантатов. Таким образом, четыре блюда инъекции будут необходимы (2 ехр условия х 2 очка оплодотворения время = 4). Храните пластины при температуре 4 ° С не более одной недели. </li><li> Создание колпачок изоляции пластин с использованием 1% агарозном + 0,7 MMR с формы, как и для инъекций пластины. Сделать столько же крышка изоляции как закачка пластин плюс одна посторонняя за каждое очко время оплодотворения (4 + 2 точках оплодотворения время = 6). </li><li> Inject самок с 500 единиц человеческого хорионического гонадотропина в конце дня на день, предшествующий микроинъекции. Магазин женщин при температуре 16-18 ° С в течение ночи. </li></ol> Часть II. РНК микроинъекции Xenopus laevis эмбрионов А. Подготовка к микроинъекции <ol><li> Удалить гормонально индуцированной женщин и разместить их в отдельных резервуарах, содержащих 1X откладки яиц решение (ELS). Примечание: мы не используем яйца, которые были в ELS более двух часов, как и качество яиц снижается. Таким образом, примерно за час до оплодотворения в пробирке, отбросить все яйца из бака, так что только свежие яйца собираются. </li><li> Подготовка игла для микроинъекции по Ножницы с наконечником для получения 25-35 мкм в диаметре. Место иглу на picoinjector и калибровки так, чтобы она распределяет 10 NL на инъекцию. </li><li> Установить инкубаторе до 14 ° C. </li><li> Как только самки откладывали яйца в течение часа, удалить яйца из бака использованием передачи пипетки и их размещение в 60 мм чашки Петри. Удалить столько ELS из яиц, как можно и заменить 1X MMR. Яйца могут быть оплодотворены сразу или остаться в 1X MMR до часа. Для пересадки анализа, то лучше, чтобы оплодотворить два блюда, 80% из одного слоя яйца в до трех отдельных партий на уровне около 11 утра, в полдень и 1 час. После инъекции, они будут размещены в 14 ° С, так что они будут расти до желаемого этапы колпачок изоляции (стадия 8,5-9) и трансплантацией (стадия 15; см. Часть I, # 6 выше). </li><li> Для проверки качества яичек, мы выполняем рано утром оплодотворения (~ 8 утра), что позволяет нам извлечь яички от другого самца, если сперматозоиды от первого не является жизнеспособным. Примечание: мы гомогенизации ~ 0,25 яички в 1 мл 1X MMR и добавить примерно от 5 до 7 капель на чашку ооцитов. </li><li> В пробирке оплодотворить яйца с гомогенизированный яичек и, час спустя, удалить слой желе на яйца использованием де-желе решение (164μl 1M DTT + 10 мл 1М Трис, рН 8,8 до 50 мл воды автоклавного NanoPure). Подождите, пока они не достигают двух-клеточной стадии, чтобы начать сортировку, которая занимает около 2 часов при 18 ° С или 1,5 часа при комнатной температуре (22 ° С). </li><li> Использование Transfэ пипетки, сортировать равномерно пигментированные и равномерно деления эмбрионов, как показано в левой крышки животных на рисунке 3, в колодец инъекции блюдо заполнено 0.4X MMR + 6% Ficoll. </li></ol> Б. Микроинъекция <ol><li> Стретч парафильмом поверх 60 мм крышкой чашки Петри. Внесите 2 мкл ваш первый образец РНК на парафильмом и аспирации использованием PLI-100, чтобы заполнить Ваш инъекционной иглой. Не забудьте проверить, что игла находится еще дозирования 10 NL образца до начала инъекции. </li><li> Inject 20-30 двух-клеточной стадии эмбрионов (оба бластомеров) с 500 пг YFP РНК в одном блюде и ваш интерес гена (например, 20 пг Ноггин РНК), а также YFP ​​РНК в другом блюде 7. </li><li> Место 100-200 неинъекционные эмбрионы в момент времени, в другом инъекции блюдо с решением Ficoll. Переместите их в и из инкубатора в то же время, как вводить эмбрионы. Эти узлы, которые будут использоваться в Части IV. </li><li> После инъекции, инкубировать всех эмбрионов при 14 ° С в течение ночи. Повторите эти действия для всех временных точках. </li></ol> Часть III. Изолировать животных шапки из вводят эмбрионы <ol><li> Прибытие рано утром на стадии эмбрионов. Раннее время точка должна быть на стадии 9. Удалите те, которые не сохранились. Продолжайте следующие шаги работы с каждый момент времени в пакетном режиме. </li><li> Вылейте Ficoll решение от каждой пластины и добавить обратно 0,7 MMR / гентамицин решение. Чтобы блюдо изоляции крышкой, добавьте большом количестве 0,7 MMR / гентамицин решение. Выбить эмбрионы от их инъекции блюдо скважин с помощью пипетки передачи и место в только что приготовленное блюдо изоляции шапку. </li><li> Изолируйте животное шапки в 0,7 MMR раствор + гентамицин, сохраняя 2 или 3 неизменными эмбрионов для постановки. Либо Gastromaster, оснащенный желтый наконечник согнуты до 400 мкм, или пару острых № 5 щипцы могут быть использованы. </li><li> Положите шапки еще в 14 ° C инкубаторе до следующего дня. Хост эмбрионы должны быть удалены из инкубатора в то же время, как шапки, чтобы держать их на том же этапе развития в качестве донора ткани. </li></ol> Часть IV. Трансплантация колпачки на фланге <ol><li> Удалить колпачки и эмбрионы от первой точки времени от 14 ° C инкубатора и стадии эмбрионов. Сортировать для равномерного желтого или красного флуоресцентного-положительных шапки, в зависимости от трассирующих вводят внутривенно (рис. 2). </li><li> Подсчитайте количество крышек и удалить удвоить число этап 12-13 эмбрионов свежеприготовленный инъекции блюдо с 0,7 MMR / гентамицин решение. С резким щипцов # 5, удалить желточной мембраны от каждого. Передача их в тарелку с шапки, но будьте осторожны. Без их мембран желточной, эмбрионы могут быстро диссоциируют на поверхности воды. </li><li> Использование gastromaster (желтый наконечник, 200-250 мкм согнуты проволока, высокие настройки) или # 5 щипцы, удалить 200 мкм квадрат на стороне эмбриона на стадии 14-15 (рис. 3). Затем, разрезать пополам крышкой (с gastromaster или # 5 щипцы) и поместите ткань в отверстие, сделанное в принимающей эмбриона. Поворот эмбриона против хорошо, чтобы исцеление. Делайте это в течение как многие эмбрионы, как вы можете, пока они находятся на стадии 15. Повторите эти действия для всех временных точках. </li><li> Эмбрион, как правило, заживают в течение 30 минут. Удаление отмерших клеток (белые) с нежным чистки движения с # 5 щипцами. Вырастить их при 18 ° С в течение ночи. </li><li> Под рассекает флуоресцентного микроскопа, сортировать эмбрионов с флуоресцентно меченных, пересаженные ткани. Положите их обратно при 18 ° С расти до стадии 42-43. </li><li> Анестезию животных в tricaine. На данный момент, можно делать снимки под флуоресцентным микроскопом вскрытии. После того как вы сделали, исправить, раздел и immunostain или выполнить на месте гибридизации с использованием маркеров для ваших тканей, представляющих интерес. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig1.jpg" alt="Рисунок 1" /> Рисунок 1. Дизайн оргстекла для литья эластомеров форма используется для изготовления блюд эмбриона холдинга. 38 х 38 мм круглый угол квадрата (~ 5 мм в глубину) был направлен из кусок оргстекла, что составляет 50 х 50 квадратных мм и толщиной 25 мм. Циркуляр, равномерно расположенных скважин (1,5 мм в диаметре) было пробурено 1 мм вглубь пластика. Для того, чтобы эластомера формы для микроинъекции посуду, заливают мы Sylgard эластомера в оргстекла и позволило ему укрепить, в соответствии с инструкциями производителя. Этот эластомер формы используется, чтобы сделать инъекцию и пластины крышки изоляции. <img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig2.jpg" alt="Рисунок 2" /> Рисунок 2. Животное шапка сортировки до трансплантации важно, так как выражение может меняться. Животное крышки на левом выражает mCherry равномерно по всей ткани в то время как эксплантов на право имеет пятнистый выражения и будет отброшен. <img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig3.jpg" alt="Рисунок 3" /> Рисунок 3. Хост tadpоле разработала глаз-подобную структуру на своем фланге от пересаженных клеток шапка животного. флуоресцентное изображение было наложенных на изображение светлого.

<ol>
	<li>Smith, W. C., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+cloning+of+noggin,+a+new+dorsalizing+factor+localized+to+the+Spemann+organizer+in+Xenopus+embryos.">Expression cloning of noggin, a new dorsalizing factor localized to the Spemann organizer in Xenopus embryos.</a> Cell. 70, 829-840 (1992).</li><li>Lamb, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+induction+by+the+secreted+polypeptide+noggin.">Neural induction by the secreted polypeptide noggin.</a> Science. 262, 713-718 (1993).</li><li>Green, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Methods+in+Developmental+Biology:+Xenopus+&#38;+Zebrafish.">Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus &#38; Zebrafish.</a> Methods in Developmental Biology. , (1999).</li><li>Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+eyes+from+pluripotent+cells.">Generation of functional eyes from pluripotent cells.</a> PLoS Biol. 7, e1000174-e1000174 (2009).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2, 905-909 (2005).</li><li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+patch-pipettes+and+sharp+electrodes+with+a+programmable+puller.">Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Lan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noggin+Elicits+Retinal+Fate+in+Xenopus+Animal+Cap+Embryonic+Stem+Cells.">Noggin Elicits Retinal Fate in Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cells. , (2009).</li></ol>

В этом видео, мы продемонстрировали нашу версию классических методов, используемых биологами Xenopus, которые мы переставить создать трансплантации животным шапка анализа. При комнатной температуре эмбрионы Xenopus развиваются очень быстро через этапы 9 и 15. Разместив их на 14 ° C, ра...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>mMessage mMachine SP6 Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Applied Biosystems/Ambion</td>
<td>AM1340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Borosilicate Capillary Tubes (1.0mm OD x 0.5mm ID)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FHC, Inc</td>
<td>27-30-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sutter Micropipette Puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments, Inc.</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gentamicin sulfate [50 mg/ml]</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BW17-528Z</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sylgard/elastomer Kit 1.1lb</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>NC9644388</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>60 x 15 mm polystyrene petri dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USA Scientific</td>
<td>8609-0160</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>human chorionic gonadotropin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Intervet</td>
<td>22219</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pico-Injector Microinjection Systems</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>650003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Torrey Pines Scientific ECHOtherm Incubator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>11-680-21</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Transfer pipette</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Krackeler</td>
<td>6290-20635A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumostar #5 Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>11295-10</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

tissue determination using the animal cap transplant (act) assay in xenopus laevis

Многие белки играют двойную роль в эмбриональном развитии. Те, которые регулируют определение ячейки судьбу в конкретной ткани также может влиять на развитие большей области эмбриона. Это делает определение ее роли в определенной ткани трудно анализировать. Например,<em&gt; Башка</em&gt; Гиперэкспрессия в<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Эмбрионов вызывает расширение всей передней части, в том числе глаз<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Из этого результата, то не известно, если Ноггин играет непосредственную роль в определении глаза или, что, вызывая расширение нервной ткани, Ноггин косвенно влияет на формирование глаз. Наличие этого комплекса фенотип делает изучение его глаз особую роль в ячейке определения судьбы трудно анализировать. Мы разработали анализа, что позволяет преодолеть эту проблему. Воспользовавшись плюрипотентных характер<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Животное крышкой<sup&gt; 3</sup&gt;, Мы разработали анализ, чтобы проверить способность гена продукт (ы), как и<em&gt; Башка</em&gt; Или глаз поле транскрипционных факторов (EFTFs), превратить шапки в определенной ткани или типов клеток путем пересадки этой ткани на стороне эмбриона<sup&gt; 4</sup&gt;. Хотя мы нашли либо лечения Ноггин белка или коллекции транскрипционных факторов может определить судьбу сетчатки ячейку в животных шапки, эта процедура может быть использована для идентификации гена продукт (ов), участвующего в определении других тканей, а также.

Watch this Scientific Journal Video about Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis at JoVE.com

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Животное шапки гиперэкспрессией гена продукт (ы) пересаживают на фланге развивающихся<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Эмбрионов для того, чтобы установить, является ли ткани определяется.

Ткань Определение Использование трансплантации животных Cap (ACT) в Пробирной Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

tissue-determination-using-animal-cap-transplant-act-assay-xenopus

Research

JoVE Journal

Biology

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

12.1K Views.  SUNY Upstate Medical University. Животное шапки гиперэкспрессией гена продукт (ы) пересаживают на фланге развивающихся Xenopus laevis Эмбрионов для того, чтобы установить, является ли ткани определяется.

Video: Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

This video demonstrates the technique used for preparation of organizer and animal pole explants from Xenopus laevis embryos, including the use of the eyebrow knife - a specialized dissection tool made of one's eyebrow. The protocol for assembling an adhesion assay is also given, which probes for the presence of key adhesion molecules present on the surface organizer or animal pole cells that are critical for proper development.

Препарирование Организатор и эксплантов животных Полюс от Xenopus laevis Эмбрионы и Ассамблеи Пробирной клеточной адгезии

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

Пластиковые вложения и секционирования Xenopus laevis Эмбрионы

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

Получение Яйца Xenopus laevis Женщины

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Подготовка и Фракционирование Xenopus laevis Яйцо Экстракты

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Микроинъекции Xenopus ооцитов Laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Mammary Epithelial Transplant Procedure

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, followed by the mammary epithelial transplant procedure. The mammary transplant procedure is widely used by mammary biologists because it takes advantage of the fact that significant development of the mammary epithelium doesn't occur until after puberty. At 3 weeks of age, growth of the mammary epithelial tree is confined to the vicinity of the nipple and the fat pad is largely devoid of mammary epithelium, but by 7 weeks of age the epithelial ductal tree extends throughout the entire fat pad. Therefore, if this small portion of the fat pad containing epithelium, the region between the nipple and the lymph node, is removed at 3 weeks of age, the endogenous epithelium will never populate the mammary fat pad and the fat pad is described as "cleared". At this time, mammary epithelium from another source can be transplanted in the cleared fat pad where it has the potential to extend mammary ductal trees through out the fat pad. This procedure has been utilized in many experimental models including the examination of tumor phenotype in transgenic mammary epithelial tissue without the confounding effects of genotype on the entire animal3, in the identification of mammary stem cells by transplanting cells in limited dilution4,5, determining if hyperplastic nodules proceed to mammary tumors6, and to assess the effect of prior hormone exposure on the behavior of the mammary epithelium7,8.
Three week old host mice are anesthetized, cleaned and restrained on a surgical stage. A mid-sagittal incision is made through the skin, but not the peritoneum, extending from the pubis to the sternum. Oblique cuts are made through the skin from the mid-sagittal incision across the pelvis toward each leg. The skin is pulled away from the peritoneum to expose the 4th inguinal mammary gland. The fat pad is cleared by removing the fat pad tissue anterior to the lymph node. Epithelium fragments or epithelial cells are transplanted into the remaining cleared fat pad and the mouse is closed.

This article demonstrates the procedure developed by DeOme KB et al. (1959) and the sparing procedure developed by Brill B et al. (2008) for clearing the 4th inguinal mammary fat pad of a pubescent mouse in preparation for transplantation of mammary fragments, mammary epithelial cells, or mammary tumor cells.

Молочные Эпителиальные Процедура трансплантации

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later stages of embryonic development, and to define how enhancers and promoters regulate gene expression within the embryo. The protocol demonstrated here can be used to efficiently produce transgenic Xenopus laevis embryos. This transgenesis approach involves three parts: 1. Sperm nuclei are isolated from adult X. laevis testis by treatment with lysolecithin, which permeabilizes the sperm plasma membrane. 2. Egg extract is prepared by low speed centrifugation, addition of calcium to cause the extract to progress to interphase of the cell cycle, and a high-speed centrifugation to isolate interphase cytosol. 3. Nuclear transplantation: the nuclei and extract are combined with the linearized plasmid DNA to be introduced as the transgene and a small amount of restriction enzyme. During a short reaction, egg extract partially decondenses the sperm chromatin and the restriction enzyme generates chromosomal breaks that promote recombination of the transgene into the genome. The treated sperm nuclei are then transplanted into unfertilized eggs. Integration of the transgene usually occurs prior to the first embryonic cleavage such that the resulting embryos are not chimeric. These embryos can be analyzed without any need to breed to the next generation, allowing for efficient and rapid generation of transgenic embryos for analyses of promoter and gene function. Adult X. laevis resulting from this procedure also propagate the transgene through the germline and can be used to generate lines of transgenic animals for multiple purposes.

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

This video protocol demonstrates a method for generating transgenic Xenopus laevis by introduction of transgenes into sperm nuclei followed by nuclear transplantation into unfertilized eggs.

Получение трансгенных Xenopus laevis По рестрикции Интеграция опосредованного и ядерной трансплантации

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

Трансплантация лица в<em&gt; Xenopus Laevis</em&gt; Эмбрионы

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of neurulation, migrates extensively towards various organs, and differentiates into many types of derivatives (neurons, glia, cartilage and bone, pigmented and endocrine cells). In this protocol, we describe how to dissect the premigratory cranial NC from Xenopus laevis embryos, in order to study NC development in vivo and in vitro. The frog model offers many advantages to study early development; abundant batches are available, embryos develop rapidly, in vivo gain and loss of function strategies allow manipulation of gene expression prior to NC dissection in donor and/or host embryos. The NC explants can be plated on fibronectin and used for in vitro studies. They can be cultured for several days in a serum-free defined medium. We also describe how to graft NC explants back into host embryos for studying NC migration and differentiation in vivo.

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

This protocol describes how to dissect premigratory cranial neural crest (NC) from Xenopus laevis neurulas. These explants can be plated on fibronectin and cultured in vitro, or grafted back into host embryos. This technique allows studying the mechanisms of NC epithelium-to-mesenchyme transition, migration, and differentiation.

Рассечение<em&gt; Xenopus Laevis</em&gt; Нервного гребня для<em&gt; В пробирке</em&gt; Эксплантата Культура или<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Трансплантация

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and widely-utilized +TIPs for analyzing MT dynamics is the End-Binding protein, EB1, which binds all growing MT plus-ends, and thus, is a marker for MT polymerization1. Many studies of EB1 behavior within growth cones have used time-consuming and biased computer-assisted, hand-tracking methods to analyze individual MTs1-3. Our approach is to quantify global parameters of MT dynamics using the software package, plusTipTracker4, following the acquisition of high-resolution, live images of tagged EB1 in cultured embryonic growth cones5. This software is a MATLAB-based, open-source, user-friendly package that combines automated detection, tracking, visualization, and analysis for movies of fluorescently-labeled +TIPs. Here, we present the protocol for using plusTipTracker for the analysis of fluorescently-labeled +TIP comets in cultured Xenopus laevis growth cones. However, this software can also be used to characterize MT dynamics in various cell types6-8.

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

The MATLAB-based, open source software package, plusTipTracker, can be used to analyze image series of fluorescently-labeled +TIPs to quantify microtubule dynamics.

Использование plusTipTracker Программное обеспечение для измерения микротрубочек Динамика в<em&gt; Xenopus Хепориз</em&gt; Шишки роста

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...