Questo lavoro è stato supportato anche da finanziamenti di ricerca per la Prevenzione della Cecità (Career Development Awards di MEZ e ASV e un finanziamento non vincolante per il Dipartimento di Oftalmologia), la Fondazione E. Matilda Zeigler (MEZ e ASV) e il National Eye Institute / NIH (MEZ , borse di studio e R01EY015748 R01EY017964).

Parte I. Set-up per l&#39;analisi ACT <ol><li> Generare RNA ricoperto per iniezione come suggerito dal produttore, usando il loro fenolo: cloroformio metodo di purificazione (es. mMessage mMachine Kit; Applied Biosystems / Ambion, Austin, TX). RNA che codifica per una proteina fluorescente viene usato come tracciante. Trascriviamo sia proteina fluorescente gialla (YFP) o mCherry 5 cDNA, che si trova in un vettore di espressione pCS2 +. </li><li> Tirare tubi in vetro borosilicato capillari per formare punte di vetro affusolata con un estrattore micropipetta. Noi usiamo Sutter Micropipetta Puller, P-97 (Sutter Instruments, Inc., Novato, CA), come descritto in precedenza 6. </li><li> Fai soluzioni sterili nella tabella 1 da 10 X Marc modificato Ringer (MMR), soluzione madre (10 mM MgCl 2, 20 mM KCl, 20 mM CaCl 2, 50 HEPES mM, 1 M di NaCl, a pH 7,5, autoclave e conservati a RT). </li><li> Isolare testicoli da una rana maschio e conservare il tessuto a 4 ° C in una soluzione sterile di 1X MMR / gentamicina (50 mg / ml di gentamicina solfato; BioWhittaker, Cat # 17-518Z). Questo può essere fatto fino ad una settimana prima dell&#39;inizio dell&#39;esperimento, ma è perde la sua efficacia nel tempo. </li><li> Soluzione di deposizione delle uova (1X: 150 mM NaCl, 2,62 mM KCl, 0,8 mM Na 2 HPO 4, 20 mm Trizma base, 2,62 mM NaHCO 3 e 2,75 mM MgSO 4; portato a pH 7,6) può essere fatto come uno stock 8X, che può essere conservato a 4 ° C per un massimo di due settimane. Nota: attenzione per la contaminazione in questa soluzione, in quanto questo influenzerà la qualità della vostra uova. </li><li> Genera piastre iniezione. Per fare questo, si fondono l&#39;1% di agarosio a 0.4X MMR in un forno a microonde, aggiungere ~ 6 ml di soluzione fuso agarosio in 60 piastre mm, delicatamente srotolare uno stampo in elastomero (Figura 1) sulla parte superiore della soluzione per evitare bolle e lasciate raffreddare per circa 20 minuti a RT. Per determinare il numero necessario, considerare il numero di condizioni sperimentali (ad esempio 1, YFP, 2, YFP Noggin +) e il numero di embrioni ospitare trapiantato necessario. Per i nostri esperimenti, abbiamo generare almeno 20 embrioni ospitare trapiantati per ogni condizione sperimentale. A 18-19 ° C, gli embrioni saranno allo stadio 15 per circa un&#39;ora. Se ci vuole un&#39;ora per effettuare 20 trapianti, poi due punti di tempo fecondazione sono necessari, assumendo gli embrioni ospitare accettare tutti i trapianti. Pertanto, quattro piatti di iniezione saranno necessari (2 condizioni x 2 punti exp tempo fecondazione = 4). Conservare le piastre a 4 ° C per un massimo di una settimana. </li><li> Genera piastre di isolamento tappo utilizzando 1% di agarosio + 0,7 X MMR con stampi come per la piastra di iniezione. Fai lo stesso numero di isolamento cap come piastre di iniezione più uno per ogni punto temporale fecondazione (4 + 2 punti di tempo fecondazione = 6). </li><li> Iniettare femmine con 500 unità di gonadotropina corionica umana alla fine della giornata il giorno prima microiniezione. Donne conservare a 16-18 ° C durante la notte. </li></ol> Parte II. Microiniezione RNA di embrioni di Xenopus laevis A. Preparazione per la microiniezione <ol><li> Rimuovere femminile ormonale indotta e metterli nei singoli serbatoi contenenti 1X soluzione la deposizione delle uova (ELS). Nota: non usare le uova che sono state in ELS più di due ore come la qualità delle uova è ridotta. Pertanto, circa un&#39;ora prima fecondazione in vitro, abbiamo scartare tutte le uova dal serbatoio in modo che solo uova fresche di cui sono raccolti. </li><li> Preparare l&#39;ago per microiniezione dal tagliando la punta per ottenere un diametro di 25-35 micron. Posizionare l&#39;ago sulla picoinjector e calibrare in modo che esso eroga 10 Nl per iniezione. </li><li> Impostare un incubatore a 14 ° C. </li><li> Una volta che le femmine hanno deposto le uova per circa un&#39;ora, togliere le uova dal serbatoio con una pipetta di trasferimento e di inserirli in piatti mm 60 Petri. Rimuovere il ELS molto dalle uova possibile e sostituirlo con 1X MMR. Le uova possono essere fecondate subito o rimanere in MMR 1X per un massimo di un&#39;ora. Per l&#39;analisi dei trapianti, è meglio fertilizzare due piatti, 80% di occupazione di un singolo strato di uova in un massimo di tre lotti separati verso le 11 del mattino, mezzogiorno e 1 pm. Dopo l&#39;iniezione, che verranno messi a 14 ° C in modo che si svilupperà per le fasi desiderato per l&#39;isolamento tappo (stadio 8,5-9) e il trapianto (stadio 15; vedere la Parte I, # 6). </li><li> Per verificare la qualità dei testicoli, facciamo una fecondazione mattina presto (~ 8 del mattino), che ci permette di estrarre i testicoli di un altro maschio, se lo sperma dalla prima non è praticabile. Nota: abbiamo omogeneizzare ~ 0,25 testicoli in 1 ml 1X MMR e aggiungere circa 5-7 gocce per piastra di ovociti. </li><li> In vitro fertilizzare le uova con testicoli omogeneizzato e, un&#39;ora dopo, togliere il cappotto gelatina sulle uova con de-gelatina soluzione (164μl 1M DTT + 10 ml 1M Tris, pH 8,8 fino a 50 ml di acqua Nanopure autoclavata). Attendere fino a raggiungere stadio di due cellule per iniziare l&#39;ordinamento, che dura circa 2 ore a 18 ° C o 1,5 ore a temperatura ambiente (22 ° C). </li><li> Utilizzando un trasfer pipetta, gli embrioni sorta uniformemente pigmentate e uniformemente dividendo, come mostrato nella calotta animale abbia lasciato in Figura 3, nel pozzo di un piatto pieno di iniezione Ficoll 0.4X MMR + 6%. </li></ol> B. Microiniezione <ol><li> Stretch Parafilm sopra la parte superiore di un 60 millimetri coperchio Petri. Pipettare 2 ml di tuo primo campione di RNA sul Parafilm ed aspirare con il PLI-100 per riempire il vostro ago per l&#39;iniezione. Assicuratevi di controllare che l&#39;ago sia ancora erogazione nL 10 del campione prima di iniziare l&#39;iniezione. </li><li> Iniettare 20-30 a due cellule embrioni stadio (entrambi blastomeri) con 500 pg YFP RNA in un piatto e il tuo gene di interesse (ad esempio 20 pg Noggin RNA) più YFP RNA in un altro piatto 7. </li><li> Luogo 100-200 non per iniezione embrioni per ogni punto ora in un altro piatto di iniezione con la soluzione di Ficoll. Muoversi dentro e fuori dell&#39;incubatore, allo stesso tempo come gli embrioni iniettati. Questi sono i padroni di casa per essere utilizzato nella parte IV. </li><li> Dopo l&#39;iniezione, tutti gli embrioni incubare a 14 ° C durante la notte. Ripetere l&#39;operazione per tutti i punti di tempo. </li></ol> Parte III. Isolare tappi animale da embrioni iniettati <ol><li> Arrivo la mattina presto per mettere in scena gli embrioni. Il punto di primo tempo dovrebbe essere in fase 9. Rimuovere quelli che non sono sopravvissuti. Procedere con le seguenti operazioni di lavoro con ogni punto di volta in lotti. </li><li> Eliminare la soluzione di Ficoll da ogni piatto e aggiungere MMR posteriore 0,7 X / soluzione di gentamicina. Per un piatto di isolamento del tappo, aggiungere una generosa quantità di 0,7 X MMR / gentamicina soluzione. Sloggiare embrioni da pozzi di iniezione loro piatto con una pipetta di trasferimento e posto nel piatto tappo appena preparato isolamento. </li><li> Isolare tappi animale in 0,7 X MMR soluzione + gentamicina, mantenendo 2 o 3 embrioni intatti per la stadiazione. O il Gastromaster, munito di una punta giallo piegato a 400 micron, o un paio di pinze taglienti numero 5 può essere utilizzato. </li><li> Mettere cappucci indietro nel 14 ° C incubatore fino al giorno successivo. Gli embrioni host deve essere rimosso dal termostato al tempo stesso i tappi per tenerli nella stessa fase di sviluppo come il tessuto del donatore. </li></ol> Parte IV. Il trapianto di tappi sul fianco <ol><li> Togliere i tappi e gli embrioni dal punto prima volta dal 14 ° C incubatore e lo stadio degli embrioni. Ordina per uniforme di colore giallo o rosso fluorescente-positivi tappi, a seconda del tracciante iniettato (Figura 2). </li><li> Contare il numero di tappi e rimuovere raddoppiare il numero di embrioni stadio 12-13 per un piatto di iniezione preparati al momento con 0,7 X MMR / soluzione di gentamicina. Con forte pinze # 5, rimuovere la membrana vitellina da ciascuno. Trasferirli alla piastra con i tappi, ma state attenti. Senza il loro membrana vitellina, gli embrioni possono dissociare rapidamente sulla superficie dell&#39;acqua. </li><li> Utilizzando il gastromaster (punta gialla, 200-250μm filo piegato, impostazione più elevata) o # 5 pinzette, rimuovere un 200 micron quadrato sul lato di un embrione allo stadio 14-15 (Figura 3). Poi, tagliate un cappuccio a metà (con il gastromaster o la # 5 forcipe) e posizionare il tessuto nel foro praticato nel embrione ospitante. Ruotare l&#39;embrione contro il bene di permettere la guarigione. Fate questo per gli embrioni che puoi mentre sono in fase 15. Ripetere l&#39;operazione per tutti i punti di tempo. </li><li> L&#39;embrione di solito guariscono in 30 minuti. Rimuovere le cellule morte (bianco) con un delicato movimento spazzolatura con una pinza # 5. Farle crescere a 18 ° C durante la notte. </li><li> Sotto il microscopio a fluorescenza dissezione, degli embrioni sorta con fluorescenza marcata, tessuto trapiantato. Rimetterli a 18 ° C a crescere fino allo stadio 42-43. </li><li> Anestetizzare gli animali in tricaine. A questo punto, è possibile scattare foto al microscopio a fluorescenza dissezione. Dopo aver fatto, fissare, sezione e immunostain o eseguire ibridazione in situ utilizzando marcatori per il vostro tessuto di interesse. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Progettazione di plexiglass per la fusione dello stampo elastomero usato per fare i piatti tenendo embrione. A x 38 38 mm tondo punte quadrate (~ 5 mm di profondità) è stato indirizzato da un pezzo di plexiglass che è di 50 x 50 mm quadrati e 25 mm di spessore. Circolare, equidistanti pozzi (1,5 mm di diametro) sono stati perforati 1 mm nella plastica. Per fare lo stampo in elastomero per i piatti microiniezione, abbiamo versato elastomero Sylgard in plexiglass e ha permesso di consolidare, come da istruzioni del produttore. Questo stampo elastomero è usato per fare l&#39;iniezione e piastre di isolamento cap. <img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Cappello animale cernita che precedono il trapianto è importante, come espressione può variare. Tappo animali a sinistra esprime mCherry uniformemente sull&#39;intero tessuto mentre l&#39;espianto di destra è espressione spotty e saranno eliminati. <img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Un host tadpole ha sviluppato un occhio-come la struttura sul suo fianco da cellule trapiantate cap animali. Un&#39;immagine fluorescente è stato sovrapposto l&#39;immagine campo chiaro.

<ol>
	<li>Smith, W. C., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+cloning+of+noggin,+a+new+dorsalizing+factor+localized+to+the+Spemann+organizer+in+Xenopus+embryos.">Expression cloning of noggin, a new dorsalizing factor localized to the Spemann organizer in Xenopus embryos.</a> Cell. 70, 829-840 (1992).</li><li>Lamb, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+induction+by+the+secreted+polypeptide+noggin.">Neural induction by the secreted polypeptide noggin.</a> Science. 262, 713-718 (1993).</li><li>Green, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Methods+in+Developmental+Biology:+Xenopus+&#38;+Zebrafish.">Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus &#38; Zebrafish.</a> Methods in Developmental Biology. , (1999).</li><li>Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+eyes+from+pluripotent+cells.">Generation of functional eyes from pluripotent cells.</a> PLoS Biol. 7, e1000174-e1000174 (2009).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2, 905-909 (2005).</li><li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+patch-pipettes+and+sharp+electrodes+with+a+programmable+puller.">Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Lan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noggin+Elicits+Retinal+Fate+in+Xenopus+Animal+Cap+Embryonic+Stem+Cells.">Noggin Elicits Retinal Fate in Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cells. , (2009).</li></ol>

In questo video, abbiamo dimostrato la nostra versione di tecniche classiche utilizzate dai biologi Xenopus, che noi ruotare per ottenere il tappo test animali trapianto. A temperatura ambiente, embrioni di Xenopus sviluppano molto rapidamente attraverso le fasi 9 e 15. Ponendoli a 14 ° C, lo sviluppo dell&#39;embrione viene rallentato e trapianti di molti altri possono essere eseguite in un esperimento. Se è necessario far crescere gli embrioni a stadi vecchi (&gt; 42/43), poi si consiglia di utiliz...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>mMessage mMachine SP6 Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Applied Biosystems/Ambion</td>
<td>AM1340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Borosilicate Capillary Tubes (1.0mm OD x 0.5mm ID)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FHC, Inc</td>
<td>27-30-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sutter Micropipette Puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments, Inc.</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gentamicin sulfate [50 mg/ml]</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BW17-528Z</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sylgard/elastomer Kit 1.1lb</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>NC9644388</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>60 x 15 mm polystyrene petri dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USA Scientific</td>
<td>8609-0160</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>human chorionic gonadotropin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Intervet</td>
<td>22219</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pico-Injector Microinjection Systems</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>650003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Torrey Pines Scientific ECHOtherm Incubator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>11-680-21</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Transfer pipette</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Krackeler</td>
<td>6290-20635A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumostar #5 Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>11295-10</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

tissue determination using the animal cap transplant (act) assay in xenopus laevis

Molte proteine ​​svolgono un duplice ruolo nello sviluppo embrionale. Quelle che regolano il destino determinazione delle cellule in un tessuto specifico può anche influenzare lo sviluppo di una regione più ampia dell&#39;embrione. Questo rende la definizione del suo ruolo in un tessuto particolare difficile da analizzare. Per esempio,<em&gt; Noggin</em&gt; Sovraespressione in<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embrioni provoca l&#39;espansione di tutta la regione anteriore, tra cui l&#39;occhio<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Da questo risultato, non si sa se Noggin gioca un ruolo diretto nella determinazione degli occhi o che, provocando l&#39;espansione del tessuto neurale, Noggin colpisce indirettamente la formazione di occhi. Avendo questo fenotipo complesso fa studiare il suo occhio-specifico ruolo nella determinazione del destino della cellula difficili da analizzare. Abbiamo sviluppato un metodo che risolve questo problema. Approfittando della natura pluripotenti del<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Animale cappuccio<sup&gt; 3</sup&gt;, Abbiamo sviluppato un test per testare la capacità del prodotto del gene (s), come<em&gt; Noggin</em&gt; O fattori di trascrizione campo dell&#39;occhio (EFTFs), per trasformare tappi in particolare tessuto o di tipi di cellule da trapiantare questo tessuto sul lato dell&#39;embrione<sup&gt; 4</sup&gt;. Anche se abbiamo trovato sia il trattamento Noggin proteina o un insieme di fattori di trascrizione possono determinare il destino delle cellule della retina in capsule animali, questa procedura potrà essere utilizzato per identificare prodotto del gene (s) coinvolti nello specificare altri tessuti come bene.

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Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animale tappi iperespressione del gene prodotto (s) sono trapiantati al fianco di sviluppo<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embrioni al fine di stabilire se il tessuto è determinata.

Determinazione del tessuto Utilizzando il trapianto Cap animali (ACT) Assay in Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

tissue-determination-using-animal-cap-transplant-act-assay-xenopus

Research

JoVE Journal

Biology

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

12.3K Views.  SUNY Upstate Medical University. Animale tappi iperespressione del gene prodotto (s) sono trapiantati al fianco di sviluppo Xenopus laevis Embrioni al fine di stabilire se il tessuto è determinata.

Video: Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

This video demonstrates the technique used for preparation of organizer and animal pole explants from Xenopus laevis embryos, including the use of the eyebrow knife - a specialized dissection tool made of one's eyebrow. The protocol for assembling an adhesion assay is also given, which probes for the presence of key adhesion molecules present on the surface organizer or animal pole cells that are critical for proper development.

Dissezione di organizzatore e Espianti Polo animali da embrioni di Xenopus laevis e montaggio di un saggio Adesione Cellulare

Ricerca

Biologia

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

Incorporare plastica e Sezionamento embrioni di Xenopus laevis

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

Ottenere uova da Xenopus laevis Femmine

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Preparazione e frazionamento di Xenopus laevis Egg Estratti

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microiniezione degli ovociti di Xenopus Laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Mammary Epithelial Transplant Procedure

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, followed by the mammary epithelial transplant procedure. The mammary transplant procedure is widely used by mammary biologists because it takes advantage of the fact that significant development of the mammary epithelium doesn't occur until after puberty. At 3 weeks of age, growth of the mammary epithelial tree is confined to the vicinity of the nipple and the fat pad is largely devoid of mammary epithelium, but by 7 weeks of age the epithelial ductal tree extends throughout the entire fat pad. Therefore, if this small portion of the fat pad containing epithelium, the region between the nipple and the lymph node, is removed at 3 weeks of age, the endogenous epithelium will never populate the mammary fat pad and the fat pad is described as "cleared". At this time, mammary epithelium from another source can be transplanted in the cleared fat pad where it has the potential to extend mammary ductal trees through out the fat pad. This procedure has been utilized in many experimental models including the examination of tumor phenotype in transgenic mammary epithelial tissue without the confounding effects of genotype on the entire animal3, in the identification of mammary stem cells by transplanting cells in limited dilution4,5, determining if hyperplastic nodules proceed to mammary tumors6, and to assess the effect of prior hormone exposure on the behavior of the mammary epithelium7,8.
Three week old host mice are anesthetized, cleaned and restrained on a surgical stage. A mid-sagittal incision is made through the skin, but not the peritoneum, extending from the pubis to the sternum. Oblique cuts are made through the skin from the mid-sagittal incision across the pelvis toward each leg. The skin is pulled away from the peritoneum to expose the 4th inguinal mammary gland. The fat pad is cleared by removing the fat pad tissue anterior to the lymph node. Epithelium fragments or epithelial cells are transplanted into the remaining cleared fat pad and the mouse is closed.

This article demonstrates the procedure developed by DeOme KB et al. (1959) and the sparing procedure developed by Brill B et al. (2008) for clearing the 4th inguinal mammary fat pad of a pubescent mouse in preparation for transplantation of mammary fragments, mammary epithelial cells, or mammary tumor cells.

Procedura di trapianto epiteliali mammarie

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Live-cell imaging e analisi quantitativa della embrionali in cellule epiteliali Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later stages of embryonic development, and to define how enhancers and promoters regulate gene expression within the embryo. The protocol demonstrated here can be used to efficiently produce transgenic Xenopus laevis embryos. This transgenesis approach involves three parts: 1. Sperm nuclei are isolated from adult X. laevis testis by treatment with lysolecithin, which permeabilizes the sperm plasma membrane. 2. Egg extract is prepared by low speed centrifugation, addition of calcium to cause the extract to progress to interphase of the cell cycle, and a high-speed centrifugation to isolate interphase cytosol. 3. Nuclear transplantation: the nuclei and extract are combined with the linearized plasmid DNA to be introduced as the transgene and a small amount of restriction enzyme. During a short reaction, egg extract partially decondenses the sperm chromatin and the restriction enzyme generates chromosomal breaks that promote recombination of the transgene into the genome. The treated sperm nuclei are then transplanted into unfertilized eggs. Integration of the transgene usually occurs prior to the first embryonic cleavage such that the resulting embryos are not chimeric. These embryos can be analyzed without any need to breed to the next generation, allowing for efficient and rapid generation of transgenic embryos for analyses of promoter and gene function. Adult X. laevis resulting from this procedure also propagate the transgene through the germline and can be used to generate lines of transgenic animals for multiple purposes.

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

This video protocol demonstrates a method for generating transgenic Xenopus laevis by introduction of transgenes into sperm nuclei followed by nuclear transplantation into unfertilized eggs.

Produzione di transgenici Xenopus laevis Integrazione mediata da enzima di restrizione e trapianto nucleare

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

Trapianti viso a<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embrioni

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and widely-utilized +TIPs for analyzing MT dynamics is the End-Binding protein, EB1, which binds all growing MT plus-ends, and thus, is a marker for MT polymerization1. Many studies of EB1 behavior within growth cones have used time-consuming and biased computer-assisted, hand-tracking methods to analyze individual MTs1-3. Our approach is to quantify global parameters of MT dynamics using the software package, plusTipTracker4, following the acquisition of high-resolution, live images of tagged EB1 in cultured embryonic growth cones5. This software is a MATLAB-based, open-source, user-friendly package that combines automated detection, tracking, visualization, and analysis for movies of fluorescently-labeled +TIPs. Here, we present the protocol for using plusTipTracker for the analysis of fluorescently-labeled +TIP comets in cultured Xenopus laevis growth cones. However, this software can also be used to characterize MT dynamics in various cell types6-8.

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

The MATLAB-based, open source software package, plusTipTracker, can be used to analyze image series of fluorescently-labeled +TIPs to quantify microtubule dynamics.

Utilizzo plusTipTracker software per misurare Microtubulo Dynamics in<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; coni di crescita

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...