Este trabalho foi financiado por doações da Pesquisa para prevenir a cegueira (prémios de carreira para o Desenvolvimento MEZ e ASV e uma subvenção de irrestrito ao Departamento de Oftalmologia), o E. Matilda Zeigler Foundation (MEZ e ASV) e do National Eye Institute / NIH (MEZ , subvenções e R01EY015748 R01EY017964).

Parte I. Set-up para o ensaio ACT <ol><li> Gerar RNA tampado para injeção, como sugerido pelo fabricante, usando seus fenol: clorofórmio método de purificação (por exemplo, mMessage mMachine Kit; Applied Biosystems / Ambion, Austin, TX). RNA que codifica uma proteína fluorescente é utilizado como marcador. Transcrevemos ou proteína fluorescente amarela (YFP) ou mCherry 5 cDNA, que está em um vetor de expressão pCS2 +. </li><li> Puxe tubos de vidro de borosilicato capilar para formar dicas de vidro cônico utilizando um extrator micropipeta. Usamos Sutter Micropipeta Puller, P-97 (Sutter Instruments, Inc., Novato, CA), como descrito anteriormente 6. </li><li> Faça soluções estéreis na Tabela 1 a partir de um 10 X Marc Modificado Ringer (MMR) solução estoque (10 mM MgCl 2, 20 mM KCl, 20 mM CaCl 2, 50 HEPES mM; 1 M NaCl; ajustado para pH 7,5, autoclavado e armazenado a RT). </li><li> Isolar os testículos de um sapo macho e armazenar o tecido a 4 ° C em uma solução estéril de 1X MMR / gentamicina (50 mcg / ml de sulfato de gentamicina; BioWhittaker, Cat # 17-518Z). Isto pode ser feito até uma semana antes do início do experimento, mas é perde a sua eficácia ao longo do tempo. </li><li> Solução de postura (1X: 150 mM NaCl, 2,62 mM KCl, 0,8 mM Na 2 HPO 4, 20 mM Trizma base, 2,62 mM NaHCO 3 e 2,75 mM MgSO 4, ajustada para pH 7,6) pode ser feita como um estoque de 8X, o que pode ser armazenado a 4 ° C por até duas semanas. Nota: cuidado com a contaminação nesta solução, pois isso afetará a qualidade de seus ovos. </li><li> Gerar placas de injeção. Para fazer isso, derreta agarose 1% em 0.4X MMR no microondas, adicione ~ 6 mL de solução de agarose derretida em 60 placas mm, gentilmente unroll um molde de elastômero (Figura 1) no topo da solução para evitar bolhas e deixe esfriar por cerca de 20 minutos em temperatura ambiente. Para determinar o número necessário, considerar o número de condições experimentais (por exemplo, 1, YFP, 2, YFP Noggin +) eo número de embriões transplantados anfitrião necessário. Para nossos experimentos, nós geramos pelo menos 20 embriões anfitrião transplantadas para cada condição experimental. Em 18-19 ° C, os embriões serão no estádio de 15 para cerca de uma hora. Se demorar uma hora para realizar 20 transplantes, em seguida, dois momentos de fertilização são necessários, assumindo os embriões anfitrião aceitar todos os transplantes. Portanto, quatro pratos de injeção serão necessários (2 x 2 condições exp momentos de fertilização = 4). Armazenar as placas a 4 ° C por até uma semana. </li><li> Gerar placas de isolamento usando boné de agarose 1% + 0.7X MMR com moldes como para a placa de injeção. Faça o mesmo número de isolamento cap como placas de injeção de mais um ponto extra por tempo de fertilização (4 + 2 pontos de tempo de fertilização = 6). </li><li> Injetar fêmeas com 500 unidades gonadotrofina coriônica humana no final do dia, no dia anterior microinjeção. Fêmeas loja em 16-18 ° C durante a noite. </li></ol> Parte II. RNA microinjeção de embriões Xenopus laevis A. Preparação para a microinjeção <ol><li> Retire do sexo feminino hormonalmente induzido e colocá-los em tanques individuais contendo solução de 1X postura (ELS). Nota: nós não usamos ovos que foram na ELS mais de duas horas como a qualidade dos ovos é reduzida. Portanto, cerca de uma hora antes da fertilização in vitro, descartamos todos os ovos do tanque de modo que apenas ovos recém estabelecidos são coletados. </li><li> Prepare a agulha para a microinjeção cortando fora a ponta para obter um diâmetro de 25-35 mM. Coloque a agulha na picoinjector e calibrá-lo para que ele dispensa 10 nL por injeção. </li><li> Definir uma incubadora a 14 ° C. </li><li> Uma vez que as fêmeas colocaram ovos por cerca de uma hora, retire os ovos do tanque usando uma pipeta e colocá-los em 60 milímetros pratos de Petri. Remover o ELS muito com os ovos quanto possível e substituí-1X MMR. Os ovos podem ser fertilizados imediatamente ou permanecer no MMR 1X por até uma hora. Para o ensaio de transplante, é melhor para fertilizar dois pratos, 80% de sua capacidade de uma única camada de ovos em até três lotes separados em cerca de 11 horas da manhã, meio-dia e 01:00. Após a injeção, eles serão colocados a 14 ° C para que possam crescer para os estágios desejado para o isolamento da tampa (estágio 8,5-9) e transplante (estágio 15; consulte a Parte I, n º 6 acima). </li><li> Para verificar a qualidade dos testículos, realizamos uma fertilização da manhã (~ 08:00), o que nos permite extrair os testículos de outro macho, se o esperma do primeiro não é viável. Nota: nós homogeneizar ~ 0,25 testículos em 1 mL 1X MMR e adicionar cerca de 5 a 7 gotas por placa de oócitos. </li><li> In vitro fertilizar os ovos com testículos homogeneizado e, uma hora depois, remova a camada de geléia sobre os ovos com geléia de-solução (164μl 1M TDT + 10 ml 1M Tris, pH 8,8 até 50 mL de água NanoPure autoclavado). Espere até que eles atinjam duas células estágio para começar a classificação, que leva cerca de 2 horas a 18 horas ou 1,5 ° C em temperatura ambiente (22 ° C). </li><li> Usando uma transfer pipeta, os embriões tipo uniformemente pigmentada e uniformemente dividindo, como mostrado no cap animais deixados na Figura 3, no poço de um prato cheio de injeção 0.4X MMR Ficoll + 6%. </li></ol> Microinjeção B. <ol><li> Estiramento Parafilm por cima de uma tampa 60 milímetros placa de Petri. Pipetar 2 mL da sua amostra de RNA primeiro para o Parafilm e aspirado usando o PLI-100 para preencher sua agulha de injeção. Certifique-se de verificar se a agulha é ainda dispensar 10 nL de amostra antes de iniciar a injeção. </li><li> Injetar 20-30 embriões duas células-stage (ambos blastômeros) com 500 pg YFP RNA em um prato e seu gene de interesse (por exemplo, 20 pg Noggin RNA), mais RNA YFP no outro prato 7. </li><li> Coloque 100-200 não injetados embriões por ponto de tempo em um outro prato de injeção com a solução de Ficoll. Movê-los dentro e fora da incubadora, ao mesmo tempo como os embriões injetados. Estes são os hosts para ser usado na Parte IV. </li><li> Após a injeção, incubar todos os embriões de 14 ° C durante a noite. Repita o procedimento para todos os momentos. </li></ol> Parte III. Isolar as tampas de animais a partir de embriões injetados <ol><li> Chegar no início da manhã para a fase de embriões. O ponto mais tempo deve ser a etapa 9. Remover aqueles que não sobreviveram. Prosseguir com os passos seguintes a trabalhar com cada momento em lotes. </li><li> Decantar a solução de Ficoll de cada prato e adicione MMR volta 0.7X / solução gentamicina. A um prato de isolamento da tampa, adicione uma generosa quantidade de 0.7X solução MMR / gentamicina. Desalojar embriões de seus poços de injeção prato utilizando uma pipeta e coloque no prato recém-preparados tampa de isolamento. </li><li> Isolar tampas animal em 0.7X MMR solução de gentamicina +, mantendo-se 2 ou 3 embriões intactos para o estadiamento. Ou o Gastromaster, equipado com uma ponta amarela dobrado para 400 m, ou um par de pinças afiadas número 5 pode ser usado. </li><li> Coloque as tampas de volta em 14 ° C incubadora até o dia seguinte. Os embriões host devem ser retirados da incubadora, ao mesmo tempo como as tampas para mantê-los no mesmo estágio de desenvolvimento como o tecido do doador. </li></ol> Parte IV. Transplante de tampas em flanco <ol><li> Retire as tampas e os embriões do primeiro ponto temporal a partir do 14 ° C incubadora e estágio dos embriões. De classificação para uniforme amarelo ou vermelho fluorescente-positivos bonés, dependendo da injetado marcador (Figura 2). </li><li> Contar o número de tampas e remover o dobro do número de estágio 13/12 embriões para um prato de injeção preparados na hora com 0.7X MMR / solução gentamicina. Com uma pinça afiada # 5, remover a membrana vitelina de cada um. Transferi-los para o prato com as tampas, mas tenha cuidado. Sem suas membranas vitelínico, os embriões podem rapidamente se dissociam na superfície da água. </li><li> Usando o gastromaster (ponta amarela, fio 200-250μm dobrado, configuração mais alta) ou # 5 fórceps, remover um 200 mM quadrado do lado do embrião em estágio 14-15 (Figura 3). Em seguida, corte uma tampa no meio (com o gastromaster ou o # 5 fórceps) e colocar o tecido no buraco feito no embrião hospedeiro. Gire o embrião contra o bem para permitir a cicatrização. Faça isso para embriões como muitos como você pode, enquanto eles estão na fase 15. Repita o procedimento para todos os momentos. </li><li> O embrião heal geralmente dentro de 30 minutos. Remove as células mortas (branco) com um movimento suave escovação com uma pinça # 5. Cultivá-las a 18 ° C durante a noite. </li><li> Sob o microscópio de fluorescência de dissecação, os embriões tipo fluorescente com marcado com tecido, transplantado. Colocá-los de volta a 18 ° C a crescer até o estágio 42-43. </li><li> Anestesiar os animais em tricaina. Neste ponto, você pode tirar fotos sob um microscópio de fluorescência de dissecação. Depois de terminar, reparo, seção e immunostain ou executar hibridização in situ utilizando marcadores para o seu tecido de interesse. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Projeto de Plexiglass para a fundição do molde de elastômero usado para fazer pratos segurando embrião. A 38 x 38 mm quadrado redondo pontas (~ 5 mm de profundidade) foi derrotado fora de um pedaço de Plexiglass que é quadrado 50 x 50 mm e 25 mm de espessura. Circular, poços espaçados (1,5 mm de diâmetro) foram perfurados 1 mm de espessura no plástico. Para fazer o molde de elastômero para os pratos microinjeção, nós derramou elastômero Sylgard no Plexiglass e permitiu que a solidificar, conforme instruções do fabricante. Este molde de elastômero é utilizado para fazer a injeção e as placas de isolamento cap. <img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Cap animais triagem antes do transplante é importante, como expressão pode variar. Cap animais à esquerda expressa mCherry uniformemente em todo o tecido enquanto o explante na direita tem expressão irregular e serão descartados. <img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. A tadp anfitriãoole desenvolveu uma estrutura de olhos, como no seu flanco a partir de células transplantadas cap animal. fluorescentes Uma imagem foi sobreposta na imagem de campo claro.

<ol>
	<li>Smith, W. C., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+cloning+of+noggin,+a+new+dorsalizing+factor+localized+to+the+Spemann+organizer+in+Xenopus+embryos.">Expression cloning of noggin, a new dorsalizing factor localized to the Spemann organizer in Xenopus embryos.</a> Cell. 70, 829-840 (1992).</li><li>Lamb, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+induction+by+the+secreted+polypeptide+noggin.">Neural induction by the secreted polypeptide noggin.</a> Science. 262, 713-718 (1993).</li><li>Green, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Methods+in+Developmental+Biology:+Xenopus+&#38;+Zebrafish.">Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus &#38; Zebrafish.</a> Methods in Developmental Biology. , (1999).</li><li>Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+eyes+from+pluripotent+cells.">Generation of functional eyes from pluripotent cells.</a> PLoS Biol. 7, e1000174-e1000174 (2009).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2, 905-909 (2005).</li><li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+patch-pipettes+and+sharp+electrodes+with+a+programmable+puller.">Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Lan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noggin+Elicits+Retinal+Fate+in+Xenopus+Animal+Cap+Embryonic+Stem+Cells.">Noggin Elicits Retinal Fate in Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cells. , (2009).</li></ol>

Neste vídeo, demonstramos a nossa versão de técnicas clássicas utilizadas por biólogos Xenopus, que reorganizados para criar o animal ensaio transplante cap. À temperatura ambiente, os embriões Xenopus desenvolver muito rapidamente através de estágios 9 e 15. Colocando-os a 14 ° C, o desenvolvimento do embrião é lento e transplantes muito mais pode ser realizado em um experimento. Se for necessário para crescer os embriões para estágios mais velhos (&gt; 42/43), então recomendamos o uso...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>mMessage mMachine SP6 Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Applied Biosystems/Ambion</td>
<td>AM1340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Borosilicate Capillary Tubes (1.0mm OD x 0.5mm ID)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FHC, Inc</td>
<td>27-30-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sutter Micropipette Puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments, Inc.</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gentamicin sulfate [50 mg/ml]</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BW17-528Z</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sylgard/elastomer Kit 1.1lb</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>NC9644388</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>60 x 15 mm polystyrene petri dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USA Scientific</td>
<td>8609-0160</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>human chorionic gonadotropin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Intervet</td>
<td>22219</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pico-Injector Microinjection Systems</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>650003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Torrey Pines Scientific ECHOtherm Incubator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>11-680-21</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Transfer pipette</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Krackeler</td>
<td>6290-20635A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumostar #5 Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>11295-10</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

tissue determination using the animal cap transplant (act) assay in xenopus laevis

Muitas proteínas desempenham um duplo papel no desenvolvimento embrionário. Aqueles que regulam a determinação destino celular em um determinado tecido também pode afetar o desenvolvimento de uma região maior do embrião. Isso faz com que definir seu papel em um tecido especial difíceis de analisar. Por exemplo,<em&gt; Noggin</em&gt; Superexpressão em<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embriões provoca a expansão de toda a região anterior, incluindo o olho<sup&gt; 1,2</sup&gt;. A partir deste resultado, não se sabe se Noggin desempenha um papel direto na determinação olho ou que, causando uma expansão do tecido neural, Noggin indiretamente afeta a formação do olho. Tendo este fenótipo complexo faz estudar o seu papel específico olho na determinação destino celular difícil de analisar. Temos desenvolvido um ensaio que supera este problema. Aproveitando-se da natureza pluripotentes da<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Animal cap<sup&gt; 3</sup&gt;, Temos desenvolvido um ensaio para testar a capacidade do produto gene (s), como<em&gt; Noggin</em&gt; Ou o olho fatores de transcrição de campo (EFTFs), para transformar as tampas em tecido especial ou tipos de células através do transplante desse tecido para o lado do embrião<sup&gt; 4</sup&gt;. Embora tenhamos encontrado um ou outro tratamento de proteína Noggin ou um conjunto de fatores de transcrição pode determinar o destino de células da retina em tampas de animal, este procedimento poderia ser usado para identificar produto do gene (s) envolvidos na especificação outros tecidos também.

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Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Superexpressão de genes animais tampas de produto (s) são transplantadas para o flanco de desenvolver<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embriões, a fim de estabelecer se o tecido é determinada.

Determinação tecido Usando o Transplante Cap Animal (ACT) em Ensaio Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

tissue-determination-using-animal-cap-transplant-act-assay-xenopus

Research

JoVE Journal

Biology

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

12.3K visualizações.  SUNY Upstate Medical University. Superexpressão de genes animais tampas de produto (s) são transplantadas para o flanco de desenvolver Xenopus laevis Embriões, a fim de estabelecer se o tecido é determinada.

Vídeo: Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

This video demonstrates the technique used for preparation of organizer and animal pole explants from Xenopus laevis embryos, including the use of the eyebrow knife - a specialized dissection tool made of one's eyebrow. The protocol for assembling an adhesion assay is also given, which probes for the presence of key adhesion molecules present on the surface organizer or animal pole cells that are critical for proper development.

Dissecção do Organizador e Explantes Pólo animal a partir de embriões Xenopus laevis e Montagem de um ensaio de Adesão Celular

Biologia

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

Incorporação de plástico e secção de embriões Xenopus laevis

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

Obtenção de ovos de Xenopus laevis fêmeas

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Preparação e fracionamento de Xenopus laevis Egg Extractos

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microinjeção de Oócitos Xenopus laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Mammary Epithelial Transplant Procedure

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, followed by the mammary epithelial transplant procedure. The mammary transplant procedure is widely used by mammary biologists because it takes advantage of the fact that significant development of the mammary epithelium doesn't occur until after puberty. At 3 weeks of age, growth of the mammary epithelial tree is confined to the vicinity of the nipple and the fat pad is largely devoid of mammary epithelium, but by 7 weeks of age the epithelial ductal tree extends throughout the entire fat pad. Therefore, if this small portion of the fat pad containing epithelium, the region between the nipple and the lymph node, is removed at 3 weeks of age, the endogenous epithelium will never populate the mammary fat pad and the fat pad is described as "cleared". At this time, mammary epithelium from another source can be transplanted in the cleared fat pad where it has the potential to extend mammary ductal trees through out the fat pad. This procedure has been utilized in many experimental models including the examination of tumor phenotype in transgenic mammary epithelial tissue without the confounding effects of genotype on the entire animal3, in the identification of mammary stem cells by transplanting cells in limited dilution4,5, determining if hyperplastic nodules proceed to mammary tumors6, and to assess the effect of prior hormone exposure on the behavior of the mammary epithelium7,8.
Three week old host mice are anesthetized, cleaned and restrained on a surgical stage. A mid-sagittal incision is made through the skin, but not the peritoneum, extending from the pubis to the sternum. Oblique cuts are made through the skin from the mid-sagittal incision across the pelvis toward each leg. The skin is pulled away from the peritoneum to expose the 4th inguinal mammary gland. The fat pad is cleared by removing the fat pad tissue anterior to the lymph node. Epithelium fragments or epithelial cells are transplanted into the remaining cleared fat pad and the mouse is closed.

This article demonstrates the procedure developed by DeOme KB et al. (1959) and the sparing procedure developed by Brill B et al. (2008) for clearing the 4th inguinal mammary fat pad of a pubescent mouse in preparation for transplantation of mammary fragments, mammary epithelial cells, or mammary tumor cells.

Procedimento de transplante do epitélio mamário

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Em células vivas, Imagem e Análise Quantitativa de células embrionárias epiteliais em Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later stages of embryonic development, and to define how enhancers and promoters regulate gene expression within the embryo. The protocol demonstrated here can be used to efficiently produce transgenic Xenopus laevis embryos. This transgenesis approach involves three parts: 1. Sperm nuclei are isolated from adult X. laevis testis by treatment with lysolecithin, which permeabilizes the sperm plasma membrane. 2. Egg extract is prepared by low speed centrifugation, addition of calcium to cause the extract to progress to interphase of the cell cycle, and a high-speed centrifugation to isolate interphase cytosol. 3. Nuclear transplantation: the nuclei and extract are combined with the linearized plasmid DNA to be introduced as the transgene and a small amount of restriction enzyme. During a short reaction, egg extract partially decondenses the sperm chromatin and the restriction enzyme generates chromosomal breaks that promote recombination of the transgene into the genome. The treated sperm nuclei are then transplanted into unfertilized eggs. Integration of the transgene usually occurs prior to the first embryonic cleavage such that the resulting embryos are not chimeric. These embryos can be analyzed without any need to breed to the next generation, allowing for efficient and rapid generation of transgenic embryos for analyses of promoter and gene function. Adult X. laevis resulting from this procedure also propagate the transgene through the germline and can be used to generate lines of transgenic animals for multiple purposes.

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

This video protocol demonstrates a method for generating transgenic Xenopus laevis by introduction of transgenes into sperm nuclei followed by nuclear transplantation into unfertilized eggs.

Produção de transgênicos Xenopus laevis Por Restrição Integração Mediada por Enzima e Transplante Nuclear

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

Transplantes faciais em<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Os embriões

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and widely-utilized +TIPs for analyzing MT dynamics is the End-Binding protein, EB1, which binds all growing MT plus-ends, and thus, is a marker for MT polymerization1. Many studies of EB1 behavior within growth cones have used time-consuming and biased computer-assisted, hand-tracking methods to analyze individual MTs1-3. Our approach is to quantify global parameters of MT dynamics using the software package, plusTipTracker4, following the acquisition of high-resolution, live images of tagged EB1 in cultured embryonic growth cones5. This software is a MATLAB-based, open-source, user-friendly package that combines automated detection, tracking, visualization, and analysis for movies of fluorescently-labeled +TIPs. Here, we present the protocol for using plusTipTracker for the analysis of fluorescently-labeled +TIP comets in cultured Xenopus laevis growth cones. However, this software can also be used to characterize MT dynamics in various cell types6-8.

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

The MATLAB-based, open source software package, plusTipTracker, can be used to analyze image series of fluorescently-labeled +TIPs to quantify microtubule dynamics.

Usando plusTipTracker software para medir Microtubule Dynamics em<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Cones de Crescimento

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...