Bu çalışma, Körlük (Kariyer Geliştirme MEZ ve ASV Ödüller ve sınırsız ödenekle Göz Hastalıkları Bölümü), E. Matilda Zeigler Vakfı (MEZ ve ASV) ve Ulusal Göz Enstitüsü / NIH (MEZ Önlemek Araştırma hibeleri tarafından desteklenen , hibe R01EY015748 ve R01EY017964).

Bölüm I. ACT Testi için Set-up <ol><li> Kloroform arıtma yöntemi (Uygulamalı Biosystems / Ambion, Austin, Teksas örneğin mMessage mMachine Kit), fenol kullanarak üretici tarafından önerilen enjeksiyon için kapaklı RNA oluşturun. Floresan proteini kodlayan RNA bir izleme olarak kullanılır. Biz ya sarı floresan protein (YFP) veya bir pCS2 + ifade vektör cDNA mCherry 5, yazıya. </li><li> Mikropipet çektirmenin konik cam ipuçları oluşturmak için borosilikat cam kapiller tüplerin çekin. Biz Sutter Mikropipet Çektirme, P-97 (Sutter Instruments, Inc, Novato, CA), daha önce 6 tarif. </li><li> KCl 20 mM, 20 mM CaCl 2, 50 mM HEPES; 1 M NaCl, pH 7.5 ayarlanır, otoklava ve saklanan bir 10 X Marc Kullanıcı Modifiye Zil Kullanıcı (MMR) çözüm stok (10 mM MgCl 2 Tablo 1&#39;de steril solüsyonların olun RT). </li><li> Testisler erkek kurbağa izole etmek ve doku 1X MMR / gentamisin (50 mg / ml gentamisin sülfat; BioWhittaker, Kedi # 17-518Z) steril bir çözüm 4 ° C&#39;de saklamak. Bu deney başlamadan önce bir hafta kadar yapılabilir, ancak zaman içinde etkinliğini kaybeder. </li><li> Yumurtlama çözümü (1X: 150 mM NaCl, 2.62 mM KCl, 0.8 mM Na 2 HPO 4, 20 mM Trizma baz, 2.62 mM NaHCO 3 ve 2.75 mM MgSO 4; pH 7.6 düzeltilmiş), 8X stok olarak kılınan 4 saklanabilir ° C iki hafta kadar Not: Bu çözüm kirlenme dikkat, bu yumurta kalitesini etkiler. </li><li> Enjeksiyon tabak oluşturun. Bunu yapmak için, yavaşça kabarcıklarını engellemek ve yaklaşık soğuması için çözüm üstünde bir elastomer kalıp (Şekil 1) Penis, 60 mm tabak içine ~ 6 ml erimiş agaroz çözümü eklemek, bir mikrodalga 0.4X MMR% 1 agaroz eritebilir RT 20 dakika. Gerekli sayısını belirlemek için, deneysel koşullar sayısını düşünün (örneğin 1, YFP; 2, YFP + Noggin) ve nakledilen ana embriyoların sayısı gerekli. Deneyler için, biz her deneysel koşul için en az 20 nakledilen ev sahibi embriyolar üretmek. 18-19 ° C, embriyolar yaklaşık bir saat için 15 sahne olması. 20 nakli gerçekleştirmek için bir saat sürer, sonra iki gübreleme zaman noktalarında, ev sahibi embriyolar nakli kabul varsayarak ihtiyaç vardır. Bu nedenle, dört enjeksiyon yemekleri (2 exp x 2 gübreleme zaman noktalarında = 4) ihtiyaç duyulacaktır. Plakalar, bir haftaya kadar 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Enjeksiyon plaka için gibi kalıpları ile% 1 agaroz + 0.7X MMR kullanarak kap izolasyon plakaları oluşturun. Kap izolasyon enjeksiyon plakaları artı bir ekstra başına döllenme zamanı noktası (4 + 2 gübreleme zaman noktalarında = 6) olarak aynı sayıda olun. </li><li> Insan koryonik gonadotropin 500 adet mikroenjeksiyon önceki gün gün geç kadın enjekte edilir. Mağaza kadın ° C gecede 16-18. </li></ol> Bölüm II. Xenopus laevis embriyoların RNA Mikroenjeksiyon A. mikroenjeksiyon için hazırlanması <ol><li> Hormonal uyarılan kadın çıkarın ve 1X yumurtlama çözümü (ELS) Not içeren bireysel tankları koyun: ELS, yumurta kalitesi düşer olarak iki saatten fazla yumurta kullanmayın . Bu nedenle, sadece yeni yumurtlamada toplanır, böylece yaklaşık bir saat önce in vitro fertilizasyon, tankın tüm yumurta atmak. </li><li> Mikroenjeksiyon için iğne ucu kapalı kırpma 25-35 mikron çapında elde etmek için hazırlayın. Picoinjector yerleştirin ve üzerine iğne, enjeksiyon başına 10 nL dağıtır, böylece kalibre. </li><li> 14 ° C&#39;ye kadar bir inkübatör ayarlayın </li><li> Bir kez kadın yumurtladığı yaklaşık bir saat, bir transfer pipet kullanarak tank yumurta kaldırmak ve 60 mm Petri kapları içine yerleştirin. Mümkün olduğu kadar yumurtaları çok ELS olarak çıkarın ve 1X MMR ile değiştirin. Yumurtalar hemen döllenmiş veya bir saat için 1X MMR kalmak olabilir. Transplant tahlil için, üç ayrı gruplar halinde yaklaşık 11 am, öğle ve 13:00 iki çanak,% 80 kadar yumurta, tek katmanlı bir tam döllemek için en iyisidir. Enjeksiyondan sonra, 14 yaşında alınacaktır ° C kadar kap izolasyonu (evre 8,5-9) ve organ nakli için istenen aşamalarında büyüyecek (evre 15; yukarıda Ben # 6 Part). </li><li> Testislerin kalite kontrol etmek için, biz, ilk sperm uygulanabilir değilse, bize başka bir erkek testis ayıklamak için sağlayan bir sabah erken fertilizasyon (~ 08:00), gerçekleştirir. Not: 1 ml 1X MMR ~ 0.25 testisler homojenize ve oosit plaka başına yaklaşık 5 ila 7 damla ekleyin. </li><li> In vitro homojenize testisler ile yumurtaları döller ve bir saat sonra, de-jöle çözümü kullanarak yumurta jöle kat kaldırmak (164μl 1M DTT + 10 ml 1M Tris, pH 8.8, 50 ml otoklavlanmış nanopure su) . Oda sıcaklığında (22 ° C) ° C veya 1,5 saat 18 yaklaşık 2 saat sürer sıralama, başlamak için iki hücreli aşamaya ulaşmak kadar bekleyin. </li><li> Bir transfer pipet, sıralama, düzgün pigmentli ve eşit olarak bölerek embriyolar, 0.4X MMR +% 6 Ficoll ile dolu bir enjeksiyon çanağı kuyuya, sol hayvan kap Şekil 3&#39;te gösterilmiştir. </li></ol> B. Mikroenjeksiyon <ol><li> 60 mm Petri kabı kapağı üstünden Parafilm gerin. Pipet 2 ul enjeksiyon iğnesi doldurmak için PLI-100 kullanarak Parafilm ve aspirat üzerine ilk RNA örnek. Iğne, enjeksiyon başlamadan önce örnek hala 10 nL dağıtım olduğunu kontrol etmek için emin olun. </li><li> 7 başka bir çanak bir çanak 500 pg YFP RNA ve ilgi gen (örneğin 20 pg Noggin RNA) artı YFP RNA ile 20-30 iki hücreli dönem embriyoların (her iki blastomer) enjekte edilir. </li><li> Ficoll solüsyonu ile başka bir enjeksiyon çanak zaman noktası başına koyun 100-200 olmayan enjekte embriyolar. Inkübatör enjekte edilen embriyolar gibi, aynı zamanda onları içeri ve dışarı. Bu Bölüm IV kullanılmak üzere bilgisayarların. </li><li> Enjeksiyondan sonra, ° C gecede 14 embriyolar inkübe. Tüm zamanların puan için tekrarlayın. </li></ol> Bölüm III. Enjekte edilen embriyolardan hayvan kapakları Isolate <ol><li> Embriyoların sahne için sabahın erken saatlerinde ulaşıyoruz. Erken bir zaman noktasında sahne 9 olmalıdır. Hayatta olmadığını, bu çıkarın. Gruplar halinde her zaman noktası ile çalışan aşağıdaki adımları ile devam edin. </li><li> Her plaka Ficoll çözüm dökün ve geri 0.7X MMR / gentamisin çözeltisi ekleyin. Bir kap izolasyon çanak 0.7X MMR / gentamisin çözüm bol miktarda ekleyebilirsiniz. Bir transfer pipeti yeri ve taze hazırlanmış kapağı izolasyon çanak kullanarak enjeksiyon çanak kuyu embriyolar yerinden oynatın. </li><li> Evreleme için 2 veya 3 sağlam embriyolar tutmak, 0.7X MMR + gentamisin çözüm hayvan kapakları izole edin. Sarı bir ucu 400 mm için eğildi, ya da bir çift keskin sayısı 5 forseps ile donatılmış Gastromaster, Ya kullanılabilir. </li><li> Kapaklar, ertesi güne kadar 14 ° C inkübatör geri koyun. Donör dokusu aynı gelişim aşamasında onları tutmak için kapaklar aynı zamanda ev sahibi embriyolar inkübatör çıkarılmalıdır. </li></ol> Bölüm IV. Kanadını üzerine kapaklar Nakli <ol><li> 14 ° C inkübatör ilk kez noktadan kapakları ve embriyolar çıkarın ve embriyoların aşamasında. Tracer enjekte (Şekil 2) bağlı olarak tek tip sarı veya kırmızı floresan pozitif kapaklar, sıralayın. </li><li> Kapaklar sayısını ve 0.7X MMR / gentamisin çözeltisi ile taze hazırlanan enjeksiyon çanak sahne 12-13 embriyoların sayısı iki katına çıkarmak. Keskin # 5 forseps ile, her vitellin membran çıkarın. Kapaklar plaka aktarabilirsiniz, ancak dikkatli olun. Vitellin membranlar olmadan, embriyolar hızlı su yüzeyinde ayrılabilir. </li><li> Gastromaster (sarı ucu, 200-250μm bükülmüş tel, en yüksek ayar) veya # 5 forseps kullanarak, embriyo aşamasında 14-15 (Şekil 3) tarafında kare 200 mikron çıkarın. Daha sonra, yarım kap kesmek (gastromaster veya # 5 forseps) ve ev sahibi embriyo yapılan delik doku. Iyileşmesini sağlamak için iyi karşı embriyo döndürün. Aşamada 15 yaşında iken, mümkün olduğunca çok sayıda embriyolar olarak bunu yapın. Tüm zamanların puan için tekrarlayın. </li><li> Embriyo genellikle 30 dakika içinde iyileşir. # 5 forseps ile yumuşak bir fırçalama hareketi ile ölü hücreleri (beyaz) çıkarın. 18 ° C gecede bunları büyütün. </li><li> Diseksiyon floresan mikroskop altında floresan etiketli, nakledilen doku tür embriyoların. Onları geri koyalım 18 ° C aşamada 42-43 kadar büyümeye. </li><li> Tricaine hayvanların anestezisi. Bu noktada, floresan diseksiyon mikroskobu altında fotoğraf çekebilirsiniz. Yapıldıktan sonra, bölümünü düzeltmek ve ilgi doku belirteçleri kullanılarak in situ hibridizasyon immunostain veya gerçekleştirmek. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Tasarım embriyonun tutma yemekleri yapmak için kullanılan elastomer kalıp döküm için Pleksiglas. 38 x 38 mm yuvarlak köşeli kare (~ 5 mm derinliğinde) 50 x 50 mm kare ve 25 mm kalınlığında bir parça Pleksiglas yönlendirilir olmuştur. Dairesel, eşit aralıklı kuyuları (1.5 mm çap) 1 mm plastik derinliklerine delinmiştir. Mikroenjeksiyon yemekleri için elastomer kalıp yapmak için, üreticinin talimatlarına göre, Sylgard elastomer Pleksiglas içine dökülür ve katılaşmaya izin. Bu elastomer kalıp, enjeksiyon ve kap izolasyon plakaları yapmak için kullanılır. <img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. Ifadesi değişebilir Hayvan kap nakli için önce sıralama önemlidir. Soldaki Hayvan kapağı doku boyunca eşit mCherry ifade sağda eksplant sivilceli bir ifade vardır ve atılır . <img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. Bir ev sahibi tadpole, nakledilen hayvan kap hücrelerinden kanadında bir göz gibi bir yapı geliştirmiştir. floresan görüntü aydınlık görüntü üzerine yerleştirilmiştir olmuştur.

<ol>
	<li>Smith, W. C., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+cloning+of+noggin,+a+new+dorsalizing+factor+localized+to+the+Spemann+organizer+in+Xenopus+embryos.">Expression cloning of noggin, a new dorsalizing factor localized to the Spemann organizer in Xenopus embryos.</a> Cell. 70, 829-840 (1992).</li><li>Lamb, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+induction+by+the+secreted+polypeptide+noggin.">Neural induction by the secreted polypeptide noggin.</a> Science. 262, 713-718 (1993).</li><li>Green, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Methods+in+Developmental+Biology:+Xenopus+&#38;+Zebrafish.">Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus &#38; Zebrafish.</a> Methods in Developmental Biology. , (1999).</li><li>Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+eyes+from+pluripotent+cells.">Generation of functional eyes from pluripotent cells.</a> PLoS Biol. 7, e1000174-e1000174 (2009).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2, 905-909 (2005).</li><li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+patch-pipettes+and+sharp+electrodes+with+a+programmable+puller.">Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Lan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noggin+Elicits+Retinal+Fate+in+Xenopus+Animal+Cap+Embryonic+Stem+Cells.">Noggin Elicits Retinal Fate in Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cells. , (2009).</li></ol>

Bu video, hayvan kap nakli tahlil oluşturmak için yeniden düzenlenmiştir Xenopus biyologlar tarafından kullanılan klasik teknikleri, bizim sürümü göstermiştir. Oda sıcaklığında, Xenopus embriyolar evre 9 ve 15 ile çok hızlı bir şekilde gelişir. 14 yaşında yerleştirerek ° C, embriyo gelişimi yavaşladı ve çok daha fazla bir deneyde nakli yapılabilir. Yaşlı aşamaları (42/43) embriyolar büyümek için gerekli ise, o zaman biz büyük tetarlar enjekte floresan protein sinya...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>mMessage mMachine SP6 Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Applied Biosystems/Ambion</td>
<td>AM1340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Borosilicate Capillary Tubes (1.0mm OD x 0.5mm ID)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FHC, Inc</td>
<td>27-30-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sutter Micropipette Puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments, Inc.</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gentamicin sulfate [50 mg/ml]</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BW17-528Z</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sylgard/elastomer Kit 1.1lb</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>NC9644388</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>60 x 15 mm polystyrene petri dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USA Scientific</td>
<td>8609-0160</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>human chorionic gonadotropin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Intervet</td>
<td>22219</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pico-Injector Microinjection Systems</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>650003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Torrey Pines Scientific ECHOtherm Incubator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>11-680-21</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Transfer pipette</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Krackeler</td>
<td>6290-20635A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumostar #5 Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>11295-10</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

tissue determination using the animal cap transplant (act) assay in xenopus laevis

Çoğu protein, embriyonik gelişim ikili bir rol oynarlar. Belirli bir doku düzenleyen hücre kaderinin belirlenmesinde de daha geniş bir bölge embriyonun gelişimi etkileyebilir. Bu analiz etmek zor, belli bir doku rolünü tanımlayan hale getirir. Örneğin,<em&gt; Noggin</em&gt; Aşırı ekspresyonu<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embriyolar göz dahil olmak üzere, tüm ön bölgenin genişleme neden<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Bu sonucu, Noggin sinir dokusunun bir genişleme neden göz belirlenmesi ya da doğrudan bir rol oynar, Noggin dolaylı göz oluşumunu etkiler bilinmemektedir. Bu karmaşık bir fenotipe sahip hücre kaderinin belirlenmesinde göz özel rolünü analiz etmek zor eğitim yapar. Biz bu sorunun üstesinden bir test geliştirdiler. Pluripotent doğanın yararlanan<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Hayvan kap<sup&gt; 3</sup&gt;, Bizim gibi, gen ürünü (ler) yeteneğini test etmek için bir test geliştirdiler<em&gt; Noggin</em&gt; Ya da göz alan transkripsiyon faktörleri (EFTFs), embriyo yüzüne bu doku nakli, belirli bir doku veya hücre tipleri içine kapakları dönüştürmek için<sup&gt; 4</sup&gt;. Noggin protein tedavisi ya da transkripsiyon faktörlerinin bir toplama ya da hayvan kapakları retinal hücre kaderini belirleyecek olsa da, bu prosedür de diğer dokularda belirterek ilgili gen ürün (ler) tanımlamak için kullanılır.

Watch this Scientific Journal Video about Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis at JoVE.com

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Hayvan kapaklar eksprese gen ürün (ler), gelişmekte olan kanadını nakledilen<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embriyoların doku tespit olup olmadığının belirlenmesi için.

Doku belirlenmesi Hayvan Cap Nakli (ACT) Testi Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

tissue-determination-using-animal-cap-transplant-act-assay-xenopus

Research

JoVE Journal

Biology

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

12.3K Görüntüleme.  SUNY Upstate Medical University. Hayvan kapaklar eksprese gen ürün (ler), gelişmekte olan kanadını nakledilen Xenopus laevis Embriyoların doku tespit olup olmadığının belirlenmesi için.

Video: Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

This video demonstrates the technique used for preparation of organizer and animal pole explants from Xenopus laevis embryos, including the use of the eyebrow knife - a specialized dissection tool made of one's eyebrow. The protocol for assembling an adhesion assay is also given, which probes for the presence of key adhesion molecules present on the surface organizer or animal pole cells that are critical for proper development.

Organizatör ve Hayvan Kutbu eksplantlar Xenopus laevis Embriyolar ve Hücre Yapışma Testi Meclisi diseksiyonu

Biyoloji

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

Plastik gömülmesi ve Xenopus laevis Embriyolar Kesit

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

Xenopus laevis Dişiler Yumurta Alınması

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Xenopus laevis Yumurta hazırlanması ve Fraksiyonu ayıklar.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Xenopus laevis Oosit, Mikroenjeksiyon

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Mammary Epithelial Transplant Procedure

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, followed by the mammary epithelial transplant procedure. The mammary transplant procedure is widely used by mammary biologists because it takes advantage of the fact that significant development of the mammary epithelium doesn't occur until after puberty. At 3 weeks of age, growth of the mammary epithelial tree is confined to the vicinity of the nipple and the fat pad is largely devoid of mammary epithelium, but by 7 weeks of age the epithelial ductal tree extends throughout the entire fat pad. Therefore, if this small portion of the fat pad containing epithelium, the region between the nipple and the lymph node, is removed at 3 weeks of age, the endogenous epithelium will never populate the mammary fat pad and the fat pad is described as "cleared". At this time, mammary epithelium from another source can be transplanted in the cleared fat pad where it has the potential to extend mammary ductal trees through out the fat pad. This procedure has been utilized in many experimental models including the examination of tumor phenotype in transgenic mammary epithelial tissue without the confounding effects of genotype on the entire animal3, in the identification of mammary stem cells by transplanting cells in limited dilution4,5, determining if hyperplastic nodules proceed to mammary tumors6, and to assess the effect of prior hormone exposure on the behavior of the mammary epithelium7,8.
Three week old host mice are anesthetized, cleaned and restrained on a surgical stage. A mid-sagittal incision is made through the skin, but not the peritoneum, extending from the pubis to the sternum. Oblique cuts are made through the skin from the mid-sagittal incision across the pelvis toward each leg. The skin is pulled away from the peritoneum to expose the 4th inguinal mammary gland. The fat pad is cleared by removing the fat pad tissue anterior to the lymph node. Epithelium fragments or epithelial cells are transplanted into the remaining cleared fat pad and the mouse is closed.

This article demonstrates the procedure developed by DeOme KB et al. (1959) and the sparing procedure developed by Brill B et al. (2008) for clearing the 4th inguinal mammary fat pad of a pubescent mouse in preparation for transplantation of mammary fragments, mammary epithelial cells, or mammary tumor cells.

Meme Epitel Nakli Prosedürü

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Canlı hücre Görüntüleme ve Kantitatif Analiz Embriyonik Epitel Hücreleri Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later stages of embryonic development, and to define how enhancers and promoters regulate gene expression within the embryo. The protocol demonstrated here can be used to efficiently produce transgenic Xenopus laevis embryos. This transgenesis approach involves three parts: 1. Sperm nuclei are isolated from adult X. laevis testis by treatment with lysolecithin, which permeabilizes the sperm plasma membrane. 2. Egg extract is prepared by low speed centrifugation, addition of calcium to cause the extract to progress to interphase of the cell cycle, and a high-speed centrifugation to isolate interphase cytosol. 3. Nuclear transplantation: the nuclei and extract are combined with the linearized plasmid DNA to be introduced as the transgene and a small amount of restriction enzyme. During a short reaction, egg extract partially decondenses the sperm chromatin and the restriction enzyme generates chromosomal breaks that promote recombination of the transgene into the genome. The treated sperm nuclei are then transplanted into unfertilized eggs. Integration of the transgene usually occurs prior to the first embryonic cleavage such that the resulting embryos are not chimeric. These embryos can be analyzed without any need to breed to the next generation, allowing for efficient and rapid generation of transgenic embryos for analyses of promoter and gene function. Adult X. laevis resulting from this procedure also propagate the transgene through the germline and can be used to generate lines of transgenic animals for multiple purposes.

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

This video protocol demonstrates a method for generating transgenic Xenopus laevis by introduction of transgenes into sperm nuclei followed by nuclear transplantation into unfertilized eggs.

Transgenik, üretimi Xenopus laevis Kısıtlama Enzim aracılığı ile Entegrasyon ve Nükleer Nakli

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

Yüz Nakli<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embriyolar

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and widely-utilized +TIPs for analyzing MT dynamics is the End-Binding protein, EB1, which binds all growing MT plus-ends, and thus, is a marker for MT polymerization1. Many studies of EB1 behavior within growth cones have used time-consuming and biased computer-assisted, hand-tracking methods to analyze individual MTs1-3. Our approach is to quantify global parameters of MT dynamics using the software package, plusTipTracker4, following the acquisition of high-resolution, live images of tagged EB1 in cultured embryonic growth cones5. This software is a MATLAB-based, open-source, user-friendly package that combines automated detection, tracking, visualization, and analysis for movies of fluorescently-labeled +TIPs. Here, we present the protocol for using plusTipTracker for the analysis of fluorescently-labeled +TIP comets in cultured Xenopus laevis growth cones. However, this software can also be used to characterize MT dynamics in various cell types6-8.

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

The MATLAB-based, open source software package, plusTipTracker, can be used to analyze image series of fluorescently-labeled +TIPs to quantify microtubule dynamics.

Içinde Mikrotubul Dynamics Tedbir plusTipTracker Yazılım Kullanma<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Büyüme Konileri

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...