وتدعم هذه الدراسة من قبل الولايات المتحدة الصحة العامة خدمة المنح DK - 081527 ، 072473 وDK DK - 20595 لجامعة شيكاغو ومركز أبحاث السكري التدريب (الحيوان النماذج الأساسية) ، وهبة من مؤسسة أسرة Kovler.

الجزء 1 : إعداد العينات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان ماوس تحت المجهر تشريح ، وإزالة كامل البنكرياس مع الاثني عشر والطحال لا تزال تعلق ، ومكان الأجهزة على شريحة زجاجية قبل زنه. إزالة الاثنى عشر عن طريق قطع النسيج الضام لها على طول الجانب ، حيث كان من المحتم أن البنكرياس. قطع وإزالة الطحال والدهون الزائدة في البنكرياس حتى يتم معزولة تماما البنكرياس على الشريحة. (الدهون البنكرياس تكون مميزة من خلال لونه أبيض ، ومتباينة من لون أغمق قليلا وتانر من نسيج البنكرياس). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان ساترة (كبير يغطي زجاج 50x75mm ؛ القياسية تغطية 25x75mm الزجاج) على البنكرياس بحيث يغطي تماما عليه. استخدام الوزن (على سبيل المثال كتاب الثقيلة) إلى تسطيح البنكرياس بين الشرائح وغلافه. اعتمادا على الوزن ، وتسطيح البنكرياس يستغرق حوالي خمس دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلع الوزن. إذا البنكرياس جيدا بالارض ضد الشريحة ، وضعه في بارافورمالدهيد 4 ٪ (PFA) في 4 درجات مئوية خلال الليل. في الصباح ، وإزالة coverslips وفضح جيدا البنكرياس كله لمنهاج العمل خلال النهار (6-8 ساعات). إذا البنكرياس ليس جيدا ثابتة ، تسمح لها بالبقاء في منهاج العمل لفترة أطول ، وربما بين عشية وضحاها. نقل الشرائح إلى الحاوية مع 1 ٪ تريتون مخزنة X - 100 في الفوسفات الملحي (PBS) بين عشية وضحاها. اليوم التالي ، نقل الشرائح إلى الحاوية من السكروز المشبعة لمدة 1-2 أيام. ثم نقل الشرائح إلى وعاء يحتوي على الجلسرين 100 ٪ حتى يتم تطهير الأنسجة ، والذي يسمح لهذا القرار الأمثل للإشارات الفلورية ؛ تطهير الأنسجة يستغرق 1-3 أيام تقريبا. (قد اشارات الفلورسنت تستمر لأسابيع ، بل وأشهر ، ولكن يجب أن يتم تنفيذ التصوير بعد فترة وجيزة تم مسح الأنسجة لقرار الأمثل.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين البنكرياس في منطقة مظلمة وباردة من أجل الحفاظ على الجهاز وإشاراته الفلورسنت. </li></ol> الجزء 2 : التصوير وقياس منطقة بيتا في البنكرياس خلية سليمة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الملقط أو اليدين القفاز ، واتخاذ الشريحة خارج الحاوية مع الجلسرين بنسبة 100 ٪. تحضير الشرائح للتصوير بواسطة محو الجلسرين الزائدة وتنظيف حصرا الجزء الخلفي من غطاء زجاجي مع الايثانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> افتح البرنامج StereoInvestigator (MicroBrightField ، ويليستون ، VT) وحدد الهدف عدسة التصوير 2X عن الفئران بنكرياسات مضى عليها أكثر من 3 أسابيع على الشرائح الزجاجية الكبيرة ، أو لعدسة الهدف 10X الفئران التصوير بنكرياسات الذين تقل أعمارهم عن 3 أسابيع ضغط coverslips 25mm بين البلدين. تصور صورة عن طريق وضع لحية صورة (صورة → الصورة الحية). تحديد زمن التعرض أن يبين بوضوح GFP الموسومة خلايا بيتا. (صورة تعريض قليلا يستبعد أصغر الجزر وخلايا بيتا ، بينما overexposing يخلق صورة إشارات خاطئة إضافية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فوق أي مكان على الشاشة لإنشاء نقطة مرجعية ، والشروع في رسم كفاف حول البنكرياس بأكمله. بدء عملية شريحة الظاهري (صورة → اكتساب شريحة الظاهري). تحديد واختيار أفضل الطائرة أي اتصال ، وطائرة وفقا لأعلى عدد من الجزر وضوحا وتركيزا وخلايا بيتا على محور Z - التمرير بواسطة مقبض التركيز. المختار مرة واحدة ، StereoInvestigator يلتقط تلقائيا الصورة المعروضة على الشاشة. مع المرحلة الميكانيكي ، وميزة شريحة الظاهري يلتقط كل لوحة بالتسلسل كصورة بصرية متميزة داخل كفاف رسمها (الشكل 1A) ثم يجمع كل منهم صورة واحدة ودمج (الشكل 1B). الظاهري التصوير شريحة يستخدم التكوين epifluorescent أي widefield المرشحات التي تسمح للكاميرا لالتقاط جميع الإشارات الحالية على عمق معين ، بما في ذلك أولئك الذين لا تماما في التركيز ، حتى أن الشريحة النهائية الظاهري متكامل ثنائي الأبعاد الصورة التي ليست بحد أقصى الإسقاط من إعادة الإعمار ثلاثي الأبعاد في البنكرياس كله. متوسط ​​مسح شريحة الظاهري الساعة 30 دقيقة لكل عينة ، ولكن يمكن أن يستغرق فترة تصل الى ساعة لالبنكرياس كبيرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد حفظ الصورة ، ويبدأ تحليله من خلال فتح الصورة مع ImageJ. عند انتهاء تحميل الصور ويظهر على الشاشة ، وفتح وتشغيل التحليل الظاهري شريحة الماكرو ( <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/1970/Supplementary_material 1.pdf">مواد تكميلية 1</a> ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتبع التعليمات خطوة بخطوة التي تقدمها الكلية. القضاء على القطع الأثرية التي أنشأتها مبعثر غير المرغوب فيه الضوء على &quot;العصا السحرية&quot; و &quot;تحديد المنطقة&quot; الأدوات. الاختيار لا لزوم لها وطرح خلفية من الصورة. تحديد دائرة نصف قطرها أكبر جزيرة باستخدام أداة &quot;الخط&quot; بحيث التي تلت ذلك ميزة الكرة المتداول يمكن أن يزيل بفعالية ضوء تألق ذاتي ومتناثرة. اختبار واختيار الأنسب &quot;عتبة منخفضة&quot; لالتقاط الاشارات الفلورسنت من الجزر الصغيرة ومجموعات من خلايا بيتا (&lt;3x10 4 ميكرون 2). اختبار واختيار الأنسب &quot;العتبة العليا&quot; لالتقاط الاشارات الفلورسنت من الجزر. تشغيل الكمي لشريحة الظاهري ، والتي سوف قياسوتنتج لائحة منطقة الجزيرة ، المحيط ، دائرية ، وقطر في فيريه. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1970/1970Fig1A.jpg" alt="الشكل 1A" /> الشكل الظاهري شريحة 1A تحليل الصور لتوزيع كامل من خلايا بيتا في البنكرياس الكبار على حالها صور لوحات ضوئية فردية لأحد الذكور في البنكرياس الماوس WK - 10 التي اتخذت في إطار هدف 2X. الصور تتضمن توزيع كامل من الجزر ، حتى كتل صغيرة من الخلايا بيتا (&lt;10 خلايا). <img src="/files/ftp_upload/1970/1970Fig1B.jpg" alt="الرقم 1B" /> صورة شخصية 1B شريحة الظاهري تحليل التوزيع الكلي للخلايا بيتا في البنكرياس الكبار على حالها شريحة موحدة الظاهري مع البنكرياس الظهرية على اليمين والبنكرياس بطني على اليسار. شريط المقياس هو 5 ملم. ممثل النتائج ويتقن لإعداد البنكرياس للتصوير شريحة الظاهري السماح لالكمي الفعال لجميع GFP الموسومة خلايا بيتا في البنكرياس بأكملها كصورة شريحة الظاهري مع الجزر واضحة ومميزة. نجاح التصوير شريحة الظاهري البنكرياس كله في الموقع يوفر وسيلة لفحص وقياس خلايا بيتا ، وليس فقط منطقة الجزيرة الفردية والإجمالية ، ولكن أيضا جزيرة حجم التوزيع ، وتحليل الإقليمية ، وأنماط النمو كذلك. بينما ImageJ يحافظ على القدرة على كشف جميع خلايا بيتا في نفس الوقت في تحليل الصور شريحة الظاهرية ، فإنه يمكن أيضا التحكم فيها بيتا لتحديد الخلايا عن طريق تقييد التحليل على جزيرة أحجام معينة (حسب المنطقة أو القطر) ، أو عن طريق الموقع. تحليل المعيار يستبعد التحف على سبيل المثال ، أصغر من الحطام واحد خلايا بيتا (&lt;170 ميكرون 2) والسجلات المنطقة المحيطة (المسافة المحيطة للمنطقة) ، دائرية (درجة من الاستدارة ، حيث يمثل 1.0 دائرة الكمال) ، واكتشفت في القطر فيريه (أطول مسافة داخل منطقة) لكل جزيرة. التحليل الظاهري شريحة قادرة على تعزيز الصور عن طريق استخدام شريحة الظاهري تجزئة مستجمعات المياه ، والذي يميز ويفصل الجزر تداخل في الجزر الفردية وفقا لأشكالها. تحليل تنتج المزيد من سلسلة من الصور التفصيلية ، وهذا يشمل أقنعة من الصور في إطار كل من كثافة منخفضة وعالية (الشكل 1C) ، مخططا لجميع الجزر المفترضة ، والتي هي كل مرقمة بشكل فردي والمدرجة في جدول معلومات المقابلة (الشكل . 1D) ، والصورة الأصلية شريحة الظاهري (الشكل 1B). علما بأن التحيز المحتمل التقنية عند اختيار القيم الحدية يمكن أن تحرف القياس الكمي من الجزر التي لا مبرر له بما في ذلك الضوء المحيطة هياكل كبيرة ، أو عن طريق الحد من عدد من الجزر ، وإشارات خافتة خصوصا من جسيمات صغيرة. <img src="/files/ftp_upload/1970/1970Fig1C.jpg" alt="الرقم 1C" /> الشكل الظاهري شريحة 1C تحليل الصور لتوزيع كامل من خلايا بيتا في البنكرياس الكبار على حالها قناع من الجسيمات الفلورية في شريحة الظاهري. رموز اللون : [1] الزرقاء : انخفاض كثافة مضان ؛ [2] الخضراء : كثافة متوسطة مضان ، و[3] الحمراء : مضان عالية الكثافة. <img src="/files/ftp_upload/1970/1970Fig1D.jpg" alt="الرقم 1D" /> صورة شخصية 1D شريحة الظاهري تحليل التوزيع الكلي للخلايا بيتا في البنكرياس الكبار على حالها الكمي من الجزر الفردية / مجموعات من خلايا بيتا. لاحظ أن يتم ترقيم كل جزيرة (بما في ذلك مجموعات صغيرة من خلايا بيتا) ، مع معلومات تفصيلية لها في مخطط المقابلة. تم القبض على اربعة المعلمات لكل هيكل : (1) المجال ؛ (2) محيط ؛ (3) دائرية : درجة من الاستدارة حيث العدد 1،0 يمثل دائرة كاملة ، و (4) فيريه والإطارات : أطول مسافة داخل المنطقة. علما بأن # 706 يعرض القرار تحليلات بمساحة فقط خلايا بيتا قليلة. تجزئة مستجمعات المياه بالكشف عن مجموعة من الجزر الصغيرة المجاورة لها ، مثل واحد هو مبين ، ويميز بشكل مناسب لهم كما الجزر مميزة (الجزر 1554 ، 1555 ، و 1556). <img src="/files/ftp_upload/1970/1970Fig1E.jpg" alt="الرقم 1E" /> الشكل الظاهري شريحة 1E تحليل الصور لتوزيع كامل من خلايا بيتا في البنكرياس الكبار على حالها 3 الأبعاد مؤامرة لتحليل شريحة الظاهري ، مع محاور المنطقة المحيطة ، وقطر في فيريه. كل نقطة تمثل الجزيرة.

<ol>
	<li>Miller, K., Kim, A., Kilimnik, G., Moka, U., Jo, J., Periwal, V., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+formation+during+the+neonatal+development+in+mice.">Islet formation during the neonatal development in mice.</a> PloS One. 4, E7739-E7739 (2009).</li><li>Kilimnik, G., Kim, A., Jo, J., Miller, K., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+pancreatic+islet+distribution+in+situ+in+mice.">Quantification of pancreatic islet distribution in situ in mice.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 297, E1331-E1338 (2009).</li><li>Hara, M., Wang, X., Kawamura, T., Bindokas, V. P., Dizon, R. F., Alcoser, S. Y., Magnuson, M. A., Bell, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+with+green+fluorescent+protein-labeled+pancreatic+beta+-cells.">Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 284, E177-E183 (2003).</li><li>Hara, M., Dizon, R. F., Glick, B. S., Lee, C. S., Kaestner, K. H., Piston, D. W., Bindokas, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+pancreatic+beta-cells+in+the+intact+pancreas.">Imaging pancreatic beta-cells in the intact pancreas.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 290, E1041-E1047 (2006).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

تحليل الصور الظاهري شريحة من الجزر ومجموعات خلايا بيتا في البنكرياس سليمة يقدم وجهة نظر واسعة النطاق لتوزيع كامل من الجزر. وبالتالي يمكن أن التطورات والتغيرات في توزيع مجموع جزيرة بمرور الوقت يمكن دراستها ومقارنتها. ويتجلى هذا مثلا في تحليلنا لتشكيل جزيرة البنكريا?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltex</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>F.S.T</td>
<td>14001-13</td>
<td>01n2</td>
</tr>
<tr>
<td>Scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>F.S.T</td>
<td>14072-10</td>
<td>02s5	</td>
</tr>
<tr>
<td>Large glass slide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>71862-01</td>
<td>75x51x1.2mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Large cover glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ted Pella, Inc</td>
<td>260462</td>
<td>50x75mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass Slide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-550-15</td>
<td>25x75x1.0mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Cover glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-458-5M</td>
<td>75x25mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Cover glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Erie Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>25mm circle</td>
</tr>
<tr>
<td>Fluorescent microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus IX-81</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissection microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus SZX12</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stereo Investigator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MicroBrightField</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MIP-GFP mice</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson Laboratory</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

in situ quantification of pancreatic beta-cell mass in mice

تتبع التغيرات في خلية معينة من السكان في الصحة والمرض هو هدف مهم للبحوث الطبية الحيوية. عملية رصد انتشار خلايا بيتا في البنكرياس ، ونمو الجزيرة هو تحديا من نوع خاص. طورنا طريقة لالتقاط توزيع خلايا بيتا في البنكرياس سليمة من الفئران المعدلة وراثيا مع مضان الموسومة خلايا بيتا مع ماكرو مكتوبة لImageJ (rsb.info.nih.gov / ط /). بعد تشريح البنكرياس وتطهير الأنسجة ، ويتم التقاط البنكرياس بأسره شريحة افتراضية ، وبعد ذلك يتم فحص GFP الموسومة خلايا بيتا. ويشمل التحليل الكمي لمجموع عدد خلايا بيتا منطقة الجزيرة ، وتوزيع حجم مع الإشارة إلى معلمات وأماكن محددة لكل جزيرة ومجموعات صغيرة من خلايا بيتا. يمكن رسم توزيع كامل من الجزر في ثلاثة أبعاد ، والمعلومات عن توزيع على حجم وشكل كل جزيرة يسمح مقارنة كمية ونوعية التغيرات في مجال خلايا بيتا الشاملة في لمحة.

Watch this Scientific Journal Video about In situ Quantification of Pancreatic Beta-cell Mass in Mice at JoVE.com

In situ Quantification of Pancreatic Beta-cell Mass in Mice

بروتوكول يلي الخطوط العريضة لعملية تشريح البنكرياس للتصوير شريحة الظاهري ، والقياس الكمي لاحقة من جميع GFP الموسومة خلايا بيتا في البنكرياس بأكمله.

في الوضع الطبيعي للقداس الكمي بيتا في البنكرياس خلايا الفئران

Tracing changes of specific cell populations in health and disease is an important goal of biomedical research. The process of monitoring pancreatic ...

in-situ-quantification-of-pancreatic-beta-cell-mass-in-mice

Research

JoVE Journal

Biology

In situ Quantification of Pancreatic Beta-cell Mass in Mice

12.1K Views.  University of Chicago. بروتوكول يلي الخطوط العريضة لعملية تشريح البنكرياس للتصوير شريحة الظاهري ، والقياس الكمي لاحقة من جميع GFP الموسومة خلايا بيتا في البنكرياس بأكمله.

Video: In situ Quantification of Pancreatic Beta-cell Mass in Mice

Transplantation of Pancreatic Islets Into the Kidney Capsule of Diabetic Mice

Our protocol was developed to cleanly and easily deliver islets or cells under the kidney capsule of diabetic or normal mice. We found that it was easier to concentrate the islets or cells into pellets in the final delivery tubing (PE50) used to transplant the cells under the kidney capsule. This technique provides both speed and ease while reducing any undue stress to the cells or to the mouse.

Loading: Settled, hand picked, islets or pelleted cells are carefully aspirated off the bottom of a 1.5 mL microcentrifuge tube using a p200 pipetteman and a straight, thin-wall pipette tip. A length of PE50 tubing is attached to the pipette tip using a small silicone adapter tubing. Cells are allowed to settle, in the tip, and then are transferred to the PE50 tubing by slowly dialing the pipetteman. Once the cells are near the end of the PE50 tubing, a kink is made and the silicone adaptor tubing is placed over the kink. The PE50 tubing is transferred to a 15 mL conical containing a cut 5 mL pipet, and the PE50 tubing is taped over the side of the 5 mL pipet to prevent curling during centrifuging. Cells are allowed to reach 1,000 rpm and stopped.
Transplantation: Recipient mice are anesthetized, shaved, and cleaned. A small incision is made on the left flank of the mouse and the kidney is exposed. The kidney, fat, and tissue are kept moist with normal saline swab. The distal end of the PE50 is attached to a Hamilton screw drive syringe, containing a pipette tip, using the silicone adaptor tubing. A small nick is made on the right flank side of the kidney, not too large nor too deep. The beveled end of the PE50 tubing, nearest the cells, is carefully placed under the capsule, the tubing is moved around gently to make space while swabbing normal saline; a dry capsule can tear easily. A small air bubble is delivered under the capsule by slowly dialing the syringe screw drive. Islets are then slowly delivered behind the air bubble. Once the islets have been delivered kidney homeostasis is maintained and the knick is cauterized with low heat. The kidney is placed back into the cavity and the peritoneum and skin are sutured and stapled. Mice are immediately treated with Flunixin and Buprenorphine s.q. and placed in a cage on a heating pad.

Our protocol was developed to cleanly and easily deliver islets or cells under the kidney capsule of mice. Cells are concentrated into pellets in the final tubing used for transplanting the cells under the kidney capsule. The ease of this technique reduces stress to the cells and the mouse.

زرع البنكرياس من الجزر في الكبسولة الكلى من الفئران من السكري

Our protocol was developed to cleanly and easily deliver islets or cells under the kidney capsule of diabetic or normal mice.  We found that it was easier ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &amp;#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

الكمي بؤر γH2AX في الاستجابة للإشعاع المؤين

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Computer-assisted Large-scale Visualization and Quantification of Pancreatic Islet Mass, Size Distribution and Architecture

The pancreatic islet is a unique micro-organ composed of several hormone secreting endocrine cells such as beta-cells (insulin), alpha-cells (glucagon), and delta-cells (somatostatin) that are embedded in the exocrine tissues and comprise 1-2% of the entire pancreas. There is a close correlation between body and pancreas weight. Total beta-cell mass also increases proportionately to compensate for the demand for insulin in the body. What escapes this proportionate expansion is the size distribution of islets. Large animals such as humans share similar islet size distributions with mice, suggesting that this micro-organ has a certain size limit to be functional. The inability of large animal pancreata to generate proportionately larger islets is compensated for by an increase in the number of islets and by an increase in the proportion of larger islets in their overall islet size distribution. Furthermore, islets exhibit a striking plasticity in cellular composition and architecture among different species and also within the same species under various pathophysiological conditions. In the present study, we describe novel approaches for the analysis of biological image data in order to facilitate the automation of analytic processes, which allow for the analysis of large and heterogeneous data collections in the study of such dynamic biological processes and complex structures. Such studies have been hampered due to technical difficulties of unbiased sampling and generating large-scale data sets to precisely capture the complexity of biological processes of islet biology. Here we show methods to collect unbiased "representative" data within the limited availability of samples (or to minimize the sample collection) and the standard experimental settings, and to precisely analyze the complex three-dimensional structure of the islet. Computer-assisted automation allows for the collection and analysis of large-scale data sets and also assures unbiased interpretation of the data. Furthermore, the precise quantification of islet size distribution and spatial coordinates (i.e. X, Y, Z-positions) not only leads to an accurate visualization of pancreatic islet structure and composition, but also allows us to identify patterns during development and adaptation to altering conditions through mathematical modeling. The methods developed in this study are applicable to studies of many other systems and organisms as well.

Novel computer-assisted methods of large-scale procurement and analysis of immunohistochemically stained pancreatic specimens are described: (1) Virtual Slice capture of the entire section; (2) Mass analysis of large-scale data; (3) Reconstruction of 2D Virtual Slices; (4) 3D islet mapping; and (5) Mathematical analysis.

بمساعدة الحاسوب على نطاق واسع التصور النوعي والكمي لقداس جزيرة البنكرياس والتوزيع الحجم والعمارة

The pancreatic islet is a unique micro-organ composed of several hormone secreting endocrine cells such as beta-cells (insulin), alpha-cells (glucagon), ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

الكمي من البروتينات عن طريق التخصيب الببتيد Immunoaffinity اقترن الطيف الكتلي

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Body movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are sheathed by intramuscular connective tissues. Each myofiber contains many myofibrils that run longitudinally along the length of the myofiber. Myofibrils are the contractile apparatus of muscle and they are composed of repeated contractile units known as sarcomeres. A sarcomere unit contains actin and myosin filaments that are spaced by the Z discs and titin protein. Mechanical function of skeletal muscle is defined by the contractile and passive properties of muscle. The contractile properties are used to characterize the amount of force generated during muscle contraction, time of force generation and time of muscle relaxation. Any factor that affects muscle contraction (such as interaction between actin and myosin filaments, homeostasis of calcium, ATP/ADP ratio, etc.) influences the contractile properties. The passive properties refer to the elastic and viscous properties (stiffness and viscosity) of the muscle in the absence of contraction. These properties are determined by the extracellular and the intracellular structural components (such as titin) and connective tissues (mainly collagen) 1-2. The contractile and passive properties are two inseparable aspects of muscle function. For example, elbow flexion is accomplished by contraction of muscles in the anterior compartment of the upper arm and passive stretch of muscles in the posterior compartment of the upper arm. To truly understand muscle function, both contractile and passive properties should be studied.
The contractile and/or passive mechanical properties of muscle are often compromised in muscle diseases. A good example is Duchenne muscular dystrophy (DMD), a severe muscle wasting disease caused by dystrophin deficiency 3. Dystrophin is a cytoskeletal protein that stabilizes the muscle cell membrane (sarcolemma) during muscle contraction 4. In the absence of dystrophin, the sarcolemma is damaged by the shearing force generated during force transmission. This membrane tearing initiates a chain reaction which leads to muscle cell death and loss of contractile machinery. As a consequence, muscle force is reduced and dead myofibers are replaced by fibrotic tissues 5. This later change increases muscle stiffness 6. Accurate measurement of these changes provides important guide to evaluate disease progression and to determine therapeutic efficacy of novel gene/cell/pharmacological interventions. Here, we present two methods to evaluate both contractile and passive mechanical properties of the extensor digitorum longus (EDL) muscle and the contractile properties of the tibialis anterior (TA) muscle.

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Changes in limb muscle contractile and passive mechanical properties are important biomarkers for muscle diseases. This manuscript describes physiological assays to measure these properties in the murine extensor digitorum longus and tibialis anterior muscles.

تقييم وظيفة عضلة من العضلات الباسطة لأصابع الطويلة<em&gt; خارج الجسم</em&gt; العضلات الظنبوبي الأمامي و<em&gt; في الموقع</em&gt; في الفئران

Body  movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal  muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

التصور والتحليل من جزيئات الرنا المرسال عن طريق الإسفار<em&gt; في الموضع</em&gt; التهجين في<em&gt; خميرة الخباز</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of Gi2 (a heterotrimeric G-protein &#945;-subunit) is described in detail.

This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.

رد الفعل المحدد رصد الطيف الكتلي لالمطلق البروتين الكمي

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

قرار الكمي عال من بلوري السليلوز تراكم في<em&gt; نبات الأرابيدوبسيس</em&gt; جذور لرصد الأنسجة محددة جدار الخلية تعديلات

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase or an alternative pathway, known as alternative lengthening of telomeres (ALT)1. Recently, C. elegans has emerged as a multicellular model organism for the study of telomere and ALT2. Visualization of repetitive sequences in the genome is critical in understanding the biology of telomeres. While telomere length can be measured by telomere restriction fragment assay or quantitative PCR, these methods only provide the averaged telomere length. On the contrary, fluorescence in situ hybridization (FISH) can provide the information of the individual telomeres in cells. Here, we provide protocols and representative results of the method to determine telomere length of C. elegans by fluorescent in situ hybridization. This method provides a simple, but powerful, in situ procedure that does not cause noticeable damage to morphology. By using fluorescently labeled peptide nucleic acid (PNA) and digoxigenin-dUTP-labeled probe, we were able to visualize two different repetitive sequences: telomere repeats and template of ALT (TALT) in C. elegans embryos and gonads.

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

We report a concise procedure of fluorescence in situ hybridization (FISH) in the gonad and embryos of Caenorhabditis elegans for observing and quantifying repetitive sequences. We successfully observed and quantified two different repetitive sequences, telomere repeats and template of alternative lengthening of telomeres (TALT).

المراقبة والكمي لالتيلومير وتسلسل المتكررة عن طريق الإسفار<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين (FISH) مع السلطة الوطنية الفلسطينية تحقيقات في<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.