Die Studie wird unterstützt von US Public Health Service Grant DK-081527, DK-072473 und DK-20595 an die University of Chicago Diabetes Research and Training Center (Animal Models Core), und ein Geschenk der Kovler Family Foundation.

Teil 1: Vorbereitung der Proben <ol><li> Legen Sie eine Maus unter einem Dissektionsmikroskop, entfernen Sie die gesamte Bauchspeicheldrüse zusammen mit dem Zwölffingerdarm und der Milz noch angebracht ist, und legen die Organe auf einem vorher gewogenen Glas gleiten. Entfernen Sie den Zwölffingerdarm, indem es seine Bindegewebe an der Seite, wo es um die Bauchspeicheldrüse gebunden ist. Ausschneiden und Entfernen der Milz und überschüssiges Fett an der Bauchspeicheldrüse, bis die Bauchspeicheldrüse ist komplett auf der Folie isoliert. (Pankreas-Fett zeichnet sich durch seine weiße Farbe, wie aus den etwas dunkleren und Gerber Farbe Pankreasgewebe unterschieden.) </li><li> Legen Sie ein Deckglas (großen Deckglas 50x75mm; Standard-Deckglas 25x75mm) über die Bauchspeicheldrüse so, dass sie vollständig bedeckt ist. Verwenden Sie ein Gewicht (zB ein schweres Buch), um die Bauchspeicheldrüse zwischen dem Schieber und seine Abdeckung zu glätten. Je nach Gewicht, Abflachung der Bauchspeicheldrüse dauert ca. 5 Minuten. </li><li> Nehmen Sie das Gewicht. Wenn die Bauchspeicheldrüse ist gut abgeflacht gegen die Folie, legen Sie sie in 4% Paraformaldehyd (PFA) bei 4 ° C über Nacht. Am Morgen, entfernen Sie die Deckgläser und gut Setzen Sie die gesamte Bauchspeicheldrüse zu PFA während des Tages (6-8 Stunden). Wenn die Bauchspeicheldrüse nicht mehr gut fest, damit sie in die PFA länger bleiben, eventuell über Nacht. Die Objektträger in den Behälter mit 1% Triton x-100 in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) über Nacht. Am nächsten Tag, übertragen Sie die Folien in den Container von gesättigten Saccharose für 1-2 Tage. Übertragen Sie anschließend die Dias in einem Behälter mit 100% Glycerin, bis das Gewebe gelöscht wird, die für die optimale Auflösung der Fluoreszenz-Signale ermöglicht; Gewebe Clearing dauert ca. 1-3 Tage. (Die Fluoreszenz-Signale können über Wochen und sogar Monate andauern, aber Bildgebung sollte bald durchgeführt werden, nachdem das Gewebe für eine optimale Auflösung deaktiviert ist.) </li><li> Shop der Bauchspeicheldrüse in einem dunklen und kühlen Raum, um das Organ und seine Fluoreszenz-Signale zu erhalten. </li></ol> Teil 2: Imaging und Quantifizierung der Beta-Zell-Bereich in der intakten Pankreas <ol><li> Mit einer Pinzette oder Handschuhen, nehmen Sie die Folie aus dem Behälter mit 100% Glycerin. Bereiten Sie den Schieber für die Bildgebung durch Wischen Sie überschüssiges Glycerin und ausschließlich der Reinigung der Rückseite des Deckglases mit Ethanol. </li><li> Öffnen Sie die StereoInvestigator Software (MicroBrightField, Williston, VT) und wählen Sie die 2x Objektiv für die Bildgebung Mäusen Pankreata älter als 3 Wochen auf großen Glasplatten oder 10x Objektiv für die Bildgebung Mäusen Pankreata jünger als 3 Wochen zwischen zwei 25mm Deckgläschen gedrückt. Visualisieren Sie das Bild, indem es auf Bild zu leben (Bild → Live-Bild). Wählen Sie eine Belichtungszeit, die eindeutig zeigt die GFP-markierten beta-Zellen. (Unterbelichtung des Bildes schließt kleinere Inselchen und beta-Zellen, während eine Überbelichtung des Bildes schafft zusätzlichen falsche Signale.) </li><li> Klicken Sie irgendwo auf dem Bildschirm, um einen Bezugspunkt zu etablieren, und fahren Sie eine Kontur um die gesamte Bauchspeicheldrüse zu ziehen. Starten Sie die virtuelle Scheibe-Prozess (Bild → Acquire Virtuelle Slice). Bestimmen Sie, und wählen Sie die besten Brennebene dh, das Flugzeug mit der höchsten Anzahl der sichtbaren und konzentrierte Inselchen und beta-Zellen auf der Z-Achse durch Scrollen der Fokus-Regler. Einmal gewählt, StereoInvestigator erfasst automatisch das Bild auf dem Bildschirm angezeigt. Mit dem motorisierten Bühne, die Virtual Slice-Funktion sequentiell erfasst jede optische Platte als ein deutliches Bild innerhalb der gezeichneten Kontur (Abb. 1A) und dann verbindet sie alle als eine zusammengefügte Bild (Abb. 1B). Virtuelle Scheiben Bildgebung verwendet eine epifluoreszenten Konfiguration dh Weitfeld-Filter, dass die Kamera auf alle vorhandenen Signale in einer bestimmten Tiefe, darunter diejenigen, die nicht perfekt fokussiert, erfasst werden können, so dass die endgültige virtuelle Scheiben ein integriertes zweidimensionales Bild, das nicht ein Maximum Projektion von der dreidimensionalen Rekonstruktion der gesamten Bauchspeicheldrüse. Durchschnittliche Virtuelle Scheiben Scanzeit beträgt 30 min pro Probe, sondern kann bis zu einer Stunde für eine große Bauchspeicheldrüse. </li><li> Nach dem Speichern des Bildes beginnt seine Analyse durch die Öffnung des Bildes mit ImageJ. Wenn das Bild vollständig geladen ist und auf dem Bildschirm erscheint, öffnen und starten Sie die virtuelle Scheibe Analyse Makro ( <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/1970/Supplementary_material 1.pdf">Ergänzende Material 1</a> ). </li><li> Befolgen Sie die Schritt-für-Schritt-Anleitung durch das Makro zur Verfügung gestellt. Beseitigen Sie unerwünschte Artefakte, die durch Lichtstreuung mit dem &quot;Magic Wand&quot; und &quot;Select Area&quot;-Tools erstellt wurden. Überprüfen Sie und ziehen Sie unnötige Hintergrundgeräusche aus dem Bild. Bestimmen Sie den Radius der größten Insel mit dem &quot;Line&quot;-Werkzeug, so dass die anschließende Rolling Ball Feature effektiv entfernen können Autofluoreszenz und Streulicht. Testen Sie, und wählen Sie die am besten geeignete &quot;Low Threshold&quot;, um die Fluoreszenz-Signale von kleinen Inseln und Clustern von Beta-Zellen zu erfassen (&lt;3x10 4 um 2). Testen Sie, und wählen Sie die am besten geeignete &quot;High Threshold&quot;, um die Fluoreszenz-Signale von Inselchen zu erfassen. Führen Sie die Quantifizierung der virtuellen Scheibe, die messenund erzeugen eine Liste der Insel Fläche, Umfang, Rundheit und Feret der Durchmesser. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1970/1970Fig1A.jpg" alt="Abbildung 1a" /> Abbildung 1A Virtuelle Scheiben Bildanalyse die gesamte Verteilung der Beta-Zellen in einer intakten erwachsenen Bauchspeicheldrüse Bilder von einzelnen optischen Platten eines männlichen Maus Bauchspeicheldrüse bei 10-wk unter einem 2x Ziels ergreifen. Die Bilder umfassen die gesamte Verteilung der Inseln, auch kleine Gruppen von Beta-Zellen (&lt;10 Zellen). <img src="/files/ftp_upload/1970/1970Fig1B.jpg" alt="Abbildung 1b" /> Abbildung 1B Virtuelle Scheiben Bildanalyse die gesamte Verteilung der Beta-Zellen in einer intakten erwachsenen Bauchspeicheldrüse Eine einheitliche virtuelle Scheibe mit dem dorsalen Pankreas auf der rechten und der ventralen Pankreas auf der linken Seite. Skala bar beträgt 5 mm. Repräsentative Ergebnisse Kompetente Vorbereitung einer Bauchspeicheldrüse für virtuelle Scheiben Bildgebung für eine effektive Quantifizierung aller damit GFP-markierten Beta-Zellen in einer ganzen Bauchspeicheldrüse als virtuelle Scheibe Bild mit klaren und deutlichen Inselchen. Erfolgreiche virtuelle Scheiben Bildgebung des gesamten Pankreas in situ bietet die Möglichkeit zu untersuchen und zu quantifizieren, die beta-Zellen, nicht nur Einzel-und Gesamtkosten Inselchen Bereich, aber auch kleine Insel Größenverteilung, regionale Analyse und Wachstumsmuster auch. Während ImageJ unterhält die Fähigkeit, alle Beta-Zellen gleichzeitig zu erfassen in der Analyse der virtuellen Scheibe Bilder, kann sie auch steuern, welche Beta-Zellen durch die Beschränkung der Analyse auf bestimmte Insel Größen (Flächen-oder Durchmesser), oder nach Standort zu quantifizieren. Eine Standard-Analyse schließt Artefakte wie zB Ablagerungen kleiner als eine einzige Beta-Zelle (&lt;170 um 2) und zeichnet die Fläche, Umfang (der Abstand umgibt eine Fläche), Zirkularität (ein gewisses Maß an Rundheit, wo 1,0 stellt einen perfekten Kreis), und Feret der Durchmesser (die längste Strecke in einem Raum) für jede Insel entdeckt. Virtuelle Scheiben-Analyse ist in der Lage eine optimierte virtuelle Schnittbilder durch den Einsatz von Watershed Segmentierung, welche und unterscheidet trennt überlappende Inseln in einzelne Inseln nach ihrer Form. Die Analyse weiterer produziert eine Reihe von detaillierten Bildern, dazu gehört auch die Masken der Bilder, die unter niedrigen und hohen Intensität (Abb. 1C), eine Übersicht über alle vermuteten Inseln, die jeweils einzeln nummeriert und aufgelistet in einer Tabelle mit entsprechenden Informationen (Abb. sind . 1D), und die ursprüngliche virtuelle Scheiben Bild (Abb. 1B). Beachten Sie, dass mögliche technische Bias bei der Auswahl Schwellwerte können skew die Quantifizierung der Inseln, indem überflüssige Licht um große Strukturen, oder durch eine Verringerung der Gesamtzahl der Inseln, besonders schwache Signale aus kleinen Partikeln. <img src="/files/ftp_upload/1970/1970Fig1C.jpg" alt="Abbildung 1c" /> Abbildung 1C Virtuelle Scheiben Bildanalyse die gesamte Verteilung der Beta-Zellen in einer intakten erwachsenen Bauchspeicheldrüse Eine Maske der fluoreszierenden Partikel in der virtuellen Scheibe. Farbcodes: [1] blau: niedrige Intensität Fluoreszenz; [2] grün: mittlerer Intensität Fluoreszenz; und [3] rot: hohe Intensität Fluoreszenz. <img src="/files/ftp_upload/1970/1970Fig1D.jpg" alt="Figur 1d" /> 1D virtuellen Scheiben Bildanalyse die gesamte Verteilung der Beta-Zellen in einer intakten erwachsenen Bauchspeicheldrüse Die Quantifizierung der einzelnen Inseln / Cluster von Beta-Zellen. Beachten Sie, dass jede Insel (einschließlich kleiner Cluster von beta-Zellen) gezählt wird, mit seinen Informationen in ein entsprechendes Diagramm detailliert. Vier Parameter wurden für jede Struktur getroffen: (1) Bereich, (2) Umfang, (3) Zirkularität: ein gewisses Maß an Rundheit, wo die Zahl 1,0 stellt einen perfekten Kreis, und (4) Feret der Durchmesser: die längste Strecke in einem Raum. Beachten Sie, dass # 706 Analysen auflösende Displays mit einer Fläche von nur ein paar Beta-Zellen. Watershed Segmentierung erkennt Gruppen von benachbarten Inseln, wie der gezeigte, und entsprechend unterscheidet sie als getrennte Inseln (Inseln 1554, 1555 und 1556). <img src="/files/ftp_upload/1970/1970Fig1E.jpg" alt="Abbildung 1e" /> Abbildung 1E Virtuelle Scheiben Bildanalyse die gesamte Verteilung der Beta-Zellen in einer intakten erwachsenen Bauchspeicheldrüse 3-dimensionale Darstellung der virtuellen Scheibe Analyse, mit Achsen der Fläche, Umfang, und Feret der Durchmesser. Jeder Punkt steht für eine kleine Insel.

<ol>
	<li>Miller, K., Kim, A., Kilimnik, G., Moka, U., Jo, J., Periwal, V., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+formation+during+the+neonatal+development+in+mice.">Islet formation during the neonatal development in mice.</a> PloS One. 4, E7739-E7739 (2009).</li><li>Kilimnik, G., Kim, A., Jo, J., Miller, K., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+pancreatic+islet+distribution+in+situ+in+mice.">Quantification of pancreatic islet distribution in situ in mice.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 297, E1331-E1338 (2009).</li><li>Hara, M., Wang, X., Kawamura, T., Bindokas, V. P., Dizon, R. F., Alcoser, S. Y., Magnuson, M. A., Bell, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+with+green+fluorescent+protein-labeled+pancreatic+beta+-cells.">Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 284, E177-E183 (2003).</li><li>Hara, M., Dizon, R. F., Glick, B. S., Lee, C. S., Kaestner, K. H., Piston, D. W., Bindokas, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+pancreatic+beta-cells+in+the+intact+pancreas.">Imaging pancreatic beta-cells in the intact pancreas.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 290, E1041-E1047 (2006).</li></ol>

Die Analyse der virtuellen Scheibe Bilder von Inselchen und Beta-Zell-Clustern im intakten Pankreas stellt eine große Aussicht auf die gesamte Verteilung der Inseln. Entwicklungen und Veränderungen in insgesamt Insel Verteilung im Laufe der Zeit können so untersucht und verglichen werden. Ein solches Beispiel ist in unserer Analyse der Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Bildung (1) gezeigt. Eine umfassende Analyse der neugeborenen Mäusen Bauchspeicheldrüsen zu verschiedenen Zeitpunkten (P1-P21) hat gezeigt, dass k...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltex</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>F.S.T</td>
<td>14001-13</td>
<td>01n2</td>
</tr>
<tr>
<td>Scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>F.S.T</td>
<td>14072-10</td>
<td>02s5	</td>
</tr>
<tr>
<td>Large glass slide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>71862-01</td>
<td>75x51x1.2mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Large cover glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ted Pella, Inc</td>
<td>260462</td>
<td>50x75mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass Slide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-550-15</td>
<td>25x75x1.0mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Cover glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-458-5M</td>
<td>75x25mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Cover glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Erie Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>25mm circle</td>
</tr>
<tr>
<td>Fluorescent microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus IX-81</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissection microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus SZX12</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stereo Investigator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MicroBrightField</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MIP-GFP mice</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson Laboratory</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

in situ quantification of pancreatic beta-cell mass in mice

Tracing Veränderungen spezifischer Zellpopulationen in Gesundheit und Krankheit ist ein wichtiges Ziel der biomedizinischen Forschung. Der Prozess der Überwachung pankreatischen Beta-Zell-Proliferation und Inselchen Wachstum ist eine besondere Herausforderung. Wir haben eine Methode, um die Verteilung von Beta-Zellen im intakten Pankreas transgener Mäuse mit Fluoreszenz-markierten beta-Zellen mit einem Makro für ImageJ (rsb.info.nih.gov / ij /) geschrieben Bildaufzeichnung entwickelt. Nach Pankreas-Dissektion und Gewebe Lichtung, wird die gesamte Bauchspeicheldrüse als virtuelle Scheibe gefangen genommen, nach denen die GFP-markierten beta-Zellen untersucht werden. Die Analyse beinhaltet die Quantifizierung von insgesamt Beta-Zell-Bereich, Inselchen Anzahl und Größenverteilung in Bezug auf bestimmte Parameter und Standorte für jede Insel und für kleine Gruppen von beta-Zellen. Die gesamte Verteilung der Inseln kann in drei Dimensionen dargestellt werden, und die Informationen aus der Verteilung auf die Größe und Form der einzelnen Insel ermöglicht eine quantitative und qualitative Vergleich der Veränderungen in insgesamt Beta-Zell-Bereich auf einen Blick.

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In situ Quantification of Pancreatic Beta-cell Mass in Mice

Das folgende Protokoll beschreibt den Prozess des Pankreas dissection für virtuelle Scheibe Bildgebung, und die anschließende Quantifizierung aller GFP-markierten Beta-Zellen in der gesamten Bauchspeicheldrüse.

In situ Quantifizierung von Pankreas-Beta-Zellmasse in Mäuse

Tracing changes of specific cell populations in health and disease is an important goal of biomedical research. The process of monitoring pancreatic ...

in-situ-quantification-of-pancreatic-beta-cell-mass-in-mice

Research

JoVE Journal

Biology

In situ Quantification of Pancreatic Beta-cell Mass in Mice

12.1K Aufrufe.  University of Chicago. Das folgende Protokoll beschreibt den Prozess des Pankreas dissection für virtuelle Scheibe Bildgebung, und die anschließende Quantifizierung aller GFP-markierten Beta-Zellen in der gesamten Bauchspeicheldrüse.

Serie: In situ Quantification of Pancreatic Beta-cell Mass in Mice

Transplantation of Pancreatic Islets Into the Kidney Capsule of Diabetic Mice

Our protocol was developed to cleanly and easily deliver islets or cells under the kidney capsule of diabetic or normal mice. We found that it was easier to concentrate the islets or cells into pellets in the final delivery tubing (PE50) used to transplant the cells under the kidney capsule. This technique provides both speed and ease while reducing any undue stress to the cells or to the mouse.

Loading: Settled, hand picked, islets or pelleted cells are carefully aspirated off the bottom of a 1.5 mL microcentrifuge tube using a p200 pipetteman and a straight, thin-wall pipette tip. A length of PE50 tubing is attached to the pipette tip using a small silicone adapter tubing. Cells are allowed to settle, in the tip, and then are transferred to the PE50 tubing by slowly dialing the pipetteman. Once the cells are near the end of the PE50 tubing, a kink is made and the silicone adaptor tubing is placed over the kink. The PE50 tubing is transferred to a 15 mL conical containing a cut 5 mL pipet, and the PE50 tubing is taped over the side of the 5 mL pipet to prevent curling during centrifuging. Cells are allowed to reach 1,000 rpm and stopped.
Transplantation: Recipient mice are anesthetized, shaved, and cleaned. A small incision is made on the left flank of the mouse and the kidney is exposed. The kidney, fat, and tissue are kept moist with normal saline swab. The distal end of the PE50 is attached to a Hamilton screw drive syringe, containing a pipette tip, using the silicone adaptor tubing. A small nick is made on the right flank side of the kidney, not too large nor too deep. The beveled end of the PE50 tubing, nearest the cells, is carefully placed under the capsule, the tubing is moved around gently to make space while swabbing normal saline; a dry capsule can tear easily. A small air bubble is delivered under the capsule by slowly dialing the syringe screw drive. Islets are then slowly delivered behind the air bubble. Once the islets have been delivered kidney homeostasis is maintained and the knick is cauterized with low heat. The kidney is placed back into the cavity and the peritoneum and skin are sutured and stapled. Mice are immediately treated with Flunixin and Buprenorphine s.q. and placed in a cage on a heating pad.

Our protocol was developed to cleanly and easily deliver islets or cells under the kidney capsule of mice. Cells are concentrated into pellets in the final tubing used for transplanting the cells under the kidney capsule. The ease of this technique reduces stress to the cells and the mouse.

Transplantation von Pankreas-Inseln in die Niere Capsule von diabetischen Mäusen

Our protocol was developed to cleanly and easily deliver islets or cells under the kidney capsule of diabetic or normal mice.  We found that it was easier ...

Forschung

Biologie

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &amp;#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

Die Quantifizierung der γH2AX Foci in Response to ionisierender Strahlung

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Computer-assisted Large-scale Visualization and Quantification of Pancreatic Islet Mass, Size Distribution and Architecture

The pancreatic islet is a unique micro-organ composed of several hormone secreting endocrine cells such as beta-cells (insulin), alpha-cells (glucagon), and delta-cells (somatostatin) that are embedded in the exocrine tissues and comprise 1-2% of the entire pancreas. There is a close correlation between body and pancreas weight. Total beta-cell mass also increases proportionately to compensate for the demand for insulin in the body. What escapes this proportionate expansion is the size distribution of islets. Large animals such as humans share similar islet size distributions with mice, suggesting that this micro-organ has a certain size limit to be functional. The inability of large animal pancreata to generate proportionately larger islets is compensated for by an increase in the number of islets and by an increase in the proportion of larger islets in their overall islet size distribution. Furthermore, islets exhibit a striking plasticity in cellular composition and architecture among different species and also within the same species under various pathophysiological conditions. In the present study, we describe novel approaches for the analysis of biological image data in order to facilitate the automation of analytic processes, which allow for the analysis of large and heterogeneous data collections in the study of such dynamic biological processes and complex structures. Such studies have been hampered due to technical difficulties of unbiased sampling and generating large-scale data sets to precisely capture the complexity of biological processes of islet biology. Here we show methods to collect unbiased "representative" data within the limited availability of samples (or to minimize the sample collection) and the standard experimental settings, and to precisely analyze the complex three-dimensional structure of the islet. Computer-assisted automation allows for the collection and analysis of large-scale data sets and also assures unbiased interpretation of the data. Furthermore, the precise quantification of islet size distribution and spatial coordinates (i.e. X, Y, Z-positions) not only leads to an accurate visualization of pancreatic islet structure and composition, but also allows us to identify patterns during development and adaptation to altering conditions through mathematical modeling. The methods developed in this study are applicable to studies of many other systems and organisms as well.

Novel computer-assisted methods of large-scale procurement and analysis of immunohistochemically stained pancreatic specimens are described: (1) Virtual Slice capture of the entire section; (2) Mass analysis of large-scale data; (3) Reconstruction of 2D Virtual Slices; (4) 3D islet mapping; and (5) Mathematical analysis.

Computer-assisted Großflächige Visualisierung und Quantifizierung der Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Masse, Größenverteilung und Architektur

The pancreatic islet is a unique micro-organ composed of several hormone secreting endocrine cells such as beta-cells (insulin), alpha-cells (glucagon), ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

Quantifizierung von Proteinen über ein Peptid Immunoaffinity Enrichment gekoppelt mit der Massenspektrometrie

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Body movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are sheathed by intramuscular connective tissues. Each myofiber contains many myofibrils that run longitudinally along the length of the myofiber. Myofibrils are the contractile apparatus of muscle and they are composed of repeated contractile units known as sarcomeres. A sarcomere unit contains actin and myosin filaments that are spaced by the Z discs and titin protein. Mechanical function of skeletal muscle is defined by the contractile and passive properties of muscle. The contractile properties are used to characterize the amount of force generated during muscle contraction, time of force generation and time of muscle relaxation. Any factor that affects muscle contraction (such as interaction between actin and myosin filaments, homeostasis of calcium, ATP/ADP ratio, etc.) influences the contractile properties. The passive properties refer to the elastic and viscous properties (stiffness and viscosity) of the muscle in the absence of contraction. These properties are determined by the extracellular and the intracellular structural components (such as titin) and connective tissues (mainly collagen) 1-2. The contractile and passive properties are two inseparable aspects of muscle function. For example, elbow flexion is accomplished by contraction of muscles in the anterior compartment of the upper arm and passive stretch of muscles in the posterior compartment of the upper arm. To truly understand muscle function, both contractile and passive properties should be studied.
The contractile and/or passive mechanical properties of muscle are often compromised in muscle diseases. A good example is Duchenne muscular dystrophy (DMD), a severe muscle wasting disease caused by dystrophin deficiency 3. Dystrophin is a cytoskeletal protein that stabilizes the muscle cell membrane (sarcolemma) during muscle contraction 4. In the absence of dystrophin, the sarcolemma is damaged by the shearing force generated during force transmission. This membrane tearing initiates a chain reaction which leads to muscle cell death and loss of contractile machinery. As a consequence, muscle force is reduced and dead myofibers are replaced by fibrotic tissues 5. This later change increases muscle stiffness 6. Accurate measurement of these changes provides important guide to evaluate disease progression and to determine therapeutic efficacy of novel gene/cell/pharmacological interventions. Here, we present two methods to evaluate both contractile and passive mechanical properties of the extensor digitorum longus (EDL) muscle and the contractile properties of the tibialis anterior (TA) muscle.

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Changes in limb muscle contractile and passive mechanical properties are important biomarkers for muscle diseases. This manuscript describes physiological assays to measure these properties in the murine extensor digitorum longus and tibialis anterior muscles.

Bewertung von Muscle Funktion des Extensor digitorum longus<em&gt; Ex vivo</em&gt; Und Tibialis anterior<em&gt; In situ</em&gt; In Mäuse

Body  movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal  muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualisierung und Analyse von mRNA Moleküle mittels Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of Gi2 (a heterotrimeric G-protein &#945;-subunit) is described in detail.

This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.

Selected Reaction Monitoring-Massenspektrometrie für Absolute Proteinquantifizierung

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

Hohe Auflösung Quantifizierung kristalliner Cellulose Akkumulation in<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots Gewebespezifische Zellwand Änderungen überwachen

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase or an alternative pathway, known as alternative lengthening of telomeres (ALT)1. Recently, C. elegans has emerged as a multicellular model organism for the study of telomere and ALT2. Visualization of repetitive sequences in the genome is critical in understanding the biology of telomeres. While telomere length can be measured by telomere restriction fragment assay or quantitative PCR, these methods only provide the averaged telomere length. On the contrary, fluorescence in situ hybridization (FISH) can provide the information of the individual telomeres in cells. Here, we provide protocols and representative results of the method to determine telomere length of C. elegans by fluorescent in situ hybridization. This method provides a simple, but powerful, in situ procedure that does not cause noticeable damage to morphology. By using fluorescently labeled peptide nucleic acid (PNA) and digoxigenin-dUTP-labeled probe, we were able to visualize two different repetitive sequences: telomere repeats and template of ALT (TALT) in C. elegans embryos and gonads.

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

We report a concise procedure of fluorescence in situ hybridization (FISH) in the gonad and embryos of Caenorhabditis elegans for observing and quantifying repetitive sequences. We successfully observed and quantified two different repetitive sequences, telomere repeats and template of alternative lengthening of telomeres (TALT).

Beobachtung und Quantifizierung der Telomere und repetitiver Sequenzen mittels Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Die Hybridisierung (FISH) mit PNA-Sonden in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.