המחקר נתמך על ידי ארצות הברית השירות לבריאות הציבור של גרנט DK-081527, 072473 ו DK-DK-20595 של אוניברסיטת שיקגו סוכרת מחקר מרכז הדרכה (Core מודלים בבעלי חיים), ואת מתנת קרן משפחת קובלר.

חלק 1: הכנת דוגמאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום עכבר תחת מיקרוסקופ לנתיחה, להסיר את הלבלב כולו יחד עם התריסריון והטחול עדיין מחוברת, והמקום איברים בשקופית זכוכית טרום שקל. הסר את התריסריון על ידי חיתוך הרקמה החיבורית שלה בצד שבו הוא חייב הלבלב. גזור להסיר את הטחול ואת עודף שומן על הלבלב עד הלבלב הוא מבודד לחלוטין בשקופית. (שומן הלבלב הוא להבחין לפי הצבע הלבן שלה, להבדיל מהצבע מעט כהה לשיזוף של רקמת לבלב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים coverslip (זכוכית לכסות גדול 50x75mm; תקן זכוכית לכסות 25x75mm) על הלבלב, כך שהוא מכוסה לחלוטין. השתמש במשקל (למשל ספר כבד) לשטח את הלבלב בין שקופיות ואת העטיפה. בהתאם למשקל, משטחת את הלבלב לוקח בערך חמש דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוריד את המשקל. אם הלבלב היטב שטוח מול המגלשה, למקם אותו paraformaldehyde 4% (PFA) ב 4 ° C למשך הלילה. בבוקר, להסיר את coverslips היטב לחשוף את הלבלב כולו PFA במהלך היום (6-8 שעות). אם הלבלב אינו היטב קבוע, לאפשר לו להישאר PFA יותר, ואולי גם לילה. העברת שקופיות המיכל עם 1% Triton x-100 ב פוספט בופר סליין (PBS) לילה. למחרת, העברת שקופיות מכולה של סוכרוז רווי במשך 1-2 ימים. ואז להעביר את השקופיות למיכל של גליצרול 100% עד הרקמה אינה מסומנת, אשר מאפשר לפתרון אופטימלי של אותות ניאון, ניקוי הרקמה לוקח כ 1-3 ימים. (אותות ניאון עלולה להימשך שבועות ואף חודשים, אך הדמיה יש לבצע מיד לאחר הרקמה מנוקה לפתרון האופטימלי.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את הלבלב באזור חשוך וקריר על מנת לשמר את האיבר ואת אותות ניאון שלה. </li></ol> חלק 2: הדמיה לכימות באזור תא בטא בלבלב שלם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מלקחיים או כפות ידיים בכפפות, לקחת את השקופית מתוך המיכל עם גליצרול 100%. הכן את השקופית הדמיה על ידי מנגב את עודפי גליצרול בלעדי ניקוי האחורי של מכסה זכוכית עם אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תוכנת StereoInvestigator (MicroBrightField, Williston, VT) ובחר את העדשה אובייקטיבי 2x לעכברים הדמיה pancreata מעל גיל 3 שבועות בשקופיות זכוכית גדול, או את העדשה אובייקטיבי 10x עבור עכברים הדמיה pancreata צעיר מכפי 3 שבועות לחוץ בין שני 25mm coverslips. דמיינו את התמונה על ידי קביעת זה לחיות תמונה (Image → תמונה חיה). בחר זמן חשיפה כי מראה בבירור את ה-GFP-tagged בטא תאים. (Underexposing את התמונה כולל איים קטנים בטא תאים, בעוד overexposing את התמונה יוצרת אותות שווא נוספות.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ בכל מקום על המסך כדי להקים נקודת התייחסות ולהמשיך לצייר קו מתאר סביב הלבלב כולו. ליזום את תהליך Slice וירטואלית (תמונה → רוכשת Slice וירטואלי). קבע ובחר את הטובים ביותר, כלומר משטח הפוקוס, את המטוס עם המספר הגבוה ביותר של איים גלוי ממוקד בטא תאים על ציר ה-Z על ידי גלילה את כפתור המיקוד. נבחר פעם אחת, StereoInvestigator באופן אוטומטי לוכדת את התמונה המוצגת על המסך. עם הבמה ממונע, התכונה Slice וירטואלי ברצף לוכדת כל פאנל אופטי כתמונת נפרדים בתוך קונטור סגורים (איור 1A) ולאחר מכן משלבת את כולם כמו תמונה אחת הממוזגת (איור 1B). הדמיה Slice Virtual משתמש תצורה epifluorescent כלומר, widefield מסננים אשר מאפשרת המצלמה כדי ללכוד את כל אותות נוכח עומק מסוים, כולל אלה לא לגמרי בפוקוס, כך פורסים וירטואלי הסופית היא תמונה משולבת דו מימדי שאינו מקסימלית הקרנת שחזור תלת ממדי של הלבלב כולו. סריקה ממוצע וירטואלי זמן Slice הוא 30 דקות לפי המדגם, אך יכול לקחת עד שעה עבור הלבלב גדול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שמירת התמונה, להתחיל את הניתוח שלה על ידי פתיחת התמונה עם ImageJ. כאשר התמונה מסיים טעינה מופיע על המסך, לפתוח ולהפעיל את Slice וירטואלי ניתוח מאקרו ( <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/1970/Supplementary_material 1.pdf">חומר משלים 1</a> ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקוב אחר צעד אחר צעד ההוראות שסופקו על ידי המאקרו. סלקו חפצים לא רצויים שנוצרו על ידי פיזור אור עם &quot;שרביט קסמים&quot; ו &quot;בחר שטח&quot; כלים. בדוק ולחסר רקע מיותרים מהתמונה. קבע את הרדיוס של איון הגדול עם הכלי &quot;הקו&quot;, כך תכונה שלאחר מכן כדור הרולינג יכול למעשה להסיר אור autofluorescence והתפזרו. מבחן ולבחור את המתאימים ביותר &quot;סף נמוך&quot; כדי ללכוד את אותות ניאון של איונים קטנים ואשכולות של תאים בטא (&lt;3x10 4 מיקרומטר 2). מבחן ולבחור את המתאימים ביותר &quot;סף גבוה&quot; כדי ללכוד את אותות ניאון של איים. הפעל את כימות פורסים את הוירטואלי, אשר ימדודלייצר רשימה של אזור עוטף איון, מעגליות, ואת קוטר של Feret. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1970/1970Fig1A.jpg" alt="דמות 1a" /> איור 1 א תמונה וירטואלית Slice ניתוח של חלוקת כל בטא תאים בלבלב מבוגר ללא פגע תמונות של לוחות אופטי יחיד של הלבלב עכבר זכר ב 10-wk נלקח תחת מטרה 2x. התמונות כוללות את כל הפצה של איים, אפילו אשכולות קטנים של תאים בטא (&lt;10 תאים). <img src="/files/ftp_upload/1970/1970Fig1B.jpg" alt="דמות 1b" /> איור 1B תמונה וירטואלית Slice ניתוח של חלוקת כל בטא תאים בלבלב מבוגר ללא פגע פרוסת וירטואלית מאוחד עם הלבלב הגבי מימין הלבלב הגחון בצד שמאל. בר סולם הוא 5 מ&quot;מ. נציג תוצאות הכנה מיומן של הלבלב הדמיה Slice וירטואלי תאפשר כימות יעיל של כל ה-GFP-tagged בתאי בטא בלבלב שלם כתמונת Slice וירטואלי עם איים ברורה וייחודית. פורסים מוצלח הדמיה וירטואלית של הלבלב שלם באתרו מספק את האמצעים לבחון ולכמת את בטא תאים, לא רק בתחום הפרט איון מוחלט, אלא גם גודל ההפצה איון, ניתוח אזורית, דפוסי צמיחה גם כן. בעוד ImageJ שומרת את היכולת לזהות את כל בטא תאים בו זמנית בניתוח תמונות Slice וירטואלי, הוא יכול גם לשלוט בטא תאים לכמת ידי הגבלת ניתוח בגדלים מסוימים איון (לפי אזור או קוטר), או לפי מיקום. ניתוח סטנדרטי כולל חפצים כגון פסולת קטן יותר מאשר תא אחד בודד בטא (&lt;170 מיקרומטר 2) ורשומות האזור, היקף (המרחק סביב שטח), המעגליות (מידה של עגלגלות, שבה 1.0 מייצגת עיגול מושלם), ו בקוטר של Feret (המרחק הארוך ביותר בתוך שטח) עבור איון כל זוהה. ניתוח Slice וירטואלי הוא מסוגל לשפר את התמונות פרוסה וירטואלית על ידי העסקת פילוח פרשת המים, אשר מבדיל ומפריד איים חופפים לתוך איים בודדים על פי צורתם. ניתוח נוסף מייצרת סדרה של תמונות מפורטות, זה כולל מסכות של התמונות הן תחת עוצמת נמוך וגבוה (איור 1C), קווי המתאר של כל האיונים חזקה, אשר כל מנה בנפרד בטבלה של מידע המתאים (איור . 1D), וכן את התמונה המקורית Slice וירטואליים (איור 1B). שים לב, הטיה טכני פוטנציאל בבחירת ערכי הסף יכול להטות כימות של איים על ידי כולל אור מיותר סביב מבנים גדולים, או על ידי הקטנת המספר הכולל של איים, אותות חלש במיוחד של חלקיקים קטנים. <img src="/files/ftp_upload/1970/1970Fig1C.jpg" alt="דמות 1c" /> איור 1C תמונה וירטואלית Slice ניתוח של חלוקת כל בטא תאים בלבלב מבוגר שלם מסכה של חלקיקים ניאון פרוסה הווירטואלי. קודי צבע: [1] כחול: הקרינה בעצימות נמוכה, [2] ירוק: עוצמת הקרינה ביניים, ו [3] אדום: הקרינה בעוצמה גבוהה. <img src="/files/ftp_upload/1970/1970Fig1D.jpg" alt="דמות 1d" /> איור תמונה 1D וירטואלי Slice ניתוח של חלוקת כל בטא תאים בלבלב מבוגר ללא פגע כימות איים בודדים / אשכולות של בטא תאים. שים לב שכל איון (כולל קבוצות קטנות של תאים בטא) ממוספר, עם מידע מפורט שלה בתרשים המקביל. ארבעה פרמטרים נלקחו כל מבנה: (1) אזור, (2) המערכת; (3) המעגליות: מידה של עגלגלות שבו מספר 1.0 מייצגת עיגול מושלם; ו (4) בקוטר של Feret: המרחק הארוך ביותר בתחום. שימו לב # 706 מציג את הרזולוציה מנתח עם שטח של רק בטא תאים בודדים. פילוח פרשת המים מזהה קבוצות של איים סמוכים, כמו זה המוצג, הולם מבדיל אותם איים נפרדים (איים 1554, 1555 ו 1556). <img src="/files/ftp_upload/1970/1970Fig1E.jpg" alt="דמות 1e" /> איור 1E תמונה וירטואלית Slice ניתוח של חלוקת כל בטא תאים בלבלב מבוגר ללא פגע 3 מימדי המגרש של הניתוח פרוסה וירטואלית, עם צירים של האזור, היקף בקוטר של Feret. כל נקודה מייצגת איון.

<ol>
	<li>Miller, K., Kim, A., Kilimnik, G., Moka, U., Jo, J., Periwal, V., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+formation+during+the+neonatal+development+in+mice.">Islet formation during the neonatal development in mice.</a> PloS One. 4, E7739-E7739 (2009).</li><li>Kilimnik, G., Kim, A., Jo, J., Miller, K., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+pancreatic+islet+distribution+in+situ+in+mice.">Quantification of pancreatic islet distribution in situ in mice.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 297, E1331-E1338 (2009).</li><li>Hara, M., Wang, X., Kawamura, T., Bindokas, V. P., Dizon, R. F., Alcoser, S. Y., Magnuson, M. A., Bell, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+with+green+fluorescent+protein-labeled+pancreatic+beta+-cells.">Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 284, E177-E183 (2003).</li><li>Hara, M., Dizon, R. F., Glick, B. S., Lee, C. S., Kaestner, K. H., Piston, D. W., Bindokas, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+pancreatic+beta-cells+in+the+intact+pancreas.">Imaging pancreatic beta-cells in the intact pancreas.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 290, E1041-E1047 (2006).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

ניתוח של תמונות Slice וירטואלי של איים וביתא תאים בלבלב אשכולות שלמים מספק תצוגה רחב היקף של חלוקת כל האיונים. התפתחויות ושינויים בחלוקת איון מוחלט לאורך זמן ולכן יכול להיות למד בהשוואה. כזה למשל הוא הפגינו הניתוח שלנו של היווצרות הלבלב איון (1). ניתוח מקיף של pancreata עכברי...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltex</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>F.S.T</td>
<td>14001-13</td>
<td>01n2</td>
</tr>
<tr>
<td>Scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>F.S.T</td>
<td>14072-10</td>
<td>02s5	</td>
</tr>
<tr>
<td>Large glass slide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>71862-01</td>
<td>75x51x1.2mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Large cover glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ted Pella, Inc</td>
<td>260462</td>
<td>50x75mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass Slide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-550-15</td>
<td>25x75x1.0mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Cover glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-458-5M</td>
<td>75x25mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Cover glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Erie Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>25mm circle</td>
</tr>
<tr>
<td>Fluorescent microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus IX-81</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissection microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus SZX12</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stereo Investigator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MicroBrightField</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MIP-GFP mice</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson Laboratory</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

in situ quantification of pancreatic beta-cell mass in mice

האיתור שינויים של אוכלוסיות תאים ספציפיים בבריאות ובחולי היא מטרה חשובה של מחקר ביו. תהליך שגשוג התא בטא בלבלב ניטור צמיחה איון הוא מאתגר במיוחד. פיתחנו שיטה כדי ללכוד את חלוקת בטא בלבלב תאים שלמים של העכברים הטרנסגניים עם הקרינה-tagged בטא תאים עם מאקרו נכתב עבור ImageJ (rsb.info.nih.gov / ij /). בעקבות לנתיחה הלבלב וניקוי רקמות הלבלב, כולו נתפס כמו פרוסת וירטואלי, שלאחריו GFP-tagged בטא התאים נבדקות. הניתוח כולל את כימות המספר הכולל תא בטא, איון אזור והפצה גודל תוך התייחסות לפרמטרים מיקומים ספציפיים עבור כל איון עבור אשכולות קטנים של תאים בטא. הפצה כולו של איונים ניתן להתוות בשלושה ממדים, וגם את המידע על התפלגות גודל וצורה של איון כל מאפשר השוואה כמותית ואיכותית של שינויים באזור בטא תא הכוללת במבט אחד.

Watch this Scientific Journal Video about In situ Quantification of Pancreatic Beta-cell Mass in Mice at JoVE.com

In situ Quantification of Pancreatic Beta-cell Mass in Mice

פרוטוקול הבא מתאר את התהליך של דיסקציה הלבלב הדמיה פרוסה וירטואלית, ועל כימות הבאים של כל ה-GFP-tagged בתאי בטא בלבלב כולו.

ב כימות באתרו של המיסה הלבלב בטא תא עכברים

Tracing changes of specific cell populations in health and disease is an important goal of biomedical research. The process of monitoring pancreatic ...

in-situ-quantification-of-pancreatic-beta-cell-mass-in-mice

Research

JoVE Journal

Biology

In situ Quantification of Pancreatic Beta-cell Mass in Mice

12.1K Views.  University of Chicago. פרוטוקול הבא מתאר את התהליך של דיסקציה הלבלב הדמיה פרוסה וירטואלית, ועל כימות הבאים של כל ה-GFP-tagged בתאי בטא בלבלב כולו.

Video: In situ Quantification of Pancreatic Beta-cell Mass in Mice

Transplantation of Pancreatic Islets Into the Kidney Capsule of Diabetic Mice

Our protocol was developed to cleanly and easily deliver islets or cells under the kidney capsule of diabetic or normal mice. We found that it was easier to concentrate the islets or cells into pellets in the final delivery tubing (PE50) used to transplant the cells under the kidney capsule. This technique provides both speed and ease while reducing any undue stress to the cells or to the mouse.

Loading: Settled, hand picked, islets or pelleted cells are carefully aspirated off the bottom of a 1.5 mL microcentrifuge tube using a p200 pipetteman and a straight, thin-wall pipette tip. A length of PE50 tubing is attached to the pipette tip using a small silicone adapter tubing. Cells are allowed to settle, in the tip, and then are transferred to the PE50 tubing by slowly dialing the pipetteman. Once the cells are near the end of the PE50 tubing, a kink is made and the silicone adaptor tubing is placed over the kink. The PE50 tubing is transferred to a 15 mL conical containing a cut 5 mL pipet, and the PE50 tubing is taped over the side of the 5 mL pipet to prevent curling during centrifuging. Cells are allowed to reach 1,000 rpm and stopped.
Transplantation: Recipient mice are anesthetized, shaved, and cleaned. A small incision is made on the left flank of the mouse and the kidney is exposed. The kidney, fat, and tissue are kept moist with normal saline swab. The distal end of the PE50 is attached to a Hamilton screw drive syringe, containing a pipette tip, using the silicone adaptor tubing. A small nick is made on the right flank side of the kidney, not too large nor too deep. The beveled end of the PE50 tubing, nearest the cells, is carefully placed under the capsule, the tubing is moved around gently to make space while swabbing normal saline; a dry capsule can tear easily. A small air bubble is delivered under the capsule by slowly dialing the syringe screw drive. Islets are then slowly delivered behind the air bubble. Once the islets have been delivered kidney homeostasis is maintained and the knick is cauterized with low heat. The kidney is placed back into the cavity and the peritoneum and skin are sutured and stapled. Mice are immediately treated with Flunixin and Buprenorphine s.q. and placed in a cage on a heating pad.

Our protocol was developed to cleanly and easily deliver islets or cells under the kidney capsule of mice. Cells are concentrated into pellets in the final tubing used for transplanting the cells under the kidney capsule. The ease of this technique reduces stress to the cells and the mouse.

השתלת איי הלבלב לקופסית הכליה בעכברים סוכרתיים של

Our protocol was developed to cleanly and easily deliver islets or cells under the kidney capsule of diabetic or normal mice.  We found that it was easier ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &amp;#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

כימות γH2AX מוקדים בתגובה קרינה Ionising

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Computer-assisted Large-scale Visualization and Quantification of Pancreatic Islet Mass, Size Distribution and Architecture

The pancreatic islet is a unique micro-organ composed of several hormone secreting endocrine cells such as beta-cells (insulin), alpha-cells (glucagon), and delta-cells (somatostatin) that are embedded in the exocrine tissues and comprise 1-2% of the entire pancreas. There is a close correlation between body and pancreas weight. Total beta-cell mass also increases proportionately to compensate for the demand for insulin in the body. What escapes this proportionate expansion is the size distribution of islets. Large animals such as humans share similar islet size distributions with mice, suggesting that this micro-organ has a certain size limit to be functional. The inability of large animal pancreata to generate proportionately larger islets is compensated for by an increase in the number of islets and by an increase in the proportion of larger islets in their overall islet size distribution. Furthermore, islets exhibit a striking plasticity in cellular composition and architecture among different species and also within the same species under various pathophysiological conditions. In the present study, we describe novel approaches for the analysis of biological image data in order to facilitate the automation of analytic processes, which allow for the analysis of large and heterogeneous data collections in the study of such dynamic biological processes and complex structures. Such studies have been hampered due to technical difficulties of unbiased sampling and generating large-scale data sets to precisely capture the complexity of biological processes of islet biology. Here we show methods to collect unbiased "representative" data within the limited availability of samples (or to minimize the sample collection) and the standard experimental settings, and to precisely analyze the complex three-dimensional structure of the islet. Computer-assisted automation allows for the collection and analysis of large-scale data sets and also assures unbiased interpretation of the data. Furthermore, the precise quantification of islet size distribution and spatial coordinates (i.e. X, Y, Z-positions) not only leads to an accurate visualization of pancreatic islet structure and composition, but also allows us to identify patterns during development and adaptation to altering conditions through mathematical modeling. The methods developed in this study are applicable to studies of many other systems and organisms as well.

Novel computer-assisted methods of large-scale procurement and analysis of immunohistochemically stained pancreatic specimens are described: (1) Virtual Slice capture of the entire section; (2) Mass analysis of large-scale data; (3) Reconstruction of 2D Virtual Slices; (4) 3D islet mapping; and (5) Mathematical analysis.

בסיוע מחשב ויזואליזציה בקנה מידה גדול כימות המוניים הלבלב איילט, התפלגות גודל ואדריכלות

The pancreatic islet is a unique micro-organ composed of several hormone secreting endocrine cells such as beta-cells (insulin), alpha-cells (glucagon), ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

כימות של חלבונים באמצעות העשרה Immunoaffinity פפטיד יחד עם ספקטרומטריית מסה

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Body movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are sheathed by intramuscular connective tissues. Each myofiber contains many myofibrils that run longitudinally along the length of the myofiber. Myofibrils are the contractile apparatus of muscle and they are composed of repeated contractile units known as sarcomeres. A sarcomere unit contains actin and myosin filaments that are spaced by the Z discs and titin protein. Mechanical function of skeletal muscle is defined by the contractile and passive properties of muscle. The contractile properties are used to characterize the amount of force generated during muscle contraction, time of force generation and time of muscle relaxation. Any factor that affects muscle contraction (such as interaction between actin and myosin filaments, homeostasis of calcium, ATP/ADP ratio, etc.) influences the contractile properties. The passive properties refer to the elastic and viscous properties (stiffness and viscosity) of the muscle in the absence of contraction. These properties are determined by the extracellular and the intracellular structural components (such as titin) and connective tissues (mainly collagen) 1-2. The contractile and passive properties are two inseparable aspects of muscle function. For example, elbow flexion is accomplished by contraction of muscles in the anterior compartment of the upper arm and passive stretch of muscles in the posterior compartment of the upper arm. To truly understand muscle function, both contractile and passive properties should be studied.
The contractile and/or passive mechanical properties of muscle are often compromised in muscle diseases. A good example is Duchenne muscular dystrophy (DMD), a severe muscle wasting disease caused by dystrophin deficiency 3. Dystrophin is a cytoskeletal protein that stabilizes the muscle cell membrane (sarcolemma) during muscle contraction 4. In the absence of dystrophin, the sarcolemma is damaged by the shearing force generated during force transmission. This membrane tearing initiates a chain reaction which leads to muscle cell death and loss of contractile machinery. As a consequence, muscle force is reduced and dead myofibers are replaced by fibrotic tissues 5. This later change increases muscle stiffness 6. Accurate measurement of these changes provides important guide to evaluate disease progression and to determine therapeutic efficacy of novel gene/cell/pharmacological interventions. Here, we present two methods to evaluate both contractile and passive mechanical properties of the extensor digitorum longus (EDL) muscle and the contractile properties of the tibialis anterior (TA) muscle.

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Changes in limb muscle contractile and passive mechanical properties are important biomarkers for muscle diseases. This manuscript describes physiological assays to measure these properties in the murine extensor digitorum longus and tibialis anterior muscles.

הערכה של תפקוד שרירים של שריר extensor digitorum Longus<em&gt; גופיים</em&gt; ושריר קדמי tibialis<em&gt; באתר</em&gt; בעכברים

Body  movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal  muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

הדמיה וניתוח של מולקולות ה-mRNA באמצעות הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה ב<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial development will allow for more rigorous analysis of orofacial phenotypes upon abrogation with substances that can genetically or molecularly manipulate gene expression or protein function. Using two dimensional images of the embryonic heads, traditional size dimensions-such as orofacial width, height and area- are measured. In addition, a roundness measure of the embryonic mouth opening is used to describe the shape of the mouth. Geometric morphometrics of these two dimensional images is also performed to provide a more sophisticated view of changes in the shape of the orofacial region. Landmarks are assigned to specific points in the orofacial region and coordinates are created. A principle component analysis is used to reduce landmark coordinates to principle components that then discriminate the treatment groups. These results are displayed as a scatter plot in which individuals with similar orofacial shapes cluster together. It is also useful to perform a discriminant function analysis, which statistically compares the positions of the landmarks between two treatment groups. This analysis is displayed on a transformation grid where changes in landmark position are viewed as vectors. A grid is superimposed on these vectors so that a warping pattern is displayed to show where significant landmark positions have changed. Shape changes in the discriminant function analysis are based on a statistical measure, and therefore can be evaluated by a p-value. This analysis is simple and accessible, requiring only a stereoscope and freeware software, and thus will be a valuable research and teaching resource.

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

A method to quantify the orofacial size and shape of Xenopus laevis embryos has been developed. In this protocol, traditional size measurements are combined with geometric morphometrics to allow for more sophisticated analyses of orofacial development and defects.

כימות Orofacial פנוטיפים ב<em&gt; צפרדעים</em

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of Gi2 (a heterotrimeric G-protein &#945;-subunit) is described in detail.

This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.

תגובה נבחרת ניטור ספקטרומטריית מסה לכימות חלבון מוחלט

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

כימות רזולוציה גבוהות של הצטברות צלולוזת גבישים ב<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; שורשי לפקח סלולארי רקמות ספציפיות קיר שינויים

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase or an alternative pathway, known as alternative lengthening of telomeres (ALT)1. Recently, C. elegans has emerged as a multicellular model organism for the study of telomere and ALT2. Visualization of repetitive sequences in the genome is critical in understanding the biology of telomeres. While telomere length can be measured by telomere restriction fragment assay or quantitative PCR, these methods only provide the averaged telomere length. On the contrary, fluorescence in situ hybridization (FISH) can provide the information of the individual telomeres in cells. Here, we provide protocols and representative results of the method to determine telomere length of C. elegans by fluorescent in situ hybridization. This method provides a simple, but powerful, in situ procedure that does not cause noticeable damage to morphology. By using fluorescently labeled peptide nucleic acid (PNA) and digoxigenin-dUTP-labeled probe, we were able to visualize two different repetitive sequences: telomere repeats and template of ALT (TALT) in C. elegans embryos and gonads.

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

We report a concise procedure of fluorescence in situ hybridization (FISH) in the gonad and embryos of Caenorhabditis elegans for observing and quantifying repetitive sequences. We successfully observed and quantified two different repetitive sequences, telomere repeats and template of alternative lengthening of telomeres (TALT).

תצפית כימות הטלומרים ו רצפים חוזרים קרינה באמצעות<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (דגים) עם PNA בדיקות ב<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase ...