نشكر مايك ديفيدسون جورج (جامعة ولاية فلوريدا) لتقديم الحمض النووي بلازميد ترميز البروتينات الفلورية. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح GM72048 (لبرنامج عمل الدوحة).

1. إعداد عينات الحبرية بروتين فلوري قطرات بروتين فلوري عينة تتكون من مستحلب 1-octanol/water مع بروتين فلوري المقيمين في المرحلة المياه. وتأتي هذه مستحلب بين شريحة المجهر والزجاج مربعة طول ضلعها 22 غطاء لتطبيقات المجهر. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل اتخاذ الفلورسنت عينات الحبرية البروتين الشرائح المجهر والنظارات تغطية الحاجة إلى تنظيف والمغلفة مع وكيل مسعور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف الأواني الزجاجية التي الغسيل 5 دقائق مع الأسيتون ويترك ليجف عن طريق الجو. (اختياريا ، بعد تنظيف الأواني الزجاجية ويمكن علاج لمدة 30 ثانية في نظافة البلازما للحصول على النتائج المثلى طلاء). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل 2 ٪ methyltrimethoxysilane في الأسيتون ومعطف الأواني الزجاجية اثناء حضانة 2 دقيقة في هذا الحل. بعد طلاء إزالة الزجاج من المحلول ويترك ليجف عن طريق الجو. ثم شطف مع الايثانول 70 ٪ من زجاجة رذاذ ويترك ليجف مرة أخرى. (اختياري ، يمكن في هذه المرحلة يكون خبز والأواني الزجاجية لمدة 1 ساعة على 80 درجة مئوية لربط تساهمي في طلاء الأواني الزجاجية ل). ويمكن تخزين الأواني المطلية لا يقل عن شهر واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويجري تنقية البروتينات الفلورية والبروتين له 6 - الموسومة من E. 1 القولونية. قياس الطيف الامتصاصية من البروتين النقي وإعداد الأوراق المالية مع تخفيف الكثافة البصرية ~ 0.1 في STE العازلة (150 ملي مول كلوريد الصوديوم ، و 10 ملي تريس ، الرقم الهيدروجيني حمض الهيدروكلوريك 8 ، 1 ملم EDTA) ، التي تحتوي على 0.1 ٪ ألبومين المصل البقري (BSA) . بالإضافة تحضير 10 مل من مزيج 01:01 من العازلة 1 - الأوكتانول وSTE في أنبوب مخروطي 15 مل ومزيج بقوة. بعد إجازة الاختلاط حتى فصل المرحلة بشكل كامل. المرحلة الأعلى هو 1 - الأوكتانول. (تنبيه : 1 - الأوكتانول لأن له رائحة قوية من المهم استخدام حاوية النفايات المغلقة على كل شيء يأتي في اتصال مع الأوكتانول - 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لجعل ماصة مستحلب 45 ميكرولتر 1 - الأوكتانول و 5 بروتين فلوري ميكرولتر في أنبوب microfuge. اضغط على أنبوب بضع مرات بإصبعك لبدء تشكيل مستحلب ثم يصوتن الأنبوب لمدة 30 ثانية في حمام صوتنة. في الوقت نفسه الحصول على شريحة المجهر والزجاج المطلي وتغطية جاهزة. بعد صوتنة ينبغي أن يكون مستحلب غائم تماما. مباشرة بعد صوتنة مستحلب 4 ماصة ميكرولتر من منتصف الأنبوب على شريحة المجهر وتغطية المغلفة مع كوب تغطية المغلفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا تم إجراء بشكل صحيح يجب أن مستحلب انتشار بالتساوي بين الشريحة المجهر والزجاج الكائن. في غضون دقائق وينبغي أن تكون العينة مستقرة ، ويتألف من 10 ميكرون ~ قطرات الفلورسنت سميكة بدرجات القطر. أكبر قطرات على مقربة من مركز للعينة وتقع أصغر مزيد من التقدم نحو الحواف. </li></ol> 2. إقامة تجربة photoconversion الإجراء التالي هو استراتيجية عامة لإقامة photoconversion بروتين فلوري التجربة. ويمكن تطبيق هذا الإجراء لتنقية البروتينات فضلا عن الخلايا الحية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المعلمات التالية يوفر نقطة انطلاق العامة لإعداد تجربتك photoconversion : 40X الغمر النفط 1.3NA الهدف حجم الصورة = 512 × 512 بكسل مسح التكبير = 4 بكسل يسكن الوقت = 6 μsec. Z - القرار (حجم الثقب) = 3 ميكرومتر </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكوين قنوات كشف اثنان لمضان الأولية وphotoconverted ، فضلا عن &quot;قناة photoconversion&quot;. في هذا المثال سوف نستخدم المنقى mOrange2 البروتين ، وهو البرتقالي إلى الأحمر بروتين فلوري photoconvertible. يتم الكشف عن أنواع البرتقال باستخدام 561 نانومتر ، والإثارة التي يتم جمعها في مضان بين 570 نانومتر و 630 نانومتر. تم الكشف عن هذا النوع photoconverted الحمراء باستخدام 633 نانومتر ، والإثارة التي يتم جمعها في مضان بين 640 نانومتر ونانومتر 700. ل &quot;قناة photoconversion&quot; حدد 488 نانومتر الإثارة وجمع مضان بين 490 نانومتر ونانومتر 540. (ملاحظة : التصوير القناة photoconversion ليس ضروريا تماما) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام القناة لتصوير مضان الأولي مع المسح المستمر لضبط السلطة وكسب ليزر للكشف عن جودة الصورة المثلى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنشيط قناة photoconversion وحدد قوة الليزر المنخفضة. بدء تصوير سلسلة مرور الوقت وزيادة تدريجية ليزر photoconversion حتى يتم تبييض وحظ كبير من مضان الأولي. تواصل المسح حتى مضان الأولي هو ما يقرب من 75 ٪ ابيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنشيط وتفعيل قناة photoconversion القناة الكشف عن photoconverted مضان. بدء التصوير مع مكسب للكشف عن ارتفاع وانخفاض قوة الليزر وزيادة قوة الليزر تدريجيا حتى يتم الكشف عن photoconverted مضان. بمجرد الكشف عن مضان photoconverted يمكنك ضبط قوة الليزر لكشف والحصول على جودة الصورة المثلى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أخيرا ، استخدمت قوة الليزرلphotoconversion فضلا عن مدة photoconversion بحاجة إلى أن يكون الأمثل. وزيادة قوة الليزر photoconversion تسريع معدل photoconversion ، ولكن الكثير من قوة الليزر سوف photobleach البروتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة وقد تم تحديد الليزر photoconversion الأمثل السلطة ومدتها ، ويمكن استخدام هذه المعلمات لتكوين وحدة معيارية أو photobleaching FRAP و &quot;قناة photoconversion&quot; لم تعد مطلوبة. </li></ol> 3. المزدوج التحقيق تسليط الضوء على والبصرية مع mOrange2 Dronpa لأن من خصائص الحمراء تحولت الطيفية ، يمكن أن تستخدم في تركيبة مع mOrange2 الأخضر photoswitchable Dronpa بروتين فلوري لتسليط الضوء على التحقيق المزدوجة البصرية للسماح الانتقائي لتسليط الضوء على خلية مفردة 4 (عضية) السكان. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزرع الخلايا في أسفل الزجاج والأطباق ماتيك transfected قبل 24 ساعة من التصوير باستخدام معيار Lipofectamine2000 ترنسفكأيشن 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المجهر لmOrange2 photoconversion كما هو موضح في القسم 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكوين لphotoswitching Dronpa المجهر. ولا يمكن تصوير Dronpa مضان باستخدام mOrange2 &quot;قناة photoconversion&quot; (انظر الخطوة 2.2). (ملاحظة : تصغير قوة الليزر المستخدمة في التصوير Dronpa ، لأن الكثير من الطاقة ليزر لتعطيل سيتسبب Dronpa.) إضافة إلى قناة لتنشيط ضوئي Dronpa. نحن نستخدم 800 نانومتر ثنائية الفوتون الإثارة لتنشيط ضوئي ، ولكن بدلا من ذلك يمكن أن يتحقق ذلك باستخدام الإثارة 405 نانومتر. تحديد الطاقة المطلوبة ليزر والتصوير ، وتنشيط ضوئي ، وتعطيل ضوئي من Dronpa مضان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحذر : Photoconversion من mOrange2 وتعطيل كلا من Dronpa تحدث عند الإثارة نانومتر 488. نظرا لقوة الليزر العالية المطلوبة لmOrange2 photoconversion هذا سوف يعطل أيضا Dronpa مضان. من ناحية أخرى ، Dronpa تعطيل يحدث بالفعل في قوة الليزر أقل من ذلك بكثير ، ويمكن القيام بها دون photoconversion mOrange2 كبيرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حالما يتم تعيين المعلمات لphotoconversion mOrange2 وphotoswitching Dronpa ، هو تسليط الضوء على تحقيقه من خلال التحقيق المزدوجة البصرية الخطوات التالية. أولا ، تعطيل Dronpa مضان في مجال كامل من العرض مع انخفاض القوة الإثارة نانومتر 488. ثانيا ، تحديد منطقة من الاهتمام وmOrange2 photoconvert الإثارة مع ارتفاع الطاقة نانومتر 488. أخيرا ، حدد المنطقة التي تهم تنشيط Dronpa مضان. </li></ol> 4. ممثل النتائج <img src="/files/ftp_upload/1995/1995fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. قطيرة إعداد العينة. A) عينة الحبرية أعدت بشكل صحيح. ب) نموذج أعدت طلاء دون الشريحة المجهر والزجاج غطاء. ج) إعداد نموذج دون إضافة BSA 0.1 ٪. <img src="/files/ftp_upload/1995/1995fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. وphotoconverted باستمرار تأثير قوة الليزر photoconversion ومدتها على mOrange2 photoconversion. قطرات واحدة تحتوي على البروتين mOrange2 باستخدام كميات مختلفة من 488 نانومتر قوة الليزر. وكان النسبي لقوة الليزر المستخدمة photoconversion 10 ٪ (الصلبة) ، و 25 ٪ (متقطع) ، و 100 ٪ (منقط). أ) أنواع البرتقال الفلورسنت. B) Photoconverted الأنواع الحمراء الفلورسنت. <img src="/files/ftp_upload/1995/1995fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. المزدوج التحقيق تسليط الضوء على والبصرية مع mOrange2 Dronpa. خلية) معربا عن mOrange2 - هيستون H2B وDronpa ميتو - photoconversion قبل ، والتي تبين البرتقال مضان في النواة ومضان أخضر في الميتوكوندريا. ب) تم تبديل Dronpa مضان قبالة مع انخفاض القوة الإثارة 488 نانومتر ، مما تسبب في الحد الأدنى من photoconversion mOrange2. C) كان photoconverted mOrange2 إلى اللون الأحمر مع ارتفاع القوة الإثارة نانومتر 488. D) وتحولت Dronpa مضان على مرة أخرى باستخدام 800 نانومتر 2 - الفوتون الإثارة. لوحات وتراكب من الصور مضان جنبا إلى جنب مع فرق التدخل تباين الصورة.

<ol>
	<li>Kremers, G. J., Hazelwood, K. L., Murphy, C. S., Davidson, M. W., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoconversion+in+orange+and+red+fluorescent+proteins.">Photoconversion in orange and red fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 6, 355-358 (2009).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وتنقيته قطيرة عينة بروتين فلوري هو تنسيق عينة مريحة للغاية لتوصيف البروتينات الفلورية photophysical ، على سبيل المثال لدراسة حركية وحركية photobleaching photoconversion. حجم القطيرات الصغيرة جدا (~ 20 بيكو لتر) يسهل photobleaching photoconversion والتجارب ، والتي قد يكون من الصعب القيام بها في النظم ال?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Microsope slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR Scientific</td>
<td>48312-003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>22 mm cover glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>2940-245</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-octanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>O4500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>methyltrimethoxysilane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M6420</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MatTek dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MatTek Corp.</td>
<td>P35G-1.5-14-C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lipofectamine2000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11668-019</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

photoconversion of purified fluorescent proteins and dual-probe optical highlighting in live cells

البروتينات الفلورية Photoconvertible (PC - FPS) هي فئة من البروتينات الفلورية مع &quot;هيغليغتر البصرية&quot; القدرة ، وهذا يعني أنه يمكن تغيير لون ومضان عن التعرض لضوء طول موجة محددة. تسليط الضوء على العلامات الضوئية يسمح موسع بعض الفئات السكانية من الجزيئات نيون ، وبالتالي فهي مثالية لتعقب خلايا مفردة أو العضيات. المعلمات حرجة للphotoconversion كفاءة وكثافة ومدة التعرض للضوء photoconversion. إذا كانت كثافة منخفضة جدا ، وسوف يكون بطيئا photoconversion أو لا يحدث على الإطلاق. من ناحية أخرى ، يمكن أن كثافة أكثر من اللازم أو التعرض لفترة طويلة جدا photobleach البروتين وبالتالي الحد من كفاءة photoconversion. يصف هذا البروتوكول نهجا عاما كيفية إعداد ليزر متحد البؤر المجهر لفحص الطلبات photoconversion PC - FP. أولا ، نحن وصف الإجراء لإعداد عينات الحبرية تنقية البروتين. هذا التنسيق هو نموذج مناسب جدا لدراسة السلوك photophysical من البروتينات الفلورية تحت المجهر. ثانيا ، سوف نستخدم عينة بروتين الحبرية لإظهار كيفية تكوين المجهر لphotoconversion. وأخيرا ، فإننا سوف تظهر كيفية تنفيذ الضوئية في تسليط الضوء على الخلايا الحية ، بما في ذلك التحقيق تسليط الضوء المزدوجة البصرية مع mOrange2 وDronpa.

Watch this Scientific Journal Video about Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells at JoVE.com

Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

هذا البروتوكول يصف النهج العام لأداء photoconversion من البروتينات الفلورية على مجهر المسح الضوئي ليزر متحد البؤر. نحن تصف إجراءات photoconversion عينات البروتين puried ، فضلا عن ثنائي التحقيق تسليط الضوء على الخلايا الضوئية في العيش مع وmOrange2 Dronpa.

Photoconversion منقى من البروتينات ونيون المزدوجة التحقيق تسليط الضوء البصري في الخلايا الحية

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of ...

photoconversion-purified-fluorescent-proteins-dual-probe-optical

Research

JoVE Journal

Biology

12.1K Views.  Vanderbilt University. هذا البروتوكول يصف النهج العام لأداء photoconversion من البروتينات الفلورية على مجهر المسح الضوئي ليزر متحد البؤر. نحن تصف إجراءات photoconversion عينات البروتين puried ، فضلا عن ثنائي التحقيق تسليط الضوء على الخلايا الضوئية في العيش مع وmOrange2 Dronpa.

Video: Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

وسم الخلايا الجذعية مع الأصباغ نيون للمنظمات غير الغازية مع الكشف عن التصوير الضوئي

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

العناية والتنظيف السليم للمجهر

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. These systems offer a broad selection of fluorescent substrates optimized for a range of imaging instrumentation. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again. There are two steps to using this system: cloning and expression of the protein of interest as a SNAP-tag fusion, and labeling of the fusion with the SNAP-tag substrate of choice. The SNAP-tag is a small protein based on human O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), a DNA repair protein. SNAP-tag labels are dyes conjugated to guanine or chloropyrimidine leaving groups via a benzyl linker. In the labeling reaction, the substituted benzyl group of the substrate is covalently attached to the SNAP-tag. CLIP-tag is a modified version of SNAP-tag, engineered to react with benzylcytosine rather than benzylguanine derivatives. When used in conjunction with SNAP-tag, CLIP-tag enables the orthogonal and complementary labeling of two proteins simultaneously in the same cells.

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again.

الفلورسنت وصفها من COS - 7 تعرب عن البروتينات الانصهار SNAP - شعارا لتصوير الخلايا الحية

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic development 1, 2. One of the signaling pathways involved in this regulation is the Wnt pathway, which is used many times during embryogenesis and critical for human disease3, 4, 5. Multiple molecular components of this pathway coordinately regulate signaling in a spatially-restricted manner, but the underlying mechanisms are not fully understood. Xenopus embryonic epithelial cells is an excellent system to study subcellular localization of various signaling proteins. Fluorescent fusion proteins are expressed in Xenopus embryos by RNA microinjection, ectodermal explants are prepared and protein localization is evaluated by epifluorescence. In this experimental protocol we describe how subcellular localization of Diversin, a cytoplasmic protein that has been implicated in signaling and cell polarity determination6, 7 is visualized in Xenopus ectodermal cells to study Wnt signal transduction8. Coexpression of a Wnt ligand or a Frizzled receptor alters the distribution of Diversin fused with red fluorescent protein, RFP, and recruits it to the cell membrane in a polarized fashion 8, 9. This ex vivo protocol should be a useful addition to in vitro studies of cultured mammalian cells, in which spatial control of signaling differs from that of the intact tissue and is much more difficult to analyze.

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Xenopus embryonic ectoderm has become an attractive model for studies of cell polarity. An assay is described, in which subcellular distribution of fluorescent proteins is assessed in ectoderm cells. This protocol will help address questions related to spatial control of signaling.

الاستقطاب إزفاء من البروتينات في نيون القيطم الأدمة في الاستجابة لاشارة Wnt

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

يعيش التصوير من البروتينات التي تحمل علامات GFP في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; البويضات

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

حيوي داخلي المجهري للهياكل التصوير التحت خلوية في الفئران لايف تعرب عن البروتينات الفلورية

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

في الجسم الحي تتبع نسيلي من الخلايا الجذعية المكونة للدم والسلف تميزت خمسة البروتينات الفلورية باستخدام الميكروسكوب متحد البؤر وMultiphoton

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

الأخضر الفلورسنت القائم على البروتين التعبير فحص غشاء البروتينات في<em&gt; الإشريكية القولونية</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

إعادة إعماره الوظيفية وآخر قناة قياسات تنقية Wildtype والمسخ CFTR البروتين

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH distribution and calcium ions can be observed using live microscopy over time. This allows identification of the life stage and the tissue with the feature of interest for further electron microscopy studies. Life stage and tissues of interest are typically higher in pH and Ca signals. 
Here, using H. elegans, we present a protocol to characterize the presence of calcium carbonate structures in a biological specimen on the scanning electron microscope (SEM), using energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS) to visualize elemental composition, using electron backscatter diffraction (EBSD) to determine the presence of crystalline structures, and using transmission electron microscopy (TEM) to analyze the composition and structure of the material. In this protocol, a focused ion beam (FIB) is used to isolate samples with dimension suitable for TEM analysis. As FIB is a site specific technique, we demonstrate how information from the previous techniques can be used to identify the region of interest, where Ca signals are highest.

We demonstrate the use of various microscopy methods that are useful in observing the calcification of a tubeworm, Hydroides elegans, as well as locating and characterizing the first calcified material. Live microscopy and electron microscopy are used together to provide functional and material information that are important in studying biomineralization.

توصيف تكلس الأحداث عن طريق لايف البصرية والمجهر الإلكتروني تقنيات في Tubeworm البحرية

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...