אנו מודים מייק W. דוידסון (פלורידה סטייט) למתן DNA פלסמיד קידוד חלבוני ניאון. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענק GM72048 (עד בעירייה).

1. הכנת דוגמאות אגל חלבון פלואורסצנטי מדגם ניאון אגל חלבון מורכב תחליב 1-octanol/water עם חלבון פלואורסצנטי המתגוררים שלב המים. אמולסיה זו היא דחוקה בין שקופיות מיקרוסקופ ו 22 מ&quot;מ מרובע זכוכית לכסות עבור יישומים במיקרוסקופ. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ביצוע דגימות חלבון פלואורסצנטי טיפה את השקופיות מיקרוסקופ ומשקפיים לכסות צריכים לנקות ומצופה סוכן הידרופובי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניקוי זכוכית על ידי שטיפה 5 דקות עם אצטון ולהשאיר לייבוש באוויר. (לחלופין, לאחר ניקוי כלי זכוכית יכולים להיות מטופלים במשך 30 שניות שואב פלזמה כדי להשיג תוצאות אופטימליות ציפוי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון methyltrimethoxysilane 2% אצטון המעיל זכוכית במהלך הדגירה דקות 2 בפתרון זה. לאחר להסיר את ציפוי זכוכית מפתרון ולהשאיר לייבוש באוויר. לאחר מכן לשטוף עם אתנול 70% מבקבוק תרסיס ולהשאיר לייבוש שוב. (לחלופין, בשלב זה, כלי זכוכית ניתן לאפות במשך שעה 1 ב 80 ° C עד קוולנטית הקישור ציפוי זכוכית). כלי זכוכית מצופים יכול להיות מאוחסן במשך חודש אחד לפחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלבונים פלורסנט הם מטוהרים כמו חלבון 6-tagged שלו מ E. קולי 1. מדוד את ספקטרום הספיגה של החלבון מטוהרים להכין דילול המניה עם צפיפות אופטית של 0.1 ~ ב STE חיץ (150 mM NaCl, 10 mM טריס-HCl pH 8, 1 mM EDTA), המכיל 0.1% אלבומין בסרום שור (BSA) . בנוסף להכין 10 מ&quot;ל של תערובת 01:01 של חיץ 1-octanol ו STE בצינור חרוטי 15 מ&quot;ל וערבבו במרץ. לאחר לעזוב ערבוב עד הפרדת פאזות תושלם. השלב העליון הוא 1-octanol. (זהירות: מכיוון 1-octanol יש ריח חזק חשוב להשתמש מיכל פסולת סגור על כל מה בא במגע עם 1-octanol). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפוך את פיפטה אמולסיה 45 μl 1-octanol ו 5 חלבון פלואורסצנטי μl בצינור microfuge. לחץ על צינור כמה פעמים עם האצבע להתחיל היווצרות של אמולסיה, ואז sonicate הצינור למשך 30 שניות באמבטיה sonication. ב בינתיים לקבל שקופיות מיקרוסקופ מצופה זכוכית לכסות מוכן. לאחר sonication אמולסיה צריך להיות מעונן לחלוטין. מיד לאחר אמולסיה sonication 4 פיפטה μl מאמצע הצינור לשקופית מיקרוסקופ מצופה ומכסים כיסוי זכוכית מצופה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם ההליך נעשה בצורה נכונה אמולסיה צריך להתפשט באופן שווה בין שקופיות מיקרוסקופ ואת זכוכית האובייקט. בתוך דקות המדגם צריך להיות יציב, המורכב ~ 10 מיקרומטר טיפות פלורסנט עבה עם קוטר משתנה. הטיפות הגדולות קרובים במרכז המדגם קטן ממוקמים נוסף לעבר הקצוות. </li></ol> 2. הגדרת הניסוי photoconversion ההליך הבא היא אסטרטגיה כללית להגדרת ניסוי photoconversion חלבון פלואורסצנטי. הליך זה יכול להיות מיושם על חלבונים טהורים, כמו גם עבור תאים חיים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרמטרים הבאים לספק נקודת התחלה בכלל להגדיר ניסוי photoconversion שלך: טבילה 40X 1.3NA שמן אובייקטיבי גודל תמונה = 512 x 512 פיקסלים סריקה זום = 4 Pixel להתעכב זמן = 6 μsec. Z-ברזולוציה (גודל חריר) = 3 מיקרומטר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת שני ערוצי גילוי הקרינה הראשוני photoconverted, כמו גם &quot;ערוץ photoconversion&quot;. בדוגמה זו נשתמש מטוהרים mOrange2 חלבון, שהוא חלבון כתום אל אדום ניאון photoconvertible. מינים תפוז מזוהה באמצעות עירור 561 ננומטר לבין הקרינה נאסף בין 570 nm ו 630 nm. מינים אדומים photoconverted מזוהה באמצעות עירור 633 ננומטר לבין הקרינה נאסף בין 640 ננומטר ו -700 ננומטר. עבור &quot;ערוץ photoconversion&quot; עירור לבחור 488 ננומטר ולאסוף הקרינה בין 490 nm ו 540 nm. (הערה:. לערוץ הדמיה photoconversion הוא לא הכרחי) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש הערוץ עבור דימות פלואורסצנטי ראשוני עם סריקה רציפה כדי להתאים את כוח לייזר ולהשיג גלאי עבור איכות תמונה אופטימלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את ערוץ photoconversion ובחר כוח לייזר נמוך. התחל הדמיה סדרה זמן לשגות ובהדרגה להגביר את הלייזר photoconversion משמעותי עד להלבנה של הקרינה הראשונית הוא ציין. המשך סריקה עד פלואורסצנציה הראשוני הוא כ -75% מולבן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל את הערוץ photoconversion ולהפעיל את ערוץ גילוי הקרינה photoconverted. התחל הדמיה עם רווח גלאי גבוהה כוח לייזר נמוך ובהדרגה להגביר את כוח לייזר עד פלואורסצנציה photoconverted מזוהה. ברגע שאתה מזהה את הקרינה photoconverted תוכל להתאים כוח לייזר ולהשיג גלאי עבור איכות תמונה אופטימלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, כוח לייזר המשמשיםעבור photoconversion וכן את משך הזמן של photoconversion צריך להיות מותאם. הגדלת כוח לייזר photoconversion יאיץ את קצב photoconversion, כוח לייזר עם זאת יותר מדי יהיה photobleach את החלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר photoconversion אופטימלי לייזר כוח משך נקבעו, פרמטרים אלה ניתן להשתמש כדי להגדיר photobleaching סטנדרטי או מודול FRAP את &quot;ערוץ photoconversion&quot; הוא כבר לא נדרש. </li></ol> 3. Dual-בדיקה אופטי עם הדגשת mOrange2 ו Dronpa בגלל אדום העביר תכונות ספקטרליות, mOrange2 ניתן להשתמש בשילוב עם Dronpa חלבון הפלואורסצנט הירוק photoswitchable עבור dual-הדגשת בדיקה אופטי לאפשר הדגשת סלקטיבי של תאים בודדים 4 (אברון) אוכלוסיות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים גדלים בתחתית צלחות זכוכית MatTek ו transfected 24 שעות לפני הדמיה באמצעות transfection תקן Lipofectamine2000 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת מיקרוסקופ עבור photoconversion mOrange2 כמתואר בסעיף 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את מיקרוסקופ עבור photoswitching Dronpa. Dronpa הקרינה ניתן הדמיה באמצעות &quot;ערוץ photoconversion&quot; mOrange2 (ראה שלב 2.2). (הערה: מזער את כוח לייזר המשמש הדמיה Dronpa, כי כוח לייזר רב מדי יגרום איון של Dronpa.) הוסף ערוץ photoactivation Dronpa. אנו משתמשים ב 800 ננומטר שני הפוטונים עירור עבור photoactivation, אבל לחילופין זו יכולה להיות מושגת באמצעות עירור 405 ננומטר. קבע את כוח לייזר נדרש הדמיה, photoactivation ו photoinactivation של Dronpa פלואורסצנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהירות: photoconversion של mOrange2 ו איון של Dronpa הן מתרחשות על עירור 488 ננומטר. בגלל הכוח הלייזר גבוהה נדרש photoconversion mOrange2 זה יהיה גם להשבית Dronpa פלואורסצנטי. מצד שני, איון Dronpa מתרחשת כבר כוח לייזר נמוך בהרבה וניתן לבצעו ללא photoconversion mOrange2 משמעותי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הפרמטרים photoconversion mOrange2 ו photoswitching Dronpa מוגדרים, הדגשת בדיקה אופטי כפול מושגת באמצעות הצעדים הבאים. ראשית, להשבית Dronpa הקרינה בתחום שלם של נוף עם כוח נמוך עירור 488 ננומטר. שנית, לבחור אזור עניין mOrange2 photoconvert עם כוח גבוה עירור 488 ננומטר. לבסוף, בחר אזור של אינטרס להפעיל Dronpa פלואורסצנטי. </li></ol> 4. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/1995/1995fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. Droplet הכנת המדגם. מדגם) אגל מוכן כראוי. ב) Sample מוכן ללא ציפוי השקופית מיקרוסקופ זכוכית המכסה. ג) מדגם מוכן ללא הוספת BSA 0.1%. <img src="/files/ftp_upload/1995/1995fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. השפעת כוח photoconversion לייזר משך על photoconversion mOrange2. טיפות יחיד המכיל חלבון mOrange2 היו photoconverted ברציפות באמצעות כמויות שונות של כוח לייזר 488 ננומטר. כוח לייזר יחסית המשמש photoconversion היה 10% (מוצק), 25% (מקווקו), ו -100% (מנוקד). א) כתום מינים ניאון. ב) מינים Photoconverted ניאון אדום. <img src="/files/ftp_upload/1995/1995fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. Dual-בדיקה אופטי עם הדגשת mOrange2 ו Dronpa. Cell) להביע mOrange2-היסטון H2B ו-Dronpa מיטו לפני photoconversion, מראה הקרינה כתום בגרעין ו פלואורסצנטי ירוק במיטוכונדריה. ב) Dronpa הקרינה היה כבוי עם עירור נמוך 488 כוח ננומטר, גרימת photoconversion מינימלי של mOrange2. ג) היה mOrange2 photoconverted לאדום עם עירור גבוה 488 כוח ננומטר. ד) Dronpa הקרינה דלקה שוב באמצעות 800 ננומטר 2-פוטון עירור. הלוחות הם שכבות של תמונות פלואורסצנציה יחד עם התמונה התערבות ההפרש לעומת זאת.

<ol>
	<li>Kremers, G. J., Hazelwood, K. L., Murphy, C. S., Davidson, M. W., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoconversion+in+orange+and+red+fluorescent+proteins.">Photoconversion in orange and red fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 6, 355-358 (2009).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

המדגם מטוהרים פלורסנט אגל חלבון הוא פורמט דגימה מאוד נוח אפיון photophysical של חלבוני ניאון, למשל ללמוד photobleaching קינטיקה קינטיקה photoconversion. נפח טיפה קטנה מאוד (~ 20 picoliter) מקלה photobleaching וניסויים photoconversion, אשר יכול להיות קשה לבצע במערכות קובט מבוסס. בנוסף, כפי שמוצג כאן המדגם אגל הוא אידיאלי עבור הגדרת מיקרוסקופ confocal עבור יישומים photoconversion. ציפוי הידרופובי ואת הנוכחות של BSA חשובים להשגת טיפות הומוגנית. ללא ציפוי הטיפות נוטים להיות מעוכה כנגד אחד משטחי זכוכית בהעדר BSA חלבון פלואורסצנטי נוטים להצטבר על הממשק 1-octanol/water, יצירת הילה של הקרינה (איור 1). Photoconversion חלבון פלואורסצנטי נחשב לעתים קרובות כחלופה התאוששות הקרינה לאחר photobleaching (FRAP), עם יתרון, כי אפשר גם לעקוב אחר מינים photoconverted. עם זאת, חשוב לקחת בחשבון כי photoconversion תלויה באופן קריטי על כוח לייזר המשמש. מדי photoconversion הרבה כוח לייזר או חשיפה ארוכה מדי תגרום photobleaching ולא photoconversion, ובכך להפחית את כמות הקרינה photoconverted (איור 2). אדום העביר תכונות ספקטרליות של mOrange2 ומינים photoconverted שלה היתר כפול בדיקה סימון אופטי עם סימון ירוק אופטי ניאון. זה יכול להיות חלבון פלואורסצנטי photoswitchable (Dronpa), כפי שמודגם כאן, או לחילופין חלבון פלואורסצנטי photoactivatable, למשל PA-GFP. Dronpa יש יתרון, כי אחד יכול לבדוק את נוכחותה בתחילת הניסוי. מצד שני, השימוש Dronpa מסבך הדגשת אופטית, כי כל הקרינה Dronpa צריך להיות מומת הראשון, ואת העובדה Dronpa הקרינה הוא החליף בהדרגה את במהלך ההדמיה. סיבוכים אלה הם עמוקים פחות בעת שימוש PA-GFP, אבל בדיקת נוכחות של PA-GFP לפני photoactivation יכולה להיות קשה יותר.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Microsope slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR Scientific</td>
<td>48312-003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>22 mm cover glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>2940-245</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-octanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>O4500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>methyltrimethoxysilane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M6420</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MatTek dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MatTek Corp.</td>
<td>P35G-1.5-14-C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lipofectamine2000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11668-019</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

photoconversion of purified fluorescent proteins and dual-probe optical highlighting in live cells

חלבוני ניאון Photoconvertible (pc-FPS) הם קבוצה של חלבוני ניאון עם יכולת &quot;סימון אופטי&quot;, כלומר, את צבע פלואורסצנטי ניתן לשנות על ידי חשיפה לאור באורך גל מסוים. הדגשת אופטית לא פולשנית מאפשרת סימון של subpopulation של מולקולות ניאון, ולכן הוא אידיאלי עבור מעקב אחר תאים בודדים או אברונים. פרמטרים קריטיים עבור photoconversion יעיל הן בעוצמה את זמן החשיפה של האור photoconversion. אם העוצמה נמוכה מדי, photoconversion יהיה איטי או לא להופיע בכלל. מצד שני, בעוצמה רבה מדי או חשיפה ארוכה מדי יכולה photobleach החלבון ובכך להפחית את היעילות של photoconversion. פרוטוקול זה מתאר גישה כללית כיצד להגדיר מיקרוסקופ לייזר confocal סריקה עבור PC-FP יישומים photoconversion. ראשית, אנו מתארים תהליך להכנת מטוהרים אגל דגימות חלבון. מתכונת זו מדגם מאוד נוח לחקר התנהגות photophysical של חלבוני ניאון מתחת למיקרוסקופ. שנית, אנו נשתמש מדגם טיפה חלבון כדי להראות כיצד להגדיר את המיקרוסקופ עבור photoconversion. ולבסוף, אנו נראה כיצד לבצע סימון אופטי בתאים חיים, כולל כפול בדיקה אופטי עם הדגשת mOrange2 ו Dronpa.

Watch this Scientific Journal Video about Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells at JoVE.com

Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

פרוטוקול זה מתאר גישה כללית לבצע photoconversion של חלבוני ניאון על מיקרוסקופ סורק לייזר confocal. אנו מתארים נהלים photoconversion של דגימות חלבון puried, כמו גם עבור dual-בדיקה אופטי הדגשת בתאים חיים עם mOrange2 ו Dronpa.

Photoconversion של חלבונים מטוהרים פלורסנט ו Dual-בדיקה אופטי סימון בתאים חיים

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of ...

photoconversion-purified-fluorescent-proteins-dual-probe-optical

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

12.1K Views.  Vanderbilt University. פרוטוקול זה מתאר גישה כללית לבצע photoconversion של חלבוני ניאון על מיקרוסקופ סורק לייזר confocal. אנו מתארים נהלים photoconversion של דגימות חלבון puried, כמו גם עבור dual-בדיקה אופטי הדגשת בתאים חיים עם mOrange2 ו Dronpa.

Video: Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

תיוג בתאי גזע עם צבעי ניאון על איתור פולשני עם דימות אופטי

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

טיפול ניקוי נאות של המיקרוסקופ

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. These systems offer a broad selection of fluorescent substrates optimized for a range of imaging instrumentation. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again. There are two steps to using this system: cloning and expression of the protein of interest as a SNAP-tag fusion, and labeling of the fusion with the SNAP-tag substrate of choice. The SNAP-tag is a small protein based on human O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), a DNA repair protein. SNAP-tag labels are dyes conjugated to guanine or chloropyrimidine leaving groups via a benzyl linker. In the labeling reaction, the substituted benzyl group of the substrate is covalently attached to the SNAP-tag. CLIP-tag is a modified version of SNAP-tag, engineered to react with benzylcytosine rather than benzylguanine derivatives. When used in conjunction with SNAP-tag, CLIP-tag enables the orthogonal and complementary labeling of two proteins simultaneously in the same cells.

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again.

תיוג פלורסנט של COS-7-SNAP הבעת תג חלבונים Fusion עבור דימות תא חי

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic development 1, 2. One of the signaling pathways involved in this regulation is the Wnt pathway, which is used many times during embryogenesis and critical for human disease3, 4, 5. Multiple molecular components of this pathway coordinately regulate signaling in a spatially-restricted manner, but the underlying mechanisms are not fully understood. Xenopus embryonic epithelial cells is an excellent system to study subcellular localization of various signaling proteins. Fluorescent fusion proteins are expressed in Xenopus embryos by RNA microinjection, ectodermal explants are prepared and protein localization is evaluated by epifluorescence. In this experimental protocol we describe how subcellular localization of Diversin, a cytoplasmic protein that has been implicated in signaling and cell polarity determination6, 7 is visualized in Xenopus ectodermal cells to study Wnt signal transduction8. Coexpression of a Wnt ligand or a Frizzled receptor alters the distribution of Diversin fused with red fluorescent protein, RFP, and recruits it to the cell membrane in a polarized fashion 8, 9. This ex vivo protocol should be a useful addition to in vitro studies of cultured mammalian cells, in which spatial control of signaling differs from that of the intact tissue and is much more difficult to analyze.

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Xenopus embryonic ectoderm has become an attractive model for studies of cell polarity. An assay is described, in which subcellular distribution of fluorescent proteins is assessed in ectoderm cells. This protocol will help address questions related to spatial control of signaling.

טרנסלוקציה מקוטב של חלבוני ניאון ב Xenopus האאקטודרם בתגובה איתות Wnt

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

חי הדמיה של חלבוני ה-GFP שהכותרת ב-<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ביציות

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

4D הדמיה של צבירת חלבון בתאים חיים

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

מיקרוסקופית Intravital למבני ההדמיה subcellular בעכברים חיים לבטא חלבוני פלורסנט

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

במשובט מעקב vivo של גזע hematopoietic ובתאים המסומנים על ידי חמישה חלבונים ניאון באמצעות Confocal וmultiphoton מיקרוסקופית

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

מדידות הכינון פונקציונלי ופעילות הערוץ של מטוהרים wildtype וחלבון CFTR Mutant

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH distribution and calcium ions can be observed using live microscopy over time. This allows identification of the life stage and the tissue with the feature of interest for further electron microscopy studies. Life stage and tissues of interest are typically higher in pH and Ca signals. 
Here, using H. elegans, we present a protocol to characterize the presence of calcium carbonate structures in a biological specimen on the scanning electron microscope (SEM), using energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS) to visualize elemental composition, using electron backscatter diffraction (EBSD) to determine the presence of crystalline structures, and using transmission electron microscopy (TEM) to analyze the composition and structure of the material. In this protocol, a focused ion beam (FIB) is used to isolate samples with dimension suitable for TEM analysis. As FIB is a site specific technique, we demonstrate how information from the previous techniques can be used to identify the region of interest, where Ca signals are highest.

We demonstrate the use of various microscopy methods that are useful in observing the calcification of a tubeworm, Hydroides elegans, as well as locating and characterizing the first calcified material. Live microscopy and electron microscopy are used together to provide functional and material information that are important in studying biomineralization.

אפיון של אירועים קלציפיקציה שימוש אופטי חיה מיקרוסקופית אלקטרונים טכניקות בתוך ימית תולעת-שפופרת

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...