وأيد هذا العمل من قبل منحة من برنامج GM096076 AREA NIH.

1. إعداد الذباب لتشريح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الذباب صحية من النمط الجيني المطلوب (على سبيل المثال، معربا عن بروتين GFP المسمى-) التي هي أقل من أسبوع واحد من العمر. حدد 10-15 الإناث بطون كبيرة مع كريم اللون مدورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الذباب المحددة وعدد قليل من الذكور (3-5) لقارورة تحتوي على المواد الغذائية الجديدة yeasted طفيفة والسماح للذباب لتسمين لمدة يومين في C. ° 25 الرجوع إلى ويل وآخرون .. 6 للاطلاع على تفاصيل إعداد ذبابة الفاكهة. تسمين الذباب يضمن مجموعة متنوعة من المراحل، مراحل خاصة 8-12، سوف تكون متاحة للتصوير. مسمن ضعيف أو unfattened الذباب عادة ما تحتوي على مراحل فقط في وقت مبكر جدا (1-6) وناضجة البويضات (المرحلة 14). </li></ol> 2. إعداد البويضات للتصوير باستخدام المجهر المركب منتصبة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد شريحة زجاجية المعيار لصق 2 coverslips إلى الشريحة، ما يقرب من 1 سم بعيدا، وذلك باستخدام السيليكون greasه. فقط استخدام الشحوم كافية لضمان ختم جيدة بين ساترة والشرائح. والضغط لأسفل بشدة على كل ساترة انتشار الشحوم رقيقة وبالتساوي. إضافة بعض النفط الهالوكربون 27 (سيغما) إلى المرحلة بين coverslips والشرائح. فإنها تكون بمثابة الفواصل لمنع إصابة البويضات المعزولة في الخطوات اللاحقة. رقم 1،5 coverslips تعمل بشكل جيد، مع سمك المتوسط ​​(0،16-0،18 مم) أن يطابق من البويضات مرحلة متأخرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان 2-3 قطرات من زيت الهالوكربون 27 على سطح ساترة 22 2 مم. للحصول على صحة البويضات ممكن، وتتم إزالة أنثى الفرد من الغذاء باستخدام القارورة pipetting الفم بلطف وأودعت في الهالوكربون النفط دون التخدير الأولى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط تشريح حادة (مثل دومون # 5)، دبوس الطاير ضد ساترة وسحب قبالة غيض من البطن. إزالة المبايض عن طريق سحبها على طول سطح ساترة، في إطار برنامج النفط. وسيعزز هذا الالتصاقةن من البويضات إلى ساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ندف بلطف بعيدا المبيضين، وتبحث عن البويضات التي هي على الأقل 10B مرحلة oogenesis. ويمكن تحديد البويضات في هذه المرحلة من خلال البحث عن البيض في الغرف التي تحتل البويضة على الأقل 50-60٪ من الحجم الكلي للغرفة البيض. في هذه المرحلة من oogenesis، أصبحت خلايا بصيلات تغمر البويضة عمودي، وتحيط البويضة من جميع الجهات باستثناء منطقة صغيرة حيث الاتصالات إلى خلايا ممرضة لا تزال قائمة. استخدام ملقط لإزالة البويضات الفردية من غمد ovariole. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المضي قدما، وذلك باستخدام الإناث 1-3، إلى أن يتم عزل البويضات غير التالفة 5-8 على ساترة. إزالة أي نوع من الأنسجة غير صالحة للاستعمال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عكس بعناية تحتوي على البويضات ساترة على الشريحة معدة سلفا بحيث يتم وضع البويضات بين الفواصل اثنين. لا تضغط لأسفل على ساترة مقلوب لأن ذلك سوف يضر البويضات. إذا لزم الأمر، إضافة كمية صغيرة من النفط الهالوكربون لريتم تعبئة انه حواف &quot;ساندويتش&quot; لضمان الفضاء. (اختياري: اسمحوا بقية الشرائح لعدة دقائق للسماح لتسوية من ساترة) الشريحة الآن جاهزة للتصوير. </li></ol> 3. إعداد البويضات للتصوير باستخدام المجهر المركب مقلوب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتشريح البويضات أساسا كما هو موضح في القسم 2، إلا أن أطباق بتري صغيرة مع كوب إدراج أسفل (ماتيك، 35 مم) وتستخدم بدلا من coverslips. ومن غير الضروري لتغطية العينة، وبعد تشريح، ولا يمكن تصوير الأنسجة مباشرة في أطباق، ولكن يجب توخي الحذر لضمان البويضات تبقى مغطاة بالنفط والتي لا يسمح لتجف. </li></ol> 4. يعيش التصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع بويضة في التركيز باستخدام DIC أو العكس المرحلة البصريات ودراسة البويضة عن أي علامات للتلف، مثل تسريب السيتوبلازم، أو انتفاخ الخلايا المسام. البويضات التي تظهر الصورة فقط صحية وغير التالفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Streaيمكن رصدها مينغ مباشرة دون الحاجة إلى وضع العلامات GFP، منذ الحويصلات صفار في السيتوبلازم هي autofluorescent 7. يمكن التقاط هذه الإشارات في النطاق FITC نطاق ولكن سوف يتطلب على الأرجح أعلى أرباح الإعدادات من تلك التي تستخدم لبروتينات GFP-المسمى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم الحصول على صور لافضل المتدفقة من أقسام البصرية التي هي أسفل سطح البويضة التي يستريح على الزجاج ساترة / بتري الزجاج. هنا قليلا بالارض البويضة، مما يجعل لأفضل طائرة من التركيز. يمكن التقاط الصور في 200X - 1،000 X. باستخدام ترتيب الموصوفة هنا، يجب استخدام الأهداف الجوية، منذ ساترة يشكل حاجزا بين البويضة وموضوعية. هذا هو الأمثل لأنه يقلل إلى حد كبير الانجراف وحركة العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة في المنطقة ذات الاهتمام هو في التركيز، إيقاف البصريات brighfield والتحول إلى التصوير مبائر. مسح سريع باستخدام / معاينة ظيفة البرنامج، وضبط التركيز واكتسابحسب الضرورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سوف الإعدادات لالتقاط تختلف من المجهر المجهر ل، ولكن المعلمات العام هي كما يلي: استخدام الطول الموجي الإثارة من 488 نانومتر ~ والطول الموجي 515 نانومتر انبعاث ~. انشاء Z-المحور التقاط بحيث Z-المحور لا تزال مستمرة، مع وجود فارق 10 ثانية من بين الإطارات. التقاط سلسلة من إطارات 5-10 اختبار لضمان بويضة غير ثابتة والطائرة من التركيز المناسب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وهناك تسلسل نموذجي الفاصل الزمني التقاط بين 20 - 50 لقطة، ويمكن استعراض فور الانتهاء من تقييم جودة الفيديو. ويمكن تكرار هذه العملية للخلايا الأخرى في الشريحة، أو يمكن تشريح الإناث إضافية حسب الحاجة. </li></ol> 5. استكشاف الأخطاء وإصلاحها والمشاكل الشائعة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الانجراف - عند استخدام المجهر تستقيم، وخلايا يمكن الانجراف في بعض الأحيان بسبب انتشار النفط. يمكن التقليل من ذلك عن طريق استخدام النفط ما يكفي فقط لتغطية المنطقة تحت ساترة. إذا استمرت المشكلة، استخدام كميات أقل من السيليكون زrease ليضعوا على الفواصل الشريحة. </li></ol> ملاحظة: بعض حزم البرمجيات مبائر يسمح لتتبع الخلايا، ولكن بشكل عام فإنه من الأفضل أن تتخلى عن التصوير من البويضات الانجراف وبدلا من ذلك استخدام آخر عينة. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لا توجد مؤشرات على تدفق - إذا يتدفقون ليس واضحا، فمن المرجح عائدا لأحد هذه الأسباب اثنين، إما الطائرة الاتصال لالتقاط الصور ليست صحيحة (عادة عميقة جدا في المناطق الداخلية من بويضة) أو معطوب البويضة. يمكن تقليل الوقت والممارسة على حد سواء أخطاء. </li></ol>

<ol>
	<li>Becalska, A. N., Gavis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lighting+up+mRNA+localization+in+Drosophila+oogenesis.">Lighting up mRNA localization in Drosophila oogenesis.</a> Dev. 136, 2493-2503 (2009).</li><li>He, L., Wang, X., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shining+light+on+Drosophila+oogenesis:+Live+imaging+of+egg+development.">Shining light on Drosophila oogenesis: Live imaging of egg development.</a> Curr. Opin. Gen. Dev. 21, 612-619 (2011).</li><li>King, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ovarian development Drosophila melanogaster. , (1970).</li><li>Spradling, A. C., Bate, M., Martinez-Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+genetics+of+oogenesis.">Developmental genetics of oogenesis.</a> The Development of Drosophila melanogaster. 1, 1-70 (1993).</li><li>Serbus, L. R., Cha, B. -. J., Theurkauf, W. E., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynein+and+the+actin+cytoskeleton+control+kinesin-driven+cytoplasmic+streaming+in+Drosophila+oocytes.">Dynein and the actin cytoskeleton control kinesin-driven cytoplasmic streaming in Drosophila oocytes.</a> Dev. 132, 3743-3752 (2005).</li><li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+Individual+Drosophila+Egg+Chambers+for+Live+Imaging.">Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging.</a> J. Vis. Exp. (60), e3679 (2012).</li><li>Theurkauf, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premature+microtubule-dependent+cytoplasmic+streaming+in+cappuccino+and+spire+mutant+oocytes.">Premature microtubule-dependent cytoplasmic streaming in cappuccino and spire mutant oocytes.</a> Science. 265, 2093-2096 (1998).</li><li>Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protein+trap+strategy+to+detect+GFP-tagged+proteins+expressed+from+their+endogenous+loci+in+Drosophila.">A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila.</a> PNAS. 98, 15050-15055 (2001).</li><li>R&#246;per, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rtnl1+is+enriched+in+a+specialized+germline+ER+that+associates+with+ribonucleoprotein+granule+components.">Rtnl1 is enriched in a specialized germline ER that associates with ribonucleoprotein granule components.</a> J. Cell Sci. 120, 1081-1092 (2007).</li><li>Pokrywka, N. J., Payne-Tobin, A., Raley-Susman, K. M., Swartzman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules,+the+ER+and+Exu:+New+associations+revealed+by+analysis+of+mini+spindles+mutations.">Microtubules, the ER and Exu: New associations revealed by analysis of mini spindles mutations.</a> Mech. Dev. 126, 289-300 (2009).</li><li>Petri, W. H., Mindrinos, M. N., Lombard, M. F., Margaritis, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+development+of+the+Drosophila+chorion.ih+a+chemically+defined+organ+culture+medium.">In vitro development of the Drosophila chorion.ih a chemically defined organ culture medium.</a> Wilhelm Roux's Arch., Devl. Biol. 186, 351-362 (1979).</li></ol>

ليس لدي ما تكشف.

ذبابة الفاكهة هي البويضات نظام نموذجي تنوعا لمعالجة مجموعة متنوعة من المسائل المتصلة الدالة وتنظيم الخلايا والمكونات التحت خلوية. A فهم كامل وظيفة البروتين يتطلب رصد كل الجوانب المكانية والزمانية للسلوك البروتين. التقدم في كل من نظم التصوير والأدوات الجينية المتاحة لDrosophilists تجعل من الممكن للمختبرات حتى الصغيرة لأداء عالية الجودة في التصوير التجارب البويضات المعيشة. هنا أتناول بروتوكول لتحليل سلوك البروتينات GFP الموسومة أو autofluorescent والهياكل خلال منتصف إلى أواخر oogenesis التي يمكن استخدامها جنبا إلى جنب مع مجموعة متنوعة من الخلفيات الوراثية للتحقيق وظيفة البروتين. في هذا البروتوكول أصف العملية التي يتم إعداد البويضات للتصوير والإعدادات الأساسية التي ستمكن مبائر الحصول على الفيديو الفاصل الزمني من البروتينات الفلورية والهياكل. التفصيل إضافيةويرد وصف ليرة سورية على إعداد البويضة بواسطة ويل وآخرون. 6 A مجموعة واسعة من سلالات ذبابة معربا عن البروتينات التي تم وسمها التطور الطبيعي عبر محاصرة-اكسون تتوفر 8، ويمكن تصميم المتغيرات البروتين أكثر بلا حدود ويعيد إلى الذباب. في العمل مع الأنسجة الحية، وصحة العينات له أهمية قصوى. يمكن البيض من غرف 10B مرحلة استكمال oogenesis بطريقة مستقلة أساسا 11، مما يجعلها مثالية للدراسات قصيرة الأجل التصوير. يجب توخي الحذر في الخطوات الرئيسية عدة للحصول على بيانات ذات جودة عالية. خلال تشريح أنه من المهم لمعالجة المبيضين البويضات وأقل قدر ممكن، والحد من مقدار الوقت بين تشريح والانتهاء من التصوير. من الناحية المثالية، ينبغي أن يكون موجودا محطة تشريح صغيرة في نفس الغرفة التي تضم نطاق مبائر، وينبغي تصوير فقط غرف البيض قليلة في كل مرة. عدد الموصى بها هنا (5-8) يضمن أن يتم تصغير الوقت تشريح مع تعظيم احتمال الحصول على صور ذات جودة جيدة. أوصي التقاط سلسلة من الصور قصيرة لتقييم جودة الصورة والتأكد من أن يتم تحسين إعدادات الالتقاط، قبل التقاط مرور وقت أطول تسلسل. معظم البرامج تسمح ليتم حفظها الإطارات الفردية، ويمكن بعد ذلك يتم تحليل هذه الصور في مجموعة متنوعة من الطرق باستخدام يماغيج 12 أو البرامج الأخرى.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> الهالوكربون النفط 27 </td><td> سيغما الدريخ </td><td> H8773-100ML </td><td></td></tr><tr><td> # 5SF الملقط </td><td> أدوات العلوم الجميلة </td><td> 11252-00 </td><td></td></tr><tr><td> السيليكون الشحوم </td><td> سيغما الدريتش </td><td> Z273554-1EA </td><td></td></tr><tr><td> الزجاج القاع أطباق بتري </td><td> ماتيك </td><td> P35G-0-20-C </td><td></td></tr></tbody></table>

live imaging of gfp-labeled proteins in drosophila oocytes

تم تأسيس بويضة ذبابة الفاكهة كنظام تنوعا للتحقيق في أسئلة أساسية مثل وظيفة هيكل الخلية، وتنظيم الخلية، وبناء عضية وظيفة. توافر مختلف البروتينات GFP الموسومة يعني أنه يمكن رصد العديد من العمليات الخلوية في الخلايا الحية على مدى دقائق أو ساعات، وباستخدام هذه التقنية، وقد وصفت عمليات مثل نقل RNP، التشكل الظهارية، وإعادة عرض الأنسجة بقدر كبير من التفصيل في ذبابة الفاكهة 1،2 البويضات. القدرة على أداء التصوير الفيديو جنبا إلى جنب مع ذخيرة غنية من المسوخ يسمح للفحص مجموعة متنوعة هائلة من الجينات والعمليات بالتفصيل لا يصدق. أحد الأمثلة على ذلك هو عملية تدفق ooplasmic، الذي يبدأ في منتصف oogenesis 3،4. هذه الحركة قوية من الحويصلات السيتوبلازمية هو أنيبيب و 5 كينيسين التي تعتمد على أنظمة ويوفر مفيدةتيم للتحقيق وظيفة الهيكل الخلوي في هذه المراحل. هنا أقدم على بروتوكول للتصوير الفاصل الزمني من البويضات الحية باستخدام تقريبا أي الإعداد المجهري متحد البؤر.

والتصوير من البروتينات التي تحمل علامات GFP تختلف تبعا لمدى قوة التعبير عن البروتين الموسومة. A البويضة منتصف مرحلة التعبير عن reticulon مثل 1 (Rtnl-1)، اكسون ذات الكلمات الدلالية مع GFP 8،9 تنتج إشارة قوية. Rtnl-1 يبدو أن شارك في تعريب مع ميكروتثبول طويلة حاضرا أثناء الجري ooplasmic 10 (الشكل 1A). Rtnl-1 هو علامة جيدة لمراقبة التدفق وأيضا مؤشرا على تنظيم أنيبيب في البويضات مرحلة متأخرة. تدفق Ooplasmic في غرفة البيض wildtype هو واضح وملحوظ من حركة الحويصلات صفار autofluorescent عند استخدام معدل القبض على إطار واحد كل 10 ثانية (1B الشكل). يمكن إنشاء الإسقاط أقصاها خمس إطارات للاحتفال طريق الحويصلات متحرك. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/50044/50044fig1.jpg" /> الشكل 1. يعيش كل من التصوير autoflوGFP الموسومة uorescent هياكل. A) A واحد الوقت الفاصل بين صورة بويضة 11 مرحلة التعبير عن GFP Rtnl1-400X في. Rtnl1-GFP الألياف تتحرك مع حركة متموجة في البويضات الدفق. B) كحد أقصى 5 الإطار إسقاط بيضة غرفة 10B المرحلة التي تم فيها تصوير للحويصلات autofluorescent صفار كل ثانية 10 لإجمالي ثانية 50، في التكبير 400X. شريط النطاق = 30 ميكرومتر

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes at JoVE.com

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

بروتوكول للتصوير حي للبروتينات GFP الموسومة أو هياكل autofluorescent في الفردية<em&gt; ذبابة الفاكهة</emيوصف&gt; البويضات.

يعيش التصوير من البروتينات التي تحمل علامات GFP في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; البويضات

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

live-imaging-of-gfp-labeled-proteins-in-drosophila-oocytes

Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

11.3K Views.  Vassar College. بروتوكول للتصوير حي للبروتينات GFP الموسومة أو هياكل autofluorescent في الفردية ذبابة الفاكهة البويضات.

Video: Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

يعيش التصوير للهجرة الخلايا الدبقية في القرص العين تخيلي ذبابة الفاكهة

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

لإعداد ذبابة الفاكهة الأجنة لايف التصوير باستخدام بروتوكول إسقاط الشنق

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

يعيش تصوير ذبابة الفاكهة السوداء البطن هجرات كرية دموية الجنينية

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. These systems offer a broad selection of fluorescent substrates optimized for a range of imaging instrumentation. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again. There are two steps to using this system: cloning and expression of the protein of interest as a SNAP-tag fusion, and labeling of the fusion with the SNAP-tag substrate of choice. The SNAP-tag is a small protein based on human O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), a DNA repair protein. SNAP-tag labels are dyes conjugated to guanine or chloropyrimidine leaving groups via a benzyl linker. In the labeling reaction, the substituted benzyl group of the substrate is covalently attached to the SNAP-tag. CLIP-tag is a modified version of SNAP-tag, engineered to react with benzylcytosine rather than benzylguanine derivatives. When used in conjunction with SNAP-tag, CLIP-tag enables the orthogonal and complementary labeling of two proteins simultaneously in the same cells.

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again.

الفلورسنت وصفها من COS - 7 تعرب عن البروتينات الانصهار SNAP - شعارا لتصوير الخلايا الحية

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

إعداد وتطوير الكبار ذبابة الفاكهة الأمخاخ والشبكية للتصوير لايف

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current techniques used to view such processes are somewhat limited. The following protocol describes a new technique for mounting fixed and labeled Drosophila embryos for coronal viewing with confocal imaging. This method consists of embedding embryos between two layers of glycerin jelly mounting media, and imaging jelly strips positioned upright. The first step for sandwiching the embryos is to make a thin bedding of glycerin jelly on a slide. Next, embryos are carefully aligned on this surface and covered with a second layer of jelly. After the second layer is solidified, strips of jelly are cut and flipped upright for imaging. Alternatives are described for visualizing the embryos depending upon the type of microscope stand to be used. Since all cells along the dorsal-ventral axis are imaged within a single confocal Z-plane, our method allows precise measurement and comparison of fluorescent signals without photobleaching or light scattering common to 3D reconstructions of longitudinally mounted embryos.

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Here we present a mounting protocol for stained Drosophila embryos in an upright position that allows imaging of cross-sections using Confocal microscopy.

تستقيم تصوير ذبابة الفاكهة الأجنة

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

التصوير تغيير الشكل في الخلية الحية ذبابة الفاكهة الأجنة

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, cell differentiation and organogenesis 1. Correct preparation of the experimental samples is a crucial, often neglected, step. The goal of preparation is to ensure physiological relevance and to establish optimal imaging conditions. To maintain tissue viability, it is critical to avoid dehydration, hypoxia, overheating or medium deterioration 2. 
 The Drosophila egg chamber is a well established system for examining questions relating, but not limited, to body patterning, mRNA localization and cytoskeletal organization 3,4. For early- and mid-stage egg chambers, mounting in halocarbon oil is good for survival in that it allows free diffusion of oxygen, prevents dehydration and hypoxia and has superb optical properties for microscopy. Imaging of fluorescent proteins is possible through the introduction of transgenes into the egg chamber or physical injection of labeled RNA, protein or antibodies 5-7. For example, addition of MS2 constructs to the genome of animals enables real time observation of mRNAs in the oocyte 8. These constructs allow for in vivo labeling of mRNA through utilization of the MS2 bacteriophage RNA stem loop interaction with its coat protein 9. 
 Here, we present a protocol for the extraction of ovaries as well as isolating individual ovarioles and egg chambers from the female Drosophila. For a detailed description of Drosophila oogenesis see Allan C. Spradling (1993, reprinted 2009) 10.

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

The Drosophila egg chamber is an excellent model for studying the mechanisms of mRNA localization. In order to capture the dynamic events that underpin the processes of localization, rapid high resolution imaging of live tissue is required. Here, we present a protocol for dissection and imaging of live samples with minimal disruption.

إعداد فردية ذبابة الفاكهة البيض غرف للتصوير لايف

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate mutations and chromosomal aberrations1. To prevent this trauma from catalyzing genomic instability, it is crucial for cells to detect DSBs, activate the DNA damage response (DDR), and repair the DNA. When stimulated, the DDR works to preserve genomic integrity by triggering cell cycle arrest to allow for repair to take place or force the cell to undergo apoptosis. The predominant mechanisms of DSB repair occur through nonhomologous end-joining (NHEJ) and homologous recombination repair (HRR) (reviewed in2). There are many proteins whose activities must be precisely orchestrated for the DDR to function properly. Herein, we describe a method for 2- and 3-dimensional (D) visualization of one of these proteins, 53BP1.
The p53-binding protein 1 (53BP1) localizes to areas of DSBs by binding to modified histones3,4, forming foci within 5-15 minutes5. The histone modifications and recruitment of 53BP1 and other DDR proteins to DSB sites are believed to facilitate the structural rearrangement of chromatin around areas of damage and contribute to DNA repair6. Beyond direct participation in repair, additional roles have been described for 53BP1 in the DDR, such as regulating an intra-S checkpoint, a G2/M checkpoint, and activating downstream DDR proteins7-9. Recently, it was discovered that 53BP1 does not form foci in response to DNA damage induced during mitosis, instead waiting for cells to enter G1 before localizing to the vicinity of DSBs6. DDR proteins such as 53BP1 have been found to associate with mitotic structures (such as kinetochores) during the progression through mitosis10.
In this protocol we describe the use of 2- and 3-D live cell imaging to visualize the formation of 53BP1 foci in response to the DNA damaging agent camptothecin (CPT), as well as 53BP1's behavior during mitosis. Camptothecin is a topoisomerase I inhibitor that primarily causes DSBs during DNA replication. To accomplish this, we used a previously described 53BP1-mCherry fluorescent fusion protein construct consisting of a 53BP1 protein domain able to bind DSBs11. In addition, we used a histone H2B-GFP fluorescent fusion protein construct able to monitor chromatin dynamics throughout the cell cycle but in particular during mitosis12. Live cell imaging in multiple dimensions is an excellent tool to deepen our understanding of the function of DDR proteins in eukaryotic cells.

This protocol describes a method for visualizing a DNA double-strand break signaling protein activated in response to DNA damage as well as its localization during mitosis.

عامين والتصوير الثلاثي الابعاد لايف خلية من البروتينات DNA الاستجابة الأضرار

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

يعيش التصوير من البروتينات التي تحمل علامات GFP في

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video