1. الخميرة الاستعدادات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل سلالات الخميرة مع بلازميد يحمل كاسيت GAL1-GFP-Y68L (UBC9 TS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو الخميرة في وسائل الإعلام التي تحتوي على رافينوز الاصطناعية 2٪ لمدة 24 ساعة وتضعف إلى 2٪ سكر اللبن التي تحتوي على وسائل الإعلام لمدة 16 ساعة أو O / N. احتضان خلايا في C ° 30 بينما تهز في 200 دورة في الدقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في صباح اليوم التالي، يخفف من الضغط على الاستعلام OD 600 = 0.2. يهز لمدة 4-6 ساعة في 30 ° C (200 دورة في الدقيقة) حتى يصل ثقافة OD 600 = 0،8-1،0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لقمع التعبير (وذلك لمراقبة فقط تجمع بالفعل ترجمتها ومطوية من GFP Ubc9-TS)، وسائل الإعلام إلى وسائل الإعلام التغيير الاصطناعية تستكمل مع الجلوكوز 2٪ (SD) 30 دقيقة قبل التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العلاج - الصدمة الحرارية الخلايا لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية للحث على misfolding، أو مستمر في الحاضنة المجهر لمتابعة تجميع البروتين في ظروف حرارة الصدمة. ملاحظة - إذا كنت تستخدم المجهر في أي درجة الحرارة فوق RT، قبل الحرارة FOص حوالي 2 ساعة لتتوازن درجة الحرارة على طول الجسم من المجهر وأهداف (انظر أدناه). </li></ol> 2. لوحة \ الاستعدادات الشرائح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار لوحة مناسبة. الاعتبار الرئيسي هو القدرة على الحفاظ على التركيز خلال اقتناء التصوير. النقاط التالية هي الحاسمة للتصوير 4D وليس لهفوات وقت 2D أو 3D التصوير. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متعددة الآبار لوحة أسفل الآبار مختلفة قد لا تكون متجانسة (أي الآبار ستكون على ارتفاعات مختلفة بالنسبة إلى الهدف). وهذا سيجعل من الصعب الحفاظ على التركيز عبر نقاط س ص ونقطة الوقت، بغض النظر عن كونه يستخدم هذه التقنية autofocusing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المواد الشريحة: الزجاج البلاستيك مقابل. الشرائح الزجاجية القاع أكثر Z-متجانسة بين الآبار، ولكنها أكثر تكلفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سمك أسفل لوحة: نحن عادة استخدام لوحات ساترة القاع مؤشر 1.5، ولكن مؤشر 1 هو أيضا مقبولة اعتمادا على الهدف. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> COVإيه السفلي من لوحة \ الشريحة مع كونا (0.25 ملغ / مل) لمدة 10 دقيقة. يستخدم كونا للانضمام إلى الشريحة الخلايا، والتي تمكن بعد خلية واحدة مع مرور الوقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة كونا واحتضان شريحة في غطاء محرك السيارة الكيميائية بحيث تتبخر كونا الزائدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة من 200 ميكرولتر عينة الخميرة (OD 600 = 0.5) في ConAed أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 15 دقيقة، وذلك لتمكن خلايا التمسك سطح اللوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخراج المتوسط، ويغسل ثلاث مرات مع الوسيلة الجديدة للحصول على طبقة واحدة من الخلايا. ملاحظة: إذا تم التخطيط لمرور وقت طويل، وبذور الخلايا قليلة بحيث براعم الجديدة لن تملأ ويقطع المنطقة من الاهتمام. </li></ol> 3. المجهر الاستعدادات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نستخدم المجهر متحد البؤر A1Rsi نيكون مع التعديلات غير القياسية قليلة. للتصوير الخميرة نستخدم ما يصل إلى 4 أجهزة الليزر (405 نانومتر و 50 ميغاواط الليزر CUBE؛ 457-514 نانومتر، 65 ميغاواط ليزر الأرجون ايون؛ 561 نانومتر، و 50 ميغاواط ليزر الياقوت؛ و 640 نانومتر، و 40 ميغاواط الليزر CUBE)، وتصل إلى 4 فرق إدارة المشاريع PMT مجهزةالمرشحات. ويتم تصوير معظم لدينا مع مجموعة الاخضر لتصفية EGFP ومجموعة الأحمر لمرشح mCherry وtdTomato. مع GFP وmCherry هناك تقريبا أي bleedthrough، لذلك نحن غالبا ما تستخدم المسح في وقت واحد. ومع ذلك، يمكن أيضا خط المسح أن تستخدم لمنع bleedthrough عندما يحدث. كما تم تزويد لدينا مبائر مع مرحلة بيزو PInano (MCL)، التي يمكن أن تجعل 3 خطوات ميللي ثانية في Z، مما 2-3 Z-المداخن (30-50 أقسام) في الثانية الواحدة. نظم أيضا جهاز كشف الطيفي، التركيز الكمال (ليزر الأوفست)، واثنين من الماسحات الضوئية - ماسح ضوئي GALVANO وماسح ضوئي الرنانة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار الهدف المناسب. الرئيسية الاعتبارات: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المياه / نفط / الهواء الهدف: الاعتبار الرئيسي هو معامل انكسار الوسط التصوير مباراة وسيلة من العينة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المزايا النفط الهدف: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن أن أهداف النفط أعلى فتحات العددية (النفط الخفيف أكثر من فواصل المياه، وبالتالي المزيد من الفوتونات العودة إلى الهدف). يمكن أن يكون ما يصل الأهداف النفطلNA 1.49، مقابل 1.27 للمياه. (ومع ذلك، هذه ليست في الواقع تغيير كبير في القرار). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معامل انكسار زيت مباريات معامل انكسار الزجاج، ولذلك لا يتم فقدان الفوتونات الانتقال من العينة، من خلال الزجاج، في منطقة الهدف. (ملاحظة - اختار للنفط الغمر الذي يحتوي على معامل الانكسار الذي يتناسب مع الهدف الخاص بك وساترة الخاص بك). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> النفط تمكن خالية من المتاعب طويلة زمنيا الهفوات لأنه لا تتبخر. </li></ol> عيوب النفط الهدف: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ارتفاع القرار مكنت من أعلى NA الأهداف النفط يتحلل بسرعة إذا كان مصباح يضطر إلى السفر من خلال وسط مائي (مثل خلية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صور وعادة ما يكون أكثر الانحرافات كروية و &quot;ممدودة&quot; تأثير في 3D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> النفط هو لزجة، فوضوي، وخطرا على الأهداف. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزايا المياه الهدف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخلية نفسها مائي، لذلك هناك عدد أقل من التشوهات في Z، وهوالقرار الثاني لا تزال عميقة عالية في عينة مائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف وسهلة الاستعمال. عيوب الهدف المياه: يتبخر بسرعة، لذلك لا تصلح لأفلام طويلة دون ترتيبات خاصة تجري على ضخ المياه باستمرار في تحقيق الهدف. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزايا الهدف الهواء: 1. يتم فقدان أية مواد / يتبخر خلال اكتساب نقطة أو متعددة فيلم طويل. 2. تنظيف وسهلة الاستعمال. العيب: دقة منخفضة وانخفاض حساسية الإشارة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الغرفة ودرجة حرارة الحاضنة: درجة الحرارة المتغيرة تؤثر خصائص المسألة، ونظم في الدقيقة يغير التركيز. ينبغي تعديل درجة الحرارة قبل اختيار نقاط لاقتناء. سوف تغير درجة الحرارة خلال اقتناء تعطيل التصوير، وسوف يؤدي إلى فقدان التركيز. تركنا نظامنا المجهر لمدة 2 ساعة تتوازن في درجة الحرارة المطلوبة قبل التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الياقات تصحيح: في العديد من الأهداف يأتي مع عصابة التصحيح تمكينإلى تعديل الهدف لسمك الغطاء زلة معينة. نوصي بتعديل طوق التصحيح أثناء استخدام الخرز الفلورسنت لتصور وظيفة انتشار نقطة. وهذا يضمن الإعدادات الصحيحة لكل عينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أصحاب عينة مستقرة: نجد أن معظم أصحاب عينة متاحة تجاريا هي أضعف جزء في المجهر. فهي في كثير من الأحيان ومباشرة متهاد لا. هذا هو كارثة على الدقة العالية، متعدد نقطة 4D التصوير. نحن لدينا تصميم أصحاب عينة الخاصة التي هي على التوالي، وتناسب محكم على خشبة المسرح. يمكن أيضا أن تكون انسحب أسفل عند الحاجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متعدد نقطة الشراء: تم تجهيز نظامنا التصوير مع نيكون &quot;الكمال التركيز&quot; النظام، الذي هو في الأساس الليزر القائمة على آلية التركيز التلقائي. ومع ذلك، ليس من الضروري autofocusing بالضرورة مع التصوير 4D، خاصة إذا كان النظام لا ينجرف الكثير. </li></ol></li></ol> 4. التصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل النظام: ليزر، المرحلة، تحكم، وكاميرا وكمبيوثالثا البرمجيات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة مكان على حامل المرحلة، واستقرت المضمون بشكل صحيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام المنفذ العين لتحديد الموقع والتوجه من الخميرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام brightfield، وتقييم الجدوى الصحية الخلية وفقا لشكل والملمس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على ضوء epifluorescent وفقا لfluorophore ذات الصلة (على سبيل المثال تصفية FITC GFP)، والتركيز على عرض الخلايا النمط الظاهري الذي يخضع للبحث الخاص بك. قد الخلايا التي هي نيون للغاية في أكثر من طول موجي واحد قد مات وبالتالي autofluorescent. نحن تصور النواة مع fluorophore tdTomato تنصهر إلى إشارة NLS SV40 (NLS-TFP). TFP هو ضعف حجم GFP، وبالتالي فهو فوق الحد نشر النواة، وبالتالي فإنه يعمل بشكل جيد جدا كعلامة النووية. يمكننا أيضا تثير TFP مع ليزر (488 نانومتر) في وقت واحد والأخضر GFP، ولكن جمع انبعاثات الأخضر والأحمر إلى قسمين منفصلة للفرق إدارة المشاريع PMT القرار الطيفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط الإعدادات التالية للحد من الضوضاءوoversaturation: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الليزر السلطة - ينبغي النظر photobleaching والضيائية مقابل سطوع الصورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كسب: حساسية الكاميرا يؤثر، بالتالي إشارة إلى نسبة الضوضاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ينبغي تعديل وفقا ليزر مع طول موجة أقصر - ثقب الدبوس القطر. قطر الثقب يحدد سمك (ارتفاع) من قسم تصوير الضوئي. وبالتالي، فإن فتح ثقب الدبوس جمع مزيد من الضوء (الفوتونات في السماح لمزيد من)، ولكن القرار سوف تنخفض في Z (أقل confocality). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نصائح مفيدة: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا fluorophores مختلفة الطول الموجي تنبعث منها متطابقة، استخدام ميزة الكاشف الطيفي الذي يمكن اختيار مرشحات الظاهري. نضع في اعتبارنا أن أجهزة الكشف عن الطيفية هي أقل حساسية من فرق إدارة المشاريع PMT العادية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا نحن متحمسون fluorophores مختلفة من الليزر نفسه، استخدام ميزة المسح الضوئي الخط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> والماسحة الضوئية تمكن أكثر حساسية GALVANO، ولكن لديها أعلى خطر للphotobleaching. A الماسح الضوئي الرنين تمكن أسرعcquisition، وبالتالي خفض خطر الإصابة photobleaching، ولكن أقل حساسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في المتوسط ​​بين 2 و 16 صور، لأنه يعزز إشارة إلى نسبة الضوضاء، ولكن يجعل اقتناء أبطأ، وبطبيعة الحال، ينطوي على مزيد من التعرض للعينة إلى الليزر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مدة على عملية الاستحواذ يعتمد على مسألة البيولوجية (مثل JUNQ وتشكيل IPOD يأخذ ~ 2 ساعة). وقد التقط نحن الخميرة مع الماسح الضوئي الرنانة لمدة تصل إلى 30 ساعة في الوقت الفاصل بين 3D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> والفاصل الزمني فترات الصغر فترات عمل فيلم أكثر تماسكا ولكن قد يسبب تبييض الصورة، وبالتالي فقدان الإشارة. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Gershenson, A., Gierasch, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+folding+in+the+cell:+challenges+and+progress.">Protein folding in the cell: challenges and progress.</a> Current opinion in structural biology. 21, 32-41 (2011).</li><li>Aguzzi, A., Calella, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prions:+protein+aggregation+and+infectious+diseases.">Prions: protein aggregation and infectious diseases.</a> Physiological reviews. 89, 1105-1152 (2009).</li><li>Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteotoxic+stress+and+inducible+chaperone+networks+in+neurodegenerative+disease+and+aging.">Proteotoxic stress and inducible chaperone networks in neurodegenerative disease and aging.</a> Genes &amp; development. 22, 1427-14 (2008).</li><li>Cohen, E., Dillin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+insulin+paradox:+aging,+proteotoxicity+and+neurodegeneration.">The insulin paradox: aging, proteotoxicity and neurodegeneration.</a> Nature reviews. Neuroscience. , (2008).</li><li>Hershko, A., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+system.">The ubiquitin system.</a> Annual review of biochemistry. 67, (1998).</li><li>Tyedmers, J., Mogk, A., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+strategies+for+controlling+protein+aggregation.+Nature+reviews.">Cellular strategies for controlling protein aggregation. Nature reviews.</a> Molecular cell biology. 11, 777-788 (2010).</li><li>Treusch, S., Cyr, D. M., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+deposits:+Protection+against+toxic+protein+species?.">Amyloid deposits: Protection against toxic protein species?.</a> Cell cycle (Georgetown, Tex.). 8, 1668-1674 (2009).</li><li>Spokoini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confinement+to+Organelle-Associated+Inclusion+Structures+Mediates+Asymmetric+Inheritance+of+Aggregated+Protein+in+Budding+Yeast.">Confinement to Organelle-Associated Inclusion Structures Mediates Asymmetric Inheritance of Aggregated Protein in Budding Yeast.</a> Cell Rep. , (2012).</li><li>Weisberg, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+of+superoxide+dismutase+1+(SOD1G93A)+aggregates+determines+their+toxicity.">Compartmentalization of superoxide dismutase 1 (SOD1G93A) aggregates determines their toxicity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 15811-15816 (2012).</li><li>Kaganovich, D., Kopito, R., Frydman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Misfolded+proteins+partition+between+two+distinct+quality+control+compartments.">Misfolded proteins partition between two distinct quality control compartments.</a> Nature. 454, 1088 (2008).</li><li>Betting, J., Seufert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast+Ubc9+mutant+protein+with+temperature-sensitive+in+vivo+function+is+subject+to+conditional+proteolysis+by+a+ubiquitin-+and+proteasome-dependent+pathway.">A yeast Ubc9 mutant protein with temperature-sensitive in vivo function is subject to conditional proteolysis by a ubiquitin- and proteasome-dependent pathway.</a> The Journal of biological chemistry. 271, 25790 (1996).</li><li>Tongaonkar, P., Beck, K., Shinde, U. P., Madura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+temperature-sensitive+mutant+of+a+ubiquitin-conjugating+enzyme+and+its+use+as+a+heat-inducible+degradation+signal.">Characterization of a temperature-sensitive mutant of a ubiquitin-conjugating enzyme and its use as a heat-inducible degradation signal.</a> Analytical biochemistry. 272, 263 (1999).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

حدسنا عن العمليات البيوكيميائية مستمدة من التجارب مقاعد البدلاء في الأعلى الذي يسمح حلا جيدا مختلطة من المواد المتفاعلة والمنتجات للوصول إلى التوازن في كوب. في مثل هذا الوضع، يمكن التعبير عن تركيز على الأنواع الكيميائية على النحو الوارد رقم واحد، الذي هو نسبة كمية من جزيئات المولي إلى وحدة تخزين العيانية. معظم ما نعرفه عن بنية البروتين وظيفة تستمد من استخدام الأساليب التي تعكس الكلاسيكية، صور رد الفعل الأكبر: البقع الغربية، centrifugations، وقياسات طيفية التي أجريت على مقتطفات من الخليط السكان كاملة من الخلايا. وبما أن التكنولوجيا التي نستخدمها للنظر في الخلايا تحت التكبير يحسن على قدم وساق، يصبح أكثر وضوحا من أي وقت مضى أن الظروف التي معظم ردود الفعل البيوكيميائية في الجسم الحي تحدث فقط تحمل أدنى تشابه لتلك السيناريو مقاعد البدلاء الأعلى الكلاسيكية. ليس فقط هو الجزء الداخلي من سللا المزدحمة بالسكان والبيئة، والآثار التي الزحام تغيير جوهري في أنشطة مختلف المواد المتفاعلة، كما أنها على العكس تماما من مختلط أيضا. وهذا يفسر التفاوت متكررة بين في المختبر والمجراة في الكفاءة من مجموعة واسعة من ردود الفعل الجزيئات المعقدة. في اي مكان الحدس النابعة من التجارب الكلاسيكية في المختبر الكيمياء الحيوية أكثر عرضة للتضليل كما في المسائل المتعلقة لطي في الجسم الحي، misfolding، وتجميع البروتينات. في حين أن دراسات الكيمياء البروتين في التفاعلات السائبة يمكن أن علاج قضية قابلة للطي لبروتين معين كما بنعم أو لا سؤال، يجب أن أي محاولة لتتبع ديناميات السكان كاملة من الجزيئات في خلية حية حساسة للتوزيع كاملة من الممكن نتائج بتكوين المتاحة لسلسلة ببتيد، وعلى وجه الخصوص لخطر misfolding والتجميع. على سبيل المثال، فإننا قد فحص لاي الخلية الأكبرأشبع من البروتين تجميع من غرب النشاف، وتحديد أن البروتين معظمها غير قابل للذوبان وubiquitinated لا. ومع ذلك، في الخلية الحية وشبه المنفصلة السكان من البروتين، يصعب اكتشافها عندما بلغ متوسطها أكثر من العديد من الخلايا، قد تكون قابلة للذوبان وubiquitinated في مقصورة خاصة حيث تركز المحلية من الأنواع عالية جدا. قد يكون له عواقب السيناريو الأخير أكثر أهمية من أجل بقاء الخلية أكبر من معظم شبه السكان. وعلاوة على ذلك، في حين أن المحرمين عرض مجموعة متنوعة من السلوكيات عديد المظاهر وظائف في المختبر، أصبح واضحا أن في الخلية والمكان والزمان تقتصر مهامهم منفصلة. في النموذج الناشئ حديثا لفهم الكيمياء الحيوية، وتركيز يصبح خاصية متغير كل محددة النانو البيئة في الخلية، ويجب أن يعاير الأحداث الجزيئية التي تكمن وراء العمليات البيولوجية ليس فقط في الوقت المناسب، ولكن أيضا في SPACه. النهج التصوير 4D المقدمة هنا يمكن النمذجة الحساسة من misfolding البروتين في الخلايا الحية، على الرغم من أنها يمكن أن تستخدم لدراسة أي عدد من العمليات البيولوجية الأخرى وكيف يتم تنظيمها في الفضاء، والوقت، وبعد التغييرات في الظروف البيئية. في هذه الورقة نستخدم الاستشعار TS Ubc9 للطي، والذي يدل على فعالية المراحل والخيارات للتعامل مع بداية تجميع البروتين في العصارة الخلوية. بالإضافة إلى توضيح بيولوجيا الخلية لمراقبة الجودة التجميع، يمكن هذا النهج بمثابة أداة قوية لفك رموز تأثير الاضطرابات محددة أو الطفرات الوراثية على proteostasis (على سبيل المثال يمكن أن تستخدم لقياس Ubc9 TS الإجهاد طي البروتين استجابة للأكسدة، التعبير عن الكلي السامة، أو طفرات نوعية في مسار التحكم). 4D التصوير ضروري أيضا لتحديد بدقة الترجمة البروتين أو البروتين colocalization بين اثنين من مختلفق، وللكشف عن الظواهر التي ربما تكون عابرة ولكنها مهمة. على سبيل المثال، وخاصة في الحي كروية صغيرة مثل الخميرة، فإنه قد يبدو أن القضية التي بنية أو الكلي لديه التعريب juxtanuclear، في حين 4D التصوير قد تكشف عن أن هذا هو مجرد قطعة أثرية من زاوية التفتيش. في التجربة سبيل المثال نقدم هنا، ونحن لشرح استخدام نموذج تتجمع البروتين، Ubc9 TS، لمتابعة التجميع مراقبة الجودة عبر الزمان والمكان في العصارة الخلوية. في درجة حرارة الإباحية، يتم طي Ubc9 TS والموزعة في النواة والعصارة الخلوية. على الحرارة التي يسببها misfolding، وأنها تشكل في البداية بسرعة نشرها الإجهاد الكلي الصغيرة بؤر التي تتم معالجتها عن تدهور proteasomal. عندما يتم جزئيا proteasome إعاقة، يتم تحويل هذه البؤر إلى الإجهاد JUNQ والادراج IPOD على مدى حوالي 2 ساعة. إذا اليوبيكويتين بوساطة تدهور غير متوفرة كخيار مراقبة الجودة، UBوعلى الفور C9 TS تغيير مسارها إلى إدراج IPOD لتجميع واقية. هذه الأدوات تتيح فرصا لا تصدق لاكتشاف العوامل الوراثية رواية المشاركة في مراقبة الجودة التجميع، واستكشاف تنظيمها المكاني والزماني في الخلية.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MG132</td>
			<td>Mercury</td>
			<td>mbs474790</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>con A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom plates</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>ibd81158</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>4D Fluorescence Imaging of Protein Aggregation 
			Confocal 3D movies were acquired using a Nikon A1R-si microscope equipped with a PInano Piezo stage (MCL), using a 60X water objective NA 1.27, 0.3 micron slices, 0.5% laser power (from 65 mW 488 laser and 50 mW 561 laser). z-stacks were acquired every 5 min for 90 min. Each z-series was acquired with 0.5 micron step size and 30 total steps. Image processing was performed using NIS-Elements software.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

4d imaging of protein aggregation in live cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

<html><img alt="الشكل 1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50083/50083fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50083/50083fig1.jpg" /> الشكل 1. نموذج: التقسيم الفرعي الخلوية للبروتينات تتجمع الجودة آلات التحكم يوجه البروتينات تتجمع في حجرات مختلفة مع وظائف مختلفة: البروتينات القابلة للذوبان، التي تستهدف تدهور، والخضوع بولي ubiquitination ويتم إرسالها إلى xta-N جو المقصورة Q uclear تحكم uality (JUNQ ). يتم إرسال البروتينات غير قابلة للذوبان التي لا يمكن عزل لحماية ubiquitinated إلى I nsoluble العلاقات العامة eposit D otein (IPOD)، المتاخمة للفجوة، حيث أنها تخضع التجميع بالموقع. es.jpg &quot;SRC =&quot; / files/ftp_upload/50083/50083fig2.jpg &quot;/&gt; الشكل 2. النمذجة misfolding البروتين GFP-Ubc9 مع TS. في ظل الظروف العادية، يتم طي أصلا GFP-TS Ubc9 (أخضر)، ويتم ترجمة منتشرة في العصارة الخلوية للنواة و. هو المسمى النواة من TFP-NLS (الحمراء). وأغلق التعبير عن TS Ubc9 قبالة عن طريق إضافة السكر 2٪ قبل التصوير في جميع التجارب. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50083/50083fig2large.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية</a> . <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على درجة حرارة التحول إلى 37 ° C وتتجمع، GFP-TS Ubc9 (الأخضر)، وتشكل بؤر التوتر عصاري خلوي. هو المسمى النواة من TFP-NLS (الحمراء). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد شفائهم من الصدمة الحرارية في C ° 23، denaturated حراريا GFP-TS Ubc9 هو المتدهورة، كما يتضح من مستوى مضان انخفضت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على درجة حرارة التحول الى 37 وتثبيط C ° مع proteasome 80 مم MG132، GFP-U<html> وتتجمع bc9 TS ومعالجتها في JUNQ والادراج IPOD. هو المسمى النواة من TFP-NLS (الحمراء). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على التحول إلى درجة حرارة 37 ° C وتثبيط ubiquitination، TS-GFP Ubc9 وتتجمع ومعالجتها في إدراج IPOD. هو المسمى النواة من TFP-NLS (الحمراء). هى overexpressed في البروتياز اليوبيكويتين 4 (Ubp4) لمنع Ubc9 ubiquitination TS. </li></ol><img alt="الشكل 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50083/50083fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50083/50083fig3.jpg" /> الشكل 3. الفاصل الزمني من JUNQ وتشكيل IPOD. عند درجة حرارة التحول إلى 37 ° C وتثبيط proteasome مع 80 مم MG132، تتم معالجة الإجهاد GFP-TS Ubc9 بؤر إلى JUNQ والادراج IPOD. هو المسمى النواة من TFP-NLS (الحمراء). صور تم الحصول عليها 3D على فترات دقيقة 4. (انظر أيضا الفيلم 1).com/files/ftp_upload/50083/50083fig3large.jpg &quot;الهدف =&quot; _blank &quot;&gt; اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر الرقم.

Watch this Scientific Journal Video about 4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells at JoVE.com

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

الجدوى الخلوية تعتمد على إدارة الوقت المناسب والفعال للmisfolding البروتين. نحن هنا وصف طريقة لتصور مصائر مختلفة المحتملة للبروتين تتجمع: طوي ثانية، وتدهور، أو عزل في الادراج. نحن لشرح استخدام جهاز استشعار للطي، Ubc9<sup&gt; TS</sup&gt;، لرصد وتجميع proteostasis مراقبة الجودة في الخلايا الحية باستخدام المجهر 4D.

4D التصوير التجميع البروتين في الخلايا الحية

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

4d-imaging-of-protein-aggregation-in-live-cells

Research

JoVE Journal

Biology

17.2K Views.  Hebrew University of Jerusalem. الجدوى الخلوية تعتمد على إدارة الوقت المناسب والفعال للmisfolding البروتين. نحن هنا وصف طريقة لتصور مصائر مختلفة المحتملة للبروتين تتجمع: طوي ثانية، وتدهور، أو عزل في الادراج. نحن لشرح استخدام جهاز استشعار للطي، Ubc9 TS، لرصد وتجميع proteostasis مراقبة الجودة في ال?...

Video: 4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

تعيش خلية التصوير والتحليل الكمي من الخلايا الظهارية في الجنينية القيطم المورق</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

التصوير البروتين البروتين التفاعلات في الجسم الحي</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

يعيش التصوير من تخليص الخلية أفكارك أثناء<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; مرحلة التطور الجنيني

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

التحقيق البروتين البروتين التفاعلات في الخلايا الحية باستخدام الرنين ضوء بارد نقل الطاقة

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of hyperphosphorylated tau protein in the form of neurofibrillary tangles (NFTs). The density of NFT correlates well with cognitive impairment and other neurodegenerative symptoms, thus prompting the endeavor of developing tau aggregation-based therapeutics. Thus far, however, tau aggregation assays use recombinant or synthetic tau that is devoid of the pathology-related phosphorylation marks. Here we describe two assays using recombinant, hyperphosphorylated tau as the subject. These assays can be scaled up for high-throughput screens for compounds that can modulate the kinetics or stability of hyperphosphorylated tau aggregates. Novel therapeutics for Alzheimer's disease and other tauopathies can potentially be discovered using hyperphosphorylated tau isoforms.

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

Unmodified and hyperphosphorylated tau proteins were used in two in vitro aggregation assays to reveal the hyperphosphorylation-dependent fast aggregation kinetics. These assays pave the way for future screens for compounds that can modulate the propensity of hyperphosphorylated tau to form fibrils that underlie the progression of Alzheimer&#8217;s disease.

في المختبر تجميع فحوصات عن طريق Hyperphosphorylated تاو البروتين

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

واجهة المستخدم الرسومية لتتبع بمساعدة برنامج تركيز البروتين في النتوءات الخلوية الديناميكية

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These age-associated disorders are characterized by the appearance of protein aggregates with fibrillary structure in the brains of these patients. Exactly why normally soluble proteins undergo an aggregation process remains poorly understood. The discovery that protein aggregation is not limited to disease processes and instead part of the normal aging process enables the study of the molecular and cellular mechanisms that regulate protein aggregation, without using ectopically expressed human disease-associated proteins. Here we describe methodologies to examine inherent protein aggregation in Caenorhabditis elegans through complementary approaches. First, we examine how to grow large numbers of age-synchronized C. elegans to obtain aged animals and we present the biochemical procedures to isolate highly-insoluble-large aggregates. In combination with a targeted genetic knockdown, it is possible to dissect the role of a gene of interest in promoting or preventing age-dependent protein aggregation by using either a comprehensive analysis with quantitative mass spectrometry or a candidate-based analysis with antibodies. These findings are then confirmed by in vivo analysis with transgenic animals expressing fluorescent-tagged aggregation-prone proteins. These methods should help clarify why certain proteins are prone to aggregate with age and ultimately how to keep these proteins fully functional.

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

The goal of the method presented here is to explore protein aggregation during normal aging in the model organism C. elegans. The protocol represents a powerful tool to study the highly insoluble large aggregates that form with age and to determine how changes in proteostasis impact protein aggregation.

أساليب "دراسة التغيرات" في "تجميع البروتين الأصيل" مع التقدم في السن في ايليجانس كاينورهابديتيس

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Confocal Microscopy Reveals Cell Surface Receptor Aggregation Through Image Correlation Spectroscopy

Confocal microscopy provides an accessible methodology to capture sub-cellular interactions critical for the characterization and further development of pre-clinical agents labeled with fluorescent probes. With recent advancements in antibody based cytotoxic drug delivery systems, understanding the alterations induced by these agents within the realm of receptor aggregation and internalization is of critical importance. This protocol leverages the well-established methodology of fluorescent immunocytochemistry and the open source FIJI distribution of ImageJ, with its inbuilt autocorrelation and image mathematical functions, to perform spatial image correlation spectroscopy (ICS). This protocol quantitates the fluorescent intensity of labeled receptors as a function of the beam area of the confocal microscope. This provides a quantitative measure of the state of target molecule aggregation on the cell surface. This methodology is focused on the characterization of static cells with potential to expand into temporal investigations of receptor aggregation. This protocol presents an accessible methodology to provide quantification of clustering events occurring at the cell surface, utilizing well established techniques and non-specialized imaging apparatus.

Antibodies that bind to target receptors on the cell surface can confer conformation and clustering alterations. These dynamic changes have implications for characterizing drug development in target cells. This protocol utilizes confocal microscopy and image correlation spectroscopy through ImageJ/FIJI to quantify the extent of receptor clustering on the cell surface.

[كنفوكل] مجهرية يكشف خلية مستقبلات سطح التجميع عن طريق التحليل الطيفي ارتباط الصورة

Confocal microscopy provides an accessible methodology to capture sub-cellular interactions critical for the characterization and further development of ...

4D Microscopy of Yeast

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments in yeast are dynamic, and a full understanding of their properties requires time-lapse imaging. Multi-color 4D confocal fluorescence microscopy is a powerful method for tracking the behavior and composition of an intracellular compartment on a time scale of 5-15 min. Rigorous analysis of compartment dynamics requires the capture of thousands of optical sections. To achieve this aim, photobleaching and phototoxicity are minimized by scanning rapidly at very low laser power, and the pixel dimensions and Z-step intervals are set to the largest values that are compatible with sampling the image at full resolution. The resulting 4D data sets are noisy but can be smoothed by deconvolution. Even with high quality data, the analysis phase is challenging because intracellular structures are often numerous, heterogeneous, and mobile. To meet this need, custom ImageJ plugins were written to array 4D data on a computer screen, identify structures of interest, edit the data to isolate individual structures, quantify the fluorescence time courses, and make movies of the projected Z-stacks. 4D movies are particularly useful for distinguishing stable compartments from transient compartments that turn over by maturation. Such movies can also be used to characterize events such as compartment fusion, and to test the effects of specific mutations or other perturbations.

This protocol describes the analysis of fluorescently labeled intracellular compartments in budding yeast using multi-color 4D (time-lapse 3D) confocal microscopy. The imaging parameters are chosen to capture adequate signals while limiting photodamage. Custom ImageJ plugins allow labeled structures to be tracked and quantitatively analyzed.

4D مجهرية الخميرة

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments ...

FLIM-FRET Measurements of Protein-Protein Interactions in Live Bacteria.

Protein-protein interactions (PPIs) control various key processes in cells. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) combined with F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) provide accurate information about PPIs in live cells. FLIM-FRET relies on measuring the fluorescence lifetime decay of a FRET donor at each pixel of the FLIM image, providing quantitative and accurate information about PPIs and their spatial cellular organizations. We propose here a detailed protocol for FLIM-FRET measurements that we applied to monitor PPIs in live Pseudomonas aeruginosa in the particular case of two interacting proteins expressed with highly different copy numbers to demonstrate the quality and robustness of the technique at revealing critical features of PPIs. This protocol describes in detail all the necessary steps for PPI characterization - starting from bacterial mutant constructions up to the final analysis using recently developed tools providing advanced visualization possibilities for a straightforward interpretation of complex FLIM-FRET data.

We describe here a protocol to characterize protein-protein interactions between two highly-differently expressed proteins in live Pseudomonas aeruginosa using FLIM-FRET measurements. The protocol includes bacteria strain constructions, bacteria immobilization, imaging and post-imaging data analysis routines.

قياسات FLIM-FRET للتفاعلات البروتينية البروتينية في البكتيريا الحية.

Protein-protein interactions (PPIs) control various key processes in cells. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) combined with F&#246;rster ...