يتم توفير التمويل اللازم لعملنا من قبل المعاهد الوطنية للصحة ، ومارس من الدايمات ، والجمعية الأميركية للسرطان.

<ol>
	<li>Kroll, K. L., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+Xenopus+embryos+from+sperm+nuclear+transplantations+reveal+FGF+signaling+requirements+during+gastrulation.">Transgenic Xenopus embryos from sperm nuclear transplantations reveal FGF signaling requirements during gastrulation.</a> Development. 122, 3173-3183 (1996).</li><li>Amaya, E., Kroll, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+generating+transgenic+frog+embryos.">A method for generating transgenic frog embryos.</a> Methods Mol Biol. 97, 393-414 (1999).</li><li>Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+extracts.">Cell cycle extracts.</a> Methods Cell Biol. 36, 581-605 (1991).</li><li>Hartley, K. O., Hardcastle, Z., Friday, R. V., Amaya, E., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+Xenopus+embryos+reveal+that+anterior+neural+development+requires+continued+suppression+of+BMP+signaling+after+gastrulation.">Transgenic Xenopus embryos reveal that anterior neural development requires continued suppression of BMP signaling after gastrulation.</a> Developmental Biology. 238, 168-184 (2001).</li><li>Karaulanov, E., Kn&#246;chel, W., Niehrs, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+BMP4+synexpression+in+transgenic+Xenopus.">Transcriptional regulation of BMP4 synexpression in transgenic Xenopus.</a> EMBO J. 23, 844-856 (2004).</li><li>Ogino, H., Fisher, M., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergence+of+a+head-field+selector+Otx2+and+Notch+signaling:+a+mechanism+for+lens+specification.">Convergence of a head-field selector Otx2 and Notch signaling: a mechanism for lens specification.</a> Development. 135, 249-2458 (2008).</li><li>Taylor, J. J., Wang, T., Kroll, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tcf-+and+Vent-binding+sites+regulate+neural-specific+geminin+expression+in+the+gastrula+embryo.">Tcf- and Vent-binding sites regulate neural-specific geminin expression in the gastrula embryo.</a> Developmental Biology. 289, 494-506 (2006).</li><li>Marsh-Armstrong, N., Huang, H., Berry, D. L., Brown, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ-line+transmission+of+transgenes+in+Xenopus+laevis.">Germ-line transmission of transgenes in Xenopus laevis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 14389-14393 (1999).</li><li>Offield, M. F., Hirsch, N., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+Xenopus+tropicalis+transgenic+lines+and+their+use+in+studying+lens+developmental+timing+in+living+embryos.">The development of Xenopus tropicalis transgenic lines and their use in studying lens developmental timing in living embryos.</a> Development. 127, 1789-1797 (2000).</li></ol>

وقد أجريت تجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعتها لرعاية الحيوان واستخدام اللجنة في جامعة واشنطن في كلية الطب.

ليتم اختبارها كل بناء المعدلة وراثيا ، ونحن عموما زرع النوى في 500-1000 البيض ، وفي هذا النطاق ، ونحن يمكن أن تولد الأجنة وراثيا التعبير عن ما يصل الى 10 بنيات مختلفة في اليوم الواحد ، اعتمادا على كيفية العديد من الإناث التي يسببها لوضع البيض. هذه زرع حوالي ثلث يلتصق البيض ?...

A. إعداد الحيوانات المنوية النوى الكواشف : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1X MMR (2mm وCaCl 2 ، HEPES 5mm ، و pH7.5 ، 2mm وبوكل ، 1MM MgCl 2 ، كلوريد الصوديوم 100mM). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.1 ٪ Tricaine Methanesulfonate (MS222 ، إيثيل استر حمض أمينوبنزويك ، سيغما A - 5040) ، 0.1 ٪ بيكربونات الصوديوم. تذوب في الماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2X زبدة التحضير النووية (NPB). في اليوم من إعداد نواة الحيوان المنوي ، يشكلون ما نسبته 30 مل من NPB 2X من aliquots للحلول تخزين الأوراق المالية المجمدة : 500 ملي السكروز (1.5 M الأسهم) ، و 30 HEPES ملم (1M الأسهم ؛ عاير مع KOH بحيث الرقم الهيدروجيني 7.7 هو في 15 ملم) ، 1 trihydrochloride سبيرمدين ملم (سيغما S - 2501 ، و 10 سهم ملم) ، 0.4 tetrahydrochloride السبيرمين ملم (سيغما S - 1141 ، و 10 سهم ملم) ، 2 مم dithiothreitol (سيغما D - 0632 و 100 سهم ملم) ، 2 مم EDTA (500 ملي EDTA ، ودرجة الحموضة 8.0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام 2XNPB لجعل أ 1X 30ml NPB ، B. 10ML 1XNPB +3 ٪ BSA (V كسر ، سيغما A - 7906) ، ج. 5ml 1XNPB BSA +0.3 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lysolecithin : 100 ميكرولتر من 10 ملغ / مل - L - α - lyso الليسيثين ، صفار البيض (Calbiochem ، 440154) ؛ تذوب في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام. تخزين صلبة الأسهم عند 20 درجة مئوية. تجاهل مسحوق الأوراق المالية إذا أصبح لزجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ألبومين المصل البقري (BSA) : 10 ٪ (W / V) BSA (V كسر ، سيغما A - 7906) يشكلون 5 مل في الماء في اليوم من إعداد نواة الحيوان المنوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين الحيوانات المنوية العازلة (1ml) 1X NPB ، الجلسرين 30 ٪ ، 0.3 ٪ BSA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحيوانات المنوية تخفيف العازلة : 250 السكروز مم ، 75 مم بوكل ، 0.5 trihydrochloride سبيرمدين مم ، 0.2 tetrahydrochloride السبيرمين ملم. يعاير إلى الرقم الهيدروجيني 7،3-7،5 وتخزين 0،5-1 aliquots مل عند 20 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هويشت رقم 33342 (سيغما B - 2261) : 10 ملغ / مل الأسهم في DH 2 O ، وتخزينها في ضوء ضيق سفينة عند 20 درجة مئوية. </li></ol> المعدات : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتأرجح الدوار دلو وأجهزة الطرد المركزي </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> القماش الجبني </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أدوات تشريح (مقص وملقط) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مضان المجهر </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قمع </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قفازات </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عدادة الكريات </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإبر (26 مقياس) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ورقة المناشف </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أطباق بتري (60 ملم) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصات </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البلاستيك (5 و 10 مل) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipetman نصائح (1 مل و200μl) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> محاقن (1 مل) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب (14 مل ؛ فالكون 2059) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> microcentrifuge (1.5 مل) </li></ul> باء إعداد مستخلصات سرعة عالية الكواشف : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1X مارك والتعديل رينغر (MMR) : 100 مم كلوريد الصوديوم ، 2 مم بوكل ، 1 ملم MgCl 2 ، 2 مم CaCl 2 ، 5 ملي HEPES ، ودرجة الحموضة 7.5. إعداد المخزون 10X ، وضبط درجة الحموضة مع هيدروكسيد الصوديوم إلى 7.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20X العازلة استخراج (الميزانية) الأسهم الملح : 2 م بوكل ، 20 ملي MgCl 2 ، 2 مم CaCl 2 ، فلتر تعقيم وتخزينها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخراج العازلة (الخارجة ؛ الطازجة وتخزينها على الجليد) : 1X الأملاح الخارجة ، 50 ملي السكروز ، HEPES 10MM (1 M الأسهم ، مع معاير KOH بحيث الرقم الهيدروجيني هو 7.7 عندما تضعف إلى 15 مم ؛ فلتر تعقيم ، وتخزينها في aliquots عند 20 درجة مئوية). تعد حوالي 100 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتكون في 1X الأملاح الخارجة قبل الاستخدام ومعاير لدرجة الحموضة 7.8 مع هيدروكسيد الصوديوم : 2 ٪ (W / V) L - 1 - سيستين هيدروكلوريد هيدرات. تعد حوالي 300 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CSF - الخارجة : 1X الأملاح الخارجة ، 1 ملم MgCl 2 (بالإضافة إلى MgCl 2 موجودة في الأملاح الخارجة ؛ التركيز النهائي 2 مم) ، HEPES 10 مم ، ودرجة الحموضة 7.7 ، 50 السكروز ملم ، 5 ملم EGTA ، ودرجة الحموضة 7.7. تجهيز 50 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مثبطات الأنزيم البروتيني : خليط من leupeptin ، chymostatin وpepstatin ، كل حل لتركيز النهائي من 10 ملغ / مل في سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO). في مخزن صغير في aliquots 20 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 م 2 CaCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج الطاقة : 150 ملي فوسفات الكرياتين ، 20 ملي ATP ، 20 ملي MgCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فرس حامل المصل موجهة الغدد التناسلية (PMSG) : 100 U / مل PMSG (PG600 ® ، إنترفيت ، شركة ، 021825). تذوب في المياه وتخزينها على 20 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإنسان gonadotropin المشيمي (HCG) : 1000 U / مل HCG (CHORULON ® ، إنترفيت ، شركة ، 057176). تذوب في المياه وتخزينها في 4 درجة مئوية. </li></ol> المعدات : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> القيطم المورق الإناث </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإبر (18 و قياس 26) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة باستير </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتحمل واسعة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> محاقن (1 مل) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مواسير microcentrifuge (0.5 مل) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب البولي جدار سميك (بيكمان ، 349622) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مواسير ultraclear (14 × 95 مم ؛ بيكمان ، 344060) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نابذة فائقة السرعة والدوارات (على سبيل المثال ، بيكمان TL - 100 مع تي الدوارات 40 SW وTLA 100.3) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأكواب لجمع البيض </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الدلاء أو حاويات لعقد الضفادع الإناث (على سبيل المثال ، 4 - L الأكواب البلاستيكية مع أغطية عيون). </li></ul> جيم النووية الزرع. الكواشف : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2.5 ٪ في agarose 0.1XMMR (لصنع أطباق الحقن) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2.5 ٪ سيستين في 1XMMR، pH8.0 ، الذي أعد في اليوم للاستخدام </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ficoll </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 ملغ / مل الجنتاميسين (الأسهم 1000X) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ارتفاع سرعة استخراج البيض (انظر أعلاه) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100 MgCl 2 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10X MMR (انظر أعلاه) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انزيم التقييد (مثل NOTI من نيو انغلاند Biolabs) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحيوانات المنوية تخفيف العازلة (SDB ، انظر أعلاه) ، ونواة الحيوان المنوي (انظر أعلاه) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإنسان gonadotropin المشيمي (HCG) على النحو الوارد أعلاه </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الزيوت المعدنية (سيغما ، M8410) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خطي البلازميد أن قدم مثل التحوير : إعداد خطي البلازميد بتركيز حوالي 100 نانوغرام / ميكرولتر في العقيمة ، nuclease خالية من المياه (تريس ونتجنب EDTA تحتوي على مخازن ، والتي هي سامة إلى حد ما إلى الأجنة). الانزيم تقييد استخدامها ليصبح خطي على البلازميد ليس من الضروري أن يكون هو نفسه واحد المستخدمة في نقل ردود الفعل النووية. نستخدم عادة NOTI لجميع ردود الفعل ، بغض النظر عن ما هو خطي مع البلازميد. بعض معايرة الإنزيم المستخدم في تخفيف رد فعل قد يكون من الضروري ، كما يمكن للانزيم يسبب الكثير من الآثار السلبية على التنمية في مرحلة ما بعد المعيدة. يمكن تنقية البلازميد في عدة طرق مختلفة : نحن عادة استخدام تنقية Qiagen PCR Qiaquick عدة وفقا لتوجيهات مصنعين ؛ تنقية فرقة واحدة من مادة هلامية ليست ضرورية. إذا تتم تنقيته البلازميد باستخدام الفينول / كلوروفورم الاستخراج وهطول الأمطار الإيثانول ، تكون معينة لإزالة جميع آثار المواد العضوية والايثانول. </li></ol> المعدات : أطباق Agarose للحقن : في طبق بتري البلاستيك 60 ملم ، وإرساء 35mmX35mm صغيرة تزن قارب على المنصهر agarose 2.5 ٪ في 0.1XMMR المياه لإنشاء الاكتئاب مع القاع agarose المغلفة لملء مع البيض. مرة واحدة agarose وشددت ، في التفاف parafilm وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. جعل الأطباق 2-3 مقدما عن كل ردود الفعل المعدلة وراثيا كنت تخطط للقيام به. مضخة التسريب : نحن نستخدم مضخة حقن حقنة واحدة من جهاز هارفارد ، ومجهزة حقنة سم 3 / إبرة مليئة الزيوت المعدنية (سيغما M - 8410). كليلة رأس إبرة حقنة (لمنعها من ثقب الأنبوب) وإرفاق أنابيب tygon الغرامة. تشغيل المضخة في 10nl/sec ~ ، وهذا يفترض أن الوقت الإبرة في كل واحدة منها لن يكون هناك أكثر من 1 ثانية. وينبغي تشغيل المضخة قبل لعدة دقائق قبل انطلاق لtransgenesis اليوم لأؤكد أن المكبس لتدفق الحقنة مع مكبس وهذا التدفق المطرد إيجابية من النفط من الأنبوب يحدث. الإبر لنقل المواد النووية. باستخدام مجتذب micropipette ، وتوليد الإبر مع نصائح وطويلة المنحدرة. هذه القصاصة مع forcep تحت المجهر تشريح مجهزة ميكرومتر العين للحصول على 80 ميكرون ~ فتح مع شكل مشطوف. معدات أخرى : القيطم المورق الإناث ، stereomicroscope ، حاضنة ، micromanipulator ، microinjection مجتذب الإبرة (على سبيل المثال النموذجي P - 87 ، سوتر) ، والإبر محقنة (26 مقياس) ، والإبر microinjection الزجاج ، والعين لقطة ميكرومتر معايرة من النصائح إبرة microinjection 80μm إلى قطرها ، أطباق بتري ، وزن الزوارق 35mm ، Tygon أنابيب (ID = 1 / 32 بوصة ، OD = 3 / 32 بوصة)

production of transgenic xenopus laevis by restriction enzyme mediated integration and nuclear transplantation

التكامل مستقرة من المنتجات الجينات المستنسخة في جينوم القيطم هو ضروري للتحكم في الزمان والمكان والتعبير ، والتعبير عن الجينات في مراحل لاحقة من التطور الجنيني ، وتحديد مدى القدرة على تنظيم والمروجين التعبير الجيني داخل الجنين. ويمكن استخدام بروتوكول تظاهر هنا لتنتج بكفاءة الأجنة وراثيا القيطم المورق. هذا النهج ينطوي على transgenesis ثلاثة أجزاء : 1. يتم عزل الحيوانات المنوية من نوى عاشرا الكبار خصية المورق عن طريق العلاج مع lysolecithin التي permeabilizes غشاء البلازما المنوية. 2. مستعدة استخراج البيض بواسطة الطرد المركزي بسرعة منخفضة ، إضافة إلى الكالسيوم يؤدي إلى التقدم إلى استخراج الطور البيني من دورة الخلية ، والطرد المركزي بسرعة عالية لعزل الطور البيني العصارة الخلوية. 3. يتم الجمع بين النواة واستخراج الحمض النووي مع البلازميد الخطي لتكون كما قدم التحوير وكمية صغيرة من انزيم التقييد : زرع النووية. خلال رد فعل قصير ، استخراج البيض decondenses جزئيا لونين الحيوانات المنوية وانزيم يكسر قيود يولد الكروموسومات التي تشجع على إعادة التركيب من التحوير في جينوم. ثم يتم زرع نواة الحيوان المنوي في علاج بويضة غير مخصبة. التكامل بين التحوير وعادة ما يحدث قبل الانقسام والجنينية الأولى من نوعها أن الأجنة الناتجة ليست خيالية. ويمكن تحليل هذه الأجنة دون أي حاجة لتربية للجيل القادم ، والسماح لجيل فعال وسريع من الأجنة وراثيا للتحليلات المروج وظيفة الجين. عاشرا الكبار المورق الناتجة عن هذا الإجراء نشر أيضا عن طريق التحوير germline ويمكن استخدامها لتوليد حيوانات معدلة وراثيا خطوط لأغراض متعددة.

Watch this Scientific Journal Video about Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation at JoVE.com

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

هذا البروتوكول الفيديو يوضح طريقة لتوليد المعدلة وراثيا<em&gt; القيطم المورق</em&gt; عن طريق إدخال الجينات المحورة إلى نواة الحيوان المنوي تليها النووية الى زرع بويضة غير مخصبة.

إنتاج المعدلة وراثيا القيطم المورق عن طريق تقييد أنزيم التكامل وساطة وزرع النووية

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

production-transgenic-xenopus-laevis-restriction-enzyme-mediated

Research

JoVE Journal

Biology

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

11.8K Views.  University of Manchester. هذا البروتوكول الفيديو يوضح طريقة لتوليد المعدلة وراثيا القيطم المورق عن طريق إدخال الجينات المحورة إلى نواة الحيوان المنوي تليها النووية الى زرع بويضة غير مخصبة.

Video: Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

البلاستيك وتضمينها Sectioning الجنين المورق القيطم

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

الحصول على البيض من الإناث المورق القيطم

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

إعداد والتقطير من البيض مقتطفات القيطم المورق

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microinjection من البويضات المورق القيطم

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

تحديد الأنسجة باستخدام زرع رسملة الحيوان (ACT) في الفحص القيطم المورق</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

تعيش خلية التصوير والتحليل الكمي من الخلايا الظهارية في الجنينية القيطم المورق</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

زرع الوجه في<em&gt; القيطم المورق</em&gt; الأجنة

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of neurulation, migrates extensively towards various organs, and differentiates into many types of derivatives (neurons, glia, cartilage and bone, pigmented and endocrine cells). In this protocol, we describe how to dissect the premigratory cranial NC from Xenopus laevis embryos, in order to study NC development in vivo and in vitro. The frog model offers many advantages to study early development; abundant batches are available, embryos develop rapidly, in vivo gain and loss of function strategies allow manipulation of gene expression prior to NC dissection in donor and/or host embryos. The NC explants can be plated on fibronectin and used for in vitro studies. They can be cultured for several days in a serum-free defined medium. We also describe how to graft NC explants back into host embryos for studying NC migration and differentiation in vivo.

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

This protocol describes how to dissect premigratory cranial neural crest (NC) from Xenopus laevis neurulas. These explants can be plated on fibronectin and cultured in vitro, or grafted back into host embryos. This technique allows studying the mechanisms of NC epithelium-to-mesenchyme transition, migration, and differentiation.

تشريح<em&gt; القيطم المورق</em&gt; العصبية كريست ل<em&gt; في المختبر</em&gt; يزدرع الثقافة أو<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; زرع

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The initiation step, which involves the assembly of the ribosomal subunits at the mRNA initiation codon, involved initiation factor including eIF4G1. Defects in this rate limiting step of translation are linked to diverse disorders. To study the potential consequences of such deregulations, Xenopus laevis oocytes constitute an attractive model with high degrees of conservation of essential cellular and molecular mechanisms with human. In addition, during meiotic maturation, oocytes are transcriptionally repressed and all necessary proteins are translated from preexisting, maternally derived mRNAs. This inexpensive model enables exogenous mRNA to become perfectly integrated with an effective translation. Here is described a protocol for assessing translation with a factor of interest (here eIF4G1) using stored maternal mRNA that are the first to be polyadenylated and translated during oocyte maturation as a physiological readout. At first, mRNA synthetized by in vitro transcription of plasmids of interest (here eIF4G1) are injected in oocytes and kinetics of oocyte maturation by Germinal Vesicle Breakdown detection is determined. The studied maternal mRNA target is the serine/threonine-protein-kinase mos. Its polyadenylation and its subsequent translation are investigated together with the expression and phosphorylation of proteins of the mos signaling cascade involved in oocyte maturation. Variations of the current protocol to put forward translational defects are also proposed to emphasize its general applicability. In light of emerging evidence that aberrant protein synthesis may be involved in the pathogenesis of neurological disorders, such a model provides the opportunity to easily assess this impairment and identify new targets.

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

القيطم المورق نموذجا لتحديد الترجمة انخفاض قيمة

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...

A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation

A fundamental question in cell biology is how cell and organelle sizes are regulated. It has long been recognized that the size of the nucleus generally scales with the size of the cell, notably during embryogenesis when dramatic reductions in both cell and nuclear sizes occur. Mechanisms of nuclear size regulation are largely unknown and may be relevant to cancer where altered nuclear size is a key diagnostic and prognostic parameter. In vivo approaches to identifying nuclear size regulators are complicated by the essential and complex nature of nuclear function. The in vitro approach described here to study nuclear size control takes advantage of the normal reductions in nuclear size that occur during Xenopus laevis development. First, nuclei are assembled in X. laevis egg extract. Then, these nuclei are isolated and resuspended in cytoplasm from late stage embryos. After a 30 - 90 min incubation period, nuclear surface area decreases by 20 - 60%, providing a useful assay to identify cytoplasmic components present in late stage embryos that contribute to developmental nuclear size scaling. A major advantage of this approach is the relative facility with which the egg and embryo extracts can be biochemically manipulated, allowing for the identification of novel proteins and activities that regulate nuclear size. As with any in vitro approach, validation of results in an in vivo system is important, and microinjection of X. laevis embryos is particularly appropriate for these studies.

A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation

Mechanisms of cellular and intra-cellular scaling remain elusive. The use of Xenopus embryo extracts has become increasingly common to elucidate mechanisms of organelle size regulation. This method describes embryo extract preparation and a novel nuclear scaling assay through which mechanisms of nuclear size regulation can be identified.

فحص خلية مجاني عن طريق<em&gt; القيطم المورق</em&gt; الأجنة مقتطفات لدراسة آليات الحجم رقابة النووية

A fundamental question in cell biology is how cell and organelle sizes are regulated. It has long been recognized that the size of the nucleus generally ...