Финансирование для нашей работы обеспечивается NIH, март Dimes, и американского Общества рака.

<ol>
	<li>Kroll, K. L., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+Xenopus+embryos+from+sperm+nuclear+transplantations+reveal+FGF+signaling+requirements+during+gastrulation.">Transgenic Xenopus embryos from sperm nuclear transplantations reveal FGF signaling requirements during gastrulation.</a> Development. 122, 3173-3183 (1996).</li><li>Amaya, E., Kroll, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+generating+transgenic+frog+embryos.">A method for generating transgenic frog embryos.</a> Methods Mol Biol. 97, 393-414 (1999).</li><li>Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+extracts.">Cell cycle extracts.</a> Methods Cell Biol. 36, 581-605 (1991).</li><li>Hartley, K. O., Hardcastle, Z., Friday, R. V., Amaya, E., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+Xenopus+embryos+reveal+that+anterior+neural+development+requires+continued+suppression+of+BMP+signaling+after+gastrulation.">Transgenic Xenopus embryos reveal that anterior neural development requires continued suppression of BMP signaling after gastrulation.</a> Developmental Biology. 238, 168-184 (2001).</li><li>Karaulanov, E., Kn&#246;chel, W., Niehrs, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+BMP4+synexpression+in+transgenic+Xenopus.">Transcriptional regulation of BMP4 synexpression in transgenic Xenopus.</a> EMBO J. 23, 844-856 (2004).</li><li>Ogino, H., Fisher, M., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergence+of+a+head-field+selector+Otx2+and+Notch+signaling:+a+mechanism+for+lens+specification.">Convergence of a head-field selector Otx2 and Notch signaling: a mechanism for lens specification.</a> Development. 135, 249-2458 (2008).</li><li>Taylor, J. J., Wang, T., Kroll, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tcf-+and+Vent-binding+sites+regulate+neural-specific+geminin+expression+in+the+gastrula+embryo.">Tcf- and Vent-binding sites regulate neural-specific geminin expression in the gastrula embryo.</a> Developmental Biology. 289, 494-506 (2006).</li><li>Marsh-Armstrong, N., Huang, H., Berry, D. L., Brown, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ-line+transmission+of+transgenes+in+Xenopus+laevis.">Germ-line transmission of transgenes in Xenopus laevis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 14389-14393 (1999).</li><li>Offield, M. F., Hirsch, N., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+Xenopus+tropicalis+transgenic+lines+and+their+use+in+studying+lens+developmental+timing+in+living+embryos.">The development of Xenopus tropicalis transgenic lines and their use in studying lens developmental timing in living embryos.</a> Development. 127, 1789-1797 (2000).</li></ol>

Эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами, установленными уходу за животными и использование комитета в Вашингтонском университете в Школе медицины.

Для каждого трансгенного построить для тестирования, мы, как правило пересадки ядер в 500-1000 яиц, в этом масштабе, мы можем создать трансгенных эмбрионов выражении до 10 различных конструкций в сутки, в зависимости от того, сколько женщин индуцированные чтобы отложить яйца. Из этих трансп?...

А. спермы ядер подготовки Реагенты: <ol><li> 1X MMR (2 мМ CaCl 2, 5 мМ HEPES, pH7.5, 2 мМ KCl, 1 мМ MgCl 2, 100 мм NaCl). </li><li> 0,1% Tricaine метансульфонат (MS222, аминобензойной кислоты этиловый эфир, Sigma-5040), 0,1% бикарбоната натрия. Растворите в воде. </li><li> 2X ядерной Масло Подготовка (НПБ). В день подготовки ядер сперматозоидов, составляют 30 мл 2 раза НПБ от аликвоты растворы хранят в замороженном виде: 500 мМ сахарозы (1,5 м запасов), 30 мМ HEPES (1M состава; титруйте КОН так, чтобы рН 7,7 находится на 15 мм), 1 мМ спермидина тригидрохлорид (Sigma S-2501, 10 мМ акций), 0,4 мМ спермина tetrahydrochloride (Sigma S-1141, 10 мМ акций), 2 мМ дитиотреитол (Sigma D-0632, 100 мМ акций), 2 мМ ЭДТА (500 мМ ЭДТА, рН 8,0). </li><li> Используйте 2XNPB сделать a. 30мл 1X НПБ, b. 10мл 1XNPB +3% BSA (фракция V, Sigma-7906), c. 5 мл 1XNPB 0,3% BSA. </li><li> Лизолецитина: 100 мкл 10 мг / мл L-α-lyso-лецитин, яичный желток (Calbiochem, 440154); растворяются при комнатной температуре непосредственно перед употреблением. Магазин солидный запас при 20 ° C. Отменить фондовой порошок, если он становится липким. </li><li> Бычий сывороточный альбумин (BSA): 10% (м / о) BSA (фракция V, Sigma-7906) Макияж 5 мл воды в день подготовки ядер сперматозоидов. </li><li> Сперма хранения буфера (1 мл) 1X НПБ, 30% глицерина, 0,3% BSA. </li><li> Сперма разбавления буфера: 250 мМ сахарозы, 75 мМ KCl, 0,5 мМ спермидина тригидрохлорид, 0,2 мМ спермина tetrahydrochloride. Титровать до рН 7.3-7.5 и хранить 0,5-1 мл аликвот при 20 ° C. </li><li> Hoechst номер 33342 (Sigma B-2261): 10 мг / мл акций дН 2 O, магазин в светонепроницаемый сосуд при 20 ° C. </li></ol> Оборудование: <ul><li> Размахивая ротора ведро и центрифуга </li><li> марля </li><li> рассечение инструментов (щипцы и ножницы) </li><li> флуоресцентный микроскоп </li><li> воронка </li><li> перчатки </li><li> гемоцитометра </li><li> иглы (26 калибра) </li><li> бумажные полотенца </li><li> чашки Петри (60 мм) </li><li> пипетки </li><li> пластиковые (5 и 10 мл) </li><li> Pipetman советы (1 мл и 200 мкл) </li><li> Шприцы (1 мл) </li><li> Трубы (14 мл; Falcon, 2059) </li><li> труб </li><li> микроцентрифужных (1,5 мл) </li></ul> В. Подготовка Высокая скорость извлечения Реагенты: <ol><li> 1X Марка изменения Ringer (MMR): 100 мМ NaCl, 2 мМ KCl, 1 мМ MgCl 2, 2 мМ CaCl 2, 5 мМ HEPES, рН 7,5. Подготовка 10X акции и корректировать рН с NaOH до 7,5. </li><li> Извлечение 20X буфер (ВБ) соль складе: 2 M KCl, 20 мМ MgCl 2, 2 мМ CaCl 2, фильтр-стерилизовать и хранить при 4 ° C. </li><li> Извлечение буферов (ВБ; свежеприготовленной и хранится на льду): 1X XB соли, 50 мМ сахарозы, 10 мМ HEPES (1 М акции, титруемая с КОН, чтобы рН 7,7 при разведении до 15 мм; фильтр-стерилизовать и хранить в аликвот при 20 ° С). Подготовка около 100 мл. </li><li> 2% (м / о) L-цистеин гидрохлорида 1-гидрат: Сделано в 1X XB соли перед употреблением и титруют до рН 7,8 с помощью NaOH. Подготовка около 300 мл. </li><li> CSF-XB: 1X XB соли, 1 мМ MgCl 2 (в дополнение к MgCl 2 присутствует в XB соли; конечной концентрации 2 мМ), 10 мМ HEPES, рН 7,7, 50 мМ сахарозы, 5 мМ EGTA, рН 7,7. Подготовка 50 мл. </li><li> Ингибиторы протеазы: Смесь leupeptin, химостатина и пепстатина, каждый растворенный в конечной концентрации 10 мг / мл в диметилсульфоксид (ДМСО). Хранить в небольшой порции при 20 ° C. </li><li> 1 М CaCl 2. </li><li> Структура энергобаланса: 150 мМ креатинфосфата, 20 мМ АТФ, 20 мМ MgCl 2. </li><li> Беременные Маре Сыворотка гонадотропин (PMSG): 100 Ед / мл PMSG (PG600 ®, Интервет, Inc, 021 825). Растворите в воде и хранить при температуре 20 ° C. </li><li> Хорионического гонадотропина человека (ХГЧ): 1000 ед / мл ХГЧ (CHORULON ®, Интервет, Inc, 057 176). Растворите в воде и хранили при 4 ° C. </li></ol> Оборудование: <ul><li> Xenopus laevis женщин </li><li> Игл (18 и 26 калибра) </li><li> Пипетки Пастера </li><li> широкое отверстие </li><li> Шприцы (1 мл) </li><li> Трубы, микроцентрифужных (0,5 мл) </li><li> Трубы, толстые поликарбоната (Beckman, 349622) </li><li> Трубы, ultraclear (14 х 95 мм; Бекман, 344060) </li><li> Ультрацентрифуге и роторов (например, Beckman TL-100 с роторами SW 40 Ti и TLA-100,3) </li><li> Стаканы для сбора яиц </li><li> Ведра и контейнеры для хранения женский лягушек (например, 4-L пластиковых стаканах с сеткой крышками). </li></ul> С. ядерной трансплантации. Реагенты: <ol><li> 2,5% агарозы в 0.1XMMR (для приготовления инъекций блюда) </li><li> 2,5% цистеина в 1XMMR, PH8.0, подготовленный на день использования </li><li> Ficoll </li><li> 10 мг / мл гентамицина (1000X акций) </li><li> высокая скорость извлечения яйца (см. выше) </li><li> 100 MgCl 2 </li><li> 10X MMR (см. выше) </li><li> Ограничение фермента (например, NotI из Новой Англии Биолабс) </li><li> Сперма буфером для разведения (SDB, см. выше) и спермы ядер (см. выше) </li><li> Человеческий хорионический гонадотропин (ХГЧ), что и выше </li><li> минерального масла (Sigma, M8410) </li><li> Линеаризованные плазмиды быть введен в качестве трансгенов: Подготовка линеаризованной плазмиды в концентрации примерно 100 нг / мкл в стерильные, нуклеазы без воды (мы избегаем Трис и ЭДТА-содержащие буферов, которые несколько токсичны для эмбрионов). Рестрикции используется для линеаризации плазмиды не должен быть тем же, что используется в ядерной реакции передачи. Мы обычно используем NotI для всех реакций, независимо от того, плазмиды линеаризуется с. Некоторые калибровки фермента разбавления используемого в реакции могут оказаться необходимыми, так как слишком много фермента может оказывать вредное воздействие на пост-гаструлы развития. Плазмиды могут быть очищены различными способами: мы обычно используем Qiagen Qiaquick ПЦР очистки комплект в соответствии с производителями направлениях; очистку одной полосы из геля не требуется. Если плазмиды очищают, используя фенол / хлороформ экстракции и осаждения этанолом, убедитесь, чтобы удалить все следы органики и этанола. </li></ol> Оборудование: Агарозном блюда для инъекций: В 60 мм пластиковые чашки Петри, лежал небольшой 35mmX35mm вес лодки на расплавленный 2,5% агарозы в 0.1XMMR воды, чтобы создать депрессии с агарозном покрытием дна для заполнения с яйцами. После агарозном затвердеет, заверните в парафильмом и хранить при температуре 4 ° С до использования. Сделать 2-3 блюда заранее для каждого трансгенного реакции вы планируете делать. Инфузионных насосов: Мы используем один насос вливания шприцем из аппарата Гарварде, оснащен 3 шприца куб.см / иглы заполнена минеральным маслом (Sigma M-8410). Блант кончике иглы шприца (чтобы сохранить его от перфорации трубы) и приложите тонкой трубки Tygon. Запустите насос при ~ 10nl/sec; это предполагает, что время игла находится в каждое яйцо будет не больше, чем за 1 сек. Насос должен быть предварительно поработать несколько минут до начала трансгенез за день, чтобы убедиться, что поршень шприца на одном уровне с поршнем и что устойчивый положительный поток нефти из трубы происходит. Иглы для ядерных передач. Использование съемника микропипетки, генерировать с длинными иглами, покатая советы. Клип с этими forcep при вскрытии микроскоп с окулярного микрометра для получения ~ 80 микрон открытия с скошенной формы. Другое оборудование: Xenopus laevis женщин, стереомикроскоп, инкубатор, микроманипулятора, микроинъекции иглы съемник (например, модель P-87, Sutter), шприц иглы (26 калибра), иглы стекла микроинъекции, окулярного микрометра для калиброванных отсечения микроинъекции иглы советы 80μm диаметре, чашки Петри, весят лодки 35 мм, Tygon трубы (ID = 1 / 32 дюйма, OD = 3 / 32 дюйма)

production of transgenic xenopus laevis by restriction enzyme mediated integration and nuclear transplantation

Стабильная интеграция продуктов клонированных генов в геноме Xenopus необходимо контролировать время и место выражения, чтобы выразить гены на более поздних стадиях эмбрионального развития, и определить, как усилители и промоутеров регулируют экспрессию генов в эмбрион. Протокол продемонстрировали здесь может быть использован для эффективного получения трансгенных Xenopus laevis эмбрионов. Этот подход включает в себя трансгенез трех частей: 1. Сперма ядер изолированы от взрослых X. laevis яичка обработкой лизолецитин, который permeabilizes спермы плазматической мембране. 2. Яйцо экстракт готовится низкой скорости центрифугирования, добавление кальция вызывает экстракт для перехода к интерфазе клеточного цикла, а также высокоскоростным центрифугированием, чтобы изолировать межфазной цитозоле. 3. Ядерной трансплантации: ядер и экстракта в сочетании с линеаризованной плазмидой ДНК, чтобы вводить в качестве трансгенов и небольшое количество фермента рестрикции. Во время короткой реакции, яичный экстракт частично decondenses спермы хроматина и рестрикции генерирует хромосомных разрывов, которые способствуют рекомбинации трансгенов в геном. Лечение спермы ядер затем пересаживают в неоплодотворенные яйца. Интеграция трансгенов обычно происходит до первого эмбрионального расщепления, что в результате эмбрионы не являются химерные. Эти эмбрионы могут быть проанализированы без необходимости разводить для следующего поколения, что позволяет для эффективного и быстрого поколение трансгенных эмбрионов для анализа промоутер и функции гена. Взрослый X. laevis в результате этой процедуры также распространяются через трансгенов зародышевой линии и может быть использован для создания линии трансгенных животных для различных целей.

Watch this Scientific Journal Video about Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation at JoVE.com

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Это видео демонстрирует протокол метод для создания трансгенных<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Путем внедрения трансгенов в ядрах сперматозоидов следуют ядерной трансплантации в неоплодотворенные яйца.

Получение трансгенных Xenopus laevis По рестрикции Интеграция опосредованного и ядерной трансплантации

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

production-transgenic-xenopus-laevis-restriction-enzyme-mediated

Research

JoVE Journal

Biology

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

11.8K Views.  University of Manchester. Это видео демонстрирует протокол метод для создания трансгенных Xenopus laevis Путем внедрения трансгенов в ядрах сперматозоидов следуют ядерной трансплантации в неоплодотворенные яйца.

Video: Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

Пластиковые вложения и секционирования Xenopus laevis Эмбрионы

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

Получение Яйца Xenopus laevis Женщины

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Подготовка и Фракционирование Xenopus laevis Яйцо Экстракты

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

In Vitro ядерной Ассамблеи Использование фракционированный яиц Xenopus Экстракты

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Микроинъекции Xenopus ооцитов Laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Live-камера и цифровой обработки изображений Количественный анализ эмбриональных эпителиальных клеток в Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

Трансплантация лица в<em&gt; Xenopus Laevis</em&gt; Эмбрионы

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of neurulation, migrates extensively towards various organs, and differentiates into many types of derivatives (neurons, glia, cartilage and bone, pigmented and endocrine cells). In this protocol, we describe how to dissect the premigratory cranial NC from Xenopus laevis embryos, in order to study NC development in vivo and in vitro. The frog model offers many advantages to study early development; abundant batches are available, embryos develop rapidly, in vivo gain and loss of function strategies allow manipulation of gene expression prior to NC dissection in donor and/or host embryos. The NC explants can be plated on fibronectin and used for in vitro studies. They can be cultured for several days in a serum-free defined medium. We also describe how to graft NC explants back into host embryos for studying NC migration and differentiation in vivo.

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

This protocol describes how to dissect premigratory cranial neural crest (NC) from Xenopus laevis neurulas. These explants can be plated on fibronectin and cultured in vitro, or grafted back into host embryos. This technique allows studying the mechanisms of NC epithelium-to-mesenchyme transition, migration, and differentiation.

Рассечение<em&gt; Xenopus Laevis</em&gt; Нервного гребня для<em&gt; В пробирке</em&gt; Эксплантата Культура или<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Трансплантация

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and widely-utilized +TIPs for analyzing MT dynamics is the End-Binding protein, EB1, which binds all growing MT plus-ends, and thus, is a marker for MT polymerization1. Many studies of EB1 behavior within growth cones have used time-consuming and biased computer-assisted, hand-tracking methods to analyze individual MTs1-3. Our approach is to quantify global parameters of MT dynamics using the software package, plusTipTracker4, following the acquisition of high-resolution, live images of tagged EB1 in cultured embryonic growth cones5. This software is a MATLAB-based, open-source, user-friendly package that combines automated detection, tracking, visualization, and analysis for movies of fluorescently-labeled +TIPs. Here, we present the protocol for using plusTipTracker for the analysis of fluorescently-labeled +TIP comets in cultured Xenopus laevis growth cones. However, this software can also be used to characterize MT dynamics in various cell types6-8.

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

The MATLAB-based, open source software package, plusTipTracker, can be used to analyze image series of fluorescently-labeled +TIPs to quantify microtubule dynamics.

Использование plusTipTracker Программное обеспечение для измерения микротрубочек Динамика в<em&gt; Xenopus Хепориз</em&gt; Шишки роста

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The initiation step, which involves the assembly of the ribosomal subunits at the mRNA initiation codon, involved initiation factor including eIF4G1. Defects in this rate limiting step of translation are linked to diverse disorders. To study the potential consequences of such deregulations, Xenopus laevis oocytes constitute an attractive model with high degrees of conservation of essential cellular and molecular mechanisms with human. In addition, during meiotic maturation, oocytes are transcriptionally repressed and all necessary proteins are translated from preexisting, maternally derived mRNAs. This inexpensive model enables exogenous mRNA to become perfectly integrated with an effective translation. Here is described a protocol for assessing translation with a factor of interest (here eIF4G1) using stored maternal mRNA that are the first to be polyadenylated and translated during oocyte maturation as a physiological readout. At first, mRNA synthetized by in vitro transcription of plasmids of interest (here eIF4G1) are injected in oocytes and kinetics of oocyte maturation by Germinal Vesicle Breakdown detection is determined. The studied maternal mRNA target is the serine/threonine-protein-kinase mos. Its polyadenylation and its subsequent translation are investigated together with the expression and phosphorylation of proteins of the mos signaling cascade involved in oocyte maturation. Variations of the current protocol to put forward translational defects are also proposed to emphasize its general applicability. In light of emerging evidence that aberrant protein synthesis may be involved in the pathogenesis of neurological disorders, such a model provides the opportunity to easily assess this impairment and identify new targets.

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

Xenopus Laevis как модель для идентификации перевода Обесценение

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...