نشكر ديفيد Theilmann (المحيط الهادئ الأغذية الزراعية مركز البحوث ، سمرلاند ، كولومبيا البريطانية) لتوفير AcMNPV الفيروسة العصوية ومفيدة للمناقشة. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المؤسسة الكندية للابتكار (CFI) ، والمعاهد الكندية للأبحاث الصحية (CIHR) ، ومؤسسة مايكل سميث للبحوث الصحية (MSFHR) ، والعلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (NSERC) .

الجزء 1 : إعداد البويضات لالقيطم microinjection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قطعة صغيرة (حوالى 2 سم) من المبيض المورق القيطم في أنبوب 50 مل مخروطي يحتوي على 20 مل من محلول كولاجيناز (5 ملغ / مل كولاجيناز في الكالسيوم الخالية تعديل بارت والمالحة : مم 0.82 88 مم كلوريد الصوديوم ، 1 ملم بوكل ، MgSO 4 ، 10 Hepes ملم ، ودرجة الحموضة 7.5). يستخدم كولاجيناز لإزالة الخلايا التي تحيط جريب البويضات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنبوب على منصة شاكر والصخور برفق (عند 100 دورة في الدقيقة) لمدة ساعة. هذه المرة يختلف مع الكثير من كولاجيناز مختلفة. هكذا بعد ساعة واحدة ، أخذ عينة صغيرة من البويضات وفحصها تحت المجهر تشريح. وينبغي أن يكون صحيح دي folliculated البويضات مفصولة عن بعضها البعض جيدا ، وينبغي أن يكون من السهل ادخال ابرة الزجاج في البويضة. إذا ليست كافية البويضات دي folliculated ، وتركوا في حل كولاجيناز ودققت مرة أخرى في كل خمس دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل البويضات ثلاث مرات مع المالحة تعديل بارت في (MBS : 88 مم كلوريد الصوديوم ، 1 ملم بوكل ، 0.82 ملي MgSO 4 ، 0.33 ملي كا (NO 3) 2 ، 0.41 ملي CaCl 2 ، 10 Hepes ملم ، ودرجة الحموضة 7.5) ، ونقل لهم لصحن قطره 100 ملم بتري تحتوي MBS زائد 1 ٪ البنسلين الستربتوميسين /. والبويضات هي الآن جاهزة للmicroinjected. إذا كان سيتم تنفيذ microinjection في يوم آخر ، وتخزين البويضات في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مجهر تشريح ، حدد البويضات الناضجة للمرحلة السادسة microinjection. هذه البويضات تكون كبيرة ، وعلى النقيض جيدة بين نصف الكرة السوداء والحيوان دسم نصف الكرة الملونة النباتية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سادسا نقل البويضات في مرحلة ناضجة لوحة microwell (نونك ، 10 حجم جيدا ميكرولتر). وينبغي أن يتم ذلك بعناية ، وذلك باستخدام pipettor 200 ميكرولتر مع طرف ماصة أنه تم قطع في نهاية السماح شفط undisrupted من البويضات. </li></ol> الجزء 2 : Microinjection من البويضات القيطم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعد الركيزة استيراد لتكون microinjected بإضافة كمية صغيرة من اللون الأزرق برومفينول 1 ٪ ، للمساعدة في التصور من microinjection. على سبيل المثال ، أن نضيف 1 ميكرولتر من اللون الأزرق برومفينول إلى 10 ميكرولتر من الركيزة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع شريط صغير من Parafilm على طبق بتري قطرها 100 ملم ، والاستغناء عن انخفاض 5 ميكرولتر من الحل ليتم حقنه في الشريط Parafilm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إبرة حقن ملء معايرة سابقا (التي تم الحصول عليها عن طريق سحب 6.6 ميكرولتر micropipette دروموند مع بولير + لحقن ماتيتش) مع الحل ليتم حقنه. لهذا ، تم تعيين microinjector على وضع الطموح. لمعايرة إبرة الحقن جعل علامات نقطة على كل إبرة 0.5 مم ، والتي تتوافق مع حجم 50 NL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحقن حشوية ، إدراج غيض من الإبرة إلى بويضة في نصف الكرة النباتي ، وقريب جدا من الكرة الأرضية الحيوان ، بزاوية حوالي 45 درجة. بدوره الإعداد لmicroinjector microinject وmicroinject كل بويضة مع 50 من الركيزة NL الاستيراد. تستخدم علامات نقطة على الإبرة لرصد مبلغ الركيزة التي تم حقنها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل البويضات لحقن طبق صغير بيتري (35 ملم القطر) مليئة MBS ، ويحضن في درجة حرارة الغرفة عن المبلغ المطلوب من الوقت (ويتم اختيار النقاط الزمنية وذلك للسماح للمراقبة الركيزة الاستيراد المرتبطة الشخصيات ، وهذا يحدث بين 10 و 30 دقائق للبروتينات والفيروسات التي تنقل نحو نشط للمجلس الوطنى ، وهذا الوقت يعتمد أيضا على موقع الحقن وحجم البروتين / فيروس). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند اكتمال الحضانة ، ونقل البويضات إلى قارورة زجاجية تحتوي على 4 ميلي غلوتارالدهيد 2 ٪ في MBS ، والإصلاح بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. </li></ol> الجزء 3 : تشريح الضفدع من البويضات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي ، وغسل البويضات 3 مرات مع MBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل البويضات في طبق بتري صغيرة مليئة العازلة الملح منخفضة (LSB : 1 ملم بوكل ، 0.5 ملي MgCl 2 ، 10 HEPES ملم ، ودرجة الحموضة 7.5). باستخدام مجهر تشريح تشريح وملاقط ، وإزالة القطب نباتية من كل بويضة. ومن المفيد لاستقرار البويضة يتم تشريح مع زوج واحد من ملاقط ، في حين يستخدم هذا الزوج الأخرى مثل المقص لإزالة القطب نباتية. عند هذه النقطة كان من الممكن لتقييم نجاح microinjection وجود مسحة زرقاء في العصارة الخلوية. هو استمرار للبروتوكول فقط للالبويضات التي تم microinjected بنجاح. بالإضافة إلى ذلك ، إذا كانت العينات لتكون على استعداد لEM ، تشريح هذه الخطوة يجعل من الاسهل بكثير للعثور على نواة عندما التشذيب وsectioning العينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح البويضات تشريح غلوتارالدهيد مرة أخرى مع 2 ٪ في LSB لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التثبيت ، وغسل البويضات تشريح ثلاث مرات مع LSB. </li></ol> الجزء 4 : إعداد البويضات المصبوبة لتضمينها ورقيقة Sectioning EM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل البويضات إلى شريحة تشريح الكآبة. نضح قدر من السائل ونقاط البيعsible ، ثم سرعان ما (بحيث لا تجف) تغطية البويضات تشريح مع ذوبان agarose منخفضة 2 ٪. بينما لا تزال لينة agarose ، استخدام غيض ماصة للفصل بين البويضات من بعضها البعض ، وضمان أن كل بويضة هو وجه أعلى أو إلى أسفل (وليس جانبيا). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح لترسيخ agarose لمدة 10 دقائق تقريبا. مرة واحدة في agarose يتصلب ، واستخدام شفرة حلاقة لقطع agarose الى قطع صغيرة ، كل منها تحتوي على واحد البويضة تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع البويضات agarose جزءا لا يتجزأ في قارورة زجاجية 4 مل ، وبعد إصلاح لهم 1 ٪ أوسو 4 في LSB لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل العينة ثلاث مرات في LSB. إذا لزم الأمر ، وتخزين العينة في 4 درجات مئوية خلال الليل والاستمرار في البروتوكول في اليوم التالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يذوى بالتسلسل العينات في سلسلة الصاعد من الكحول (50 ، 70 ، والايثانول 90 ٪ لمدة 20 دقيقة لكل منهما). ويتبع هذا من قبل اثنين من التغييرات في الإيثانول بنسبة 100 ٪ لمدة 15 دقيقة لكل منهما. يذوى أخيرا العينات مع الأسيتون 100 ٪ لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التسلل العينات مع مزيج من EPON 01:01 (Fluka) والأسيتون لمدة ساعة واحدة ، تليها تسلل بمزيج من 02:01 EPON والأسيتون لمدة ساعتين ، وأخيرا في EPON نقية على الأقل ست ساعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات من مكان في قوالب تضمين شقة مليئة EPON النقي الطازج. والبويضات موجهة بطريقة أن الجانب النواة أقرب إلى موقع الحقن -- في هذه الحالة جانب البويضات التي تم تشريح -- سيتم مقطوع الأولى. هذه الخطوة يحسن من فرص تصور استيراد الركيزة المختار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أخيرا ، وتتبلمر EPON لمدة يومين في 60 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل رؤية العينات ، يتم قطع الكتل ومقطوع ثم باستخدام مشراح مستدق. يتم نقل المقاطع على شبكات EM ملون باستخدام الإجراء العادي ، وتصور مع انتقال المجهر الالكتروني ، ونحن لن يظهر هذا الجزء من البروتوكول كما هو معيار EM الداخلي. </li></ol> الجزء 5 : نتائج الممثل : إذا كان البروتوكول قد حققت نجاحا ، ومن ثم ينبغي المغلف النووية (شمال شرق) والشخصيات تكون مرئية بوضوح في EM micrographs. اعتمادا على الركيزة وحقن مقدار الوقت بين الحقن والتثبيت ، يجب أن تكون مرئية الركيزة في مواجهة حشوية لمجلس الشعب ، في مجلس الشعب ، أو على وجه النووية للمجلس الوطنى. الشكل 1 يبين NE المقطع العرضي مع السيتوبلازم المتاخمة (ج) و النواة (ن) من القيطم البويضة التي تم حقنها capsids من AcMNPV الفيروسة العصوية ، المحتضنة في 4 درجات مئوية لمدة أربع ساعات ، والمجهزة لتضمين والباب رقيقة EM كما هو موضح. النصال أشر إلى الشخصيات. يشار إلى الالتحام قفيصة في مواجهة حشوية لمجلس الشعب بواسطة سهم أبيض. في المقابل ، يظهر الشكل 2 NE المقطع العرضي مع السيتوبلازم المتاخمة (ج) و النواة (ن) من القيطم البويضة التي تم حقنها بفيروس البارفو مع اللحظة من الفئران (MVM) ، حضنت في درجة حرارة الغرفة لمدة أربع ساعات ، و وتجهيزها لتضمين القسم رقيقة EM كما هو موضح. باستخدام هذه التقنية ، وجدنا أن يدفع MVM اضطرابات في الشرق الأدنى (كوهين وPanté ، 2005). بين قوسين تشير فواصل في الشرق الأدنى. النصال أشر إلى الشخصيات. يشار capsids MVM المفترضة المرتبطة NE بواسطة السهام البيضاء. <img src="/files/ftp_upload/1106/1106_fig1.png" alt="الشكل 1" width="600" height="459" /> الشكل 1 : صورة مجهرية إلكترون من شريحة NE مع السيتوبلازم المتاخمة (ج) و النواة (ن) من البويضة القيطم الذي تم حقنه بمادة capsids للزينة MNPV الفيروسة العصوية ، المحتضنة في 4 درجات مئوية لمدة أربع ساعات ، ومعالجتها لل التضمين والباب رقيقة EM كما هو موضح. النصال أشر إلى الشخصيات. يشار Capsids بواسطة السهام البيضاء. شريط الحجم : 100 نانومتر. <img src="/files/ftp_upload/1106/figure2.png" alt="الشكل 2" width="600" height="264" /> الشكل 2 : صورة مجهرية إلكترون من شريحة NE مع السيتوبلازم المتاخمة (ج) و النواة (ن) من القيطم البويضة التي تم حقنها بفيروس البارفو مع اللحظة من الفئران (MVM) ، حضنت في درجة حرارة الغرفة لمدة أربع ساعات ، و وتجهيزها لتضمين القسم رقيقة EM كما هو موضح. النصال أشر إلى الشخصيات. بين قوسين تشير فواصل في الشرق الأدنى. يشار capsids MVM المفترضة المرتبطة NE بواسطة السهام البيضاء. شريط الحجم : 100 نانومتر.

<ol>
	<li>Pant&#233;, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+intact+Xenopus+oocytes+in+nucleocytoplasmic+transport+studies.">Use of intact Xenopus oocytes in nucleocytoplasmic transport studies.</a> Methods Mol. Biol. 322, 301-314 (2006).</li><li>Pant&#233;, N., Kann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+pore+complex+is+able+to+transport+macromolecules+with+diameters+of+about+39+nm.">Nuclear pore complex is able to transport macromolecules with diameters of about 39 nm.</a> Mol. Biol. Cell. 13 (2), 425-434 (2002).</li><li>Rabe, B., Vlachou, A., Pant&#233;, N., Helenius, N., Kann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+import+of+hepatitis+B+virus+capsids+and+release+of+the+viral+genome.">Nuclear import of hepatitis B virus capsids and release of the viral genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (17), 9849-9854 (2003).</li><li>Cohen, S., Pant&#233;, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pushing+the+Envelope:+Microinjection+of+MVM+into+Xenopus+oocytes+causes+damage+to+the+nuclear+envelope.">Pushing the Envelope: Microinjection of MVM into Xenopus oocytes causes damage to the nuclear envelope.</a> J. Gen. Virol. 86 (12), 3243-3252 (2005).</li><li>Pant&#233;, N., Jarmolowski, A., Izaurralde, E., Sauder, U., Baschong, W., Mattaj, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+nuclear+export+of+different+classes+of+RNA+by+electron+microscopy.">Visualizing nuclear export of different classes of RNA by electron microscopy.</a> RNA. 3, 498-513 (1997).</li></ol>

Microinjection من البويضات القيطم جنبا إلى جنب مع رقيقة sectioning EM هو أداة فعالة للغاية لدراسة نقل النواة للهيولى. وقد استخدم هذا النظام لخريطة خطوات متميزة من الاستيراد عن طريق مجلس الشعب ، على سبيل المثال من التفاعل ركيزة النووية مع استيراد المكونات الهيكلية للمجلس الو...

microinjection of xenopus laevis oocytes

Microinjection من البويضات المورق القيطم تليها رقيقة sectioning المجهر الإلكتروني (EM) هو نظام ممتاز لدراسة نقل النواة للهيولى. بسبب نواته كبيرة وكثافة عالية من المسام المجمعات النووية (الشخصيات) ، يمكن أن يكون النقل النووي بسهولة في البويضة القيطم. وقد اكتسبت الكثير من التبصر في آليات الاستيراد والتصدير النووي من خلال استخدام هذا النظام (استعرضها Panté ، 2006). بالإضافة إلى ذلك ، فقد استخدمنا microinjection من البويضات لتشريح الضفدع مسارات استيراد النووية عدة من الفيروسات التي تتكاثر في النواة المضيفة. نحن هنا لشرح microinjection هيولي من البويضات القيطم مع ركيزة استيراد النووية. نعرض أيضا إعداد البويضات لحقن التصور بواسطة رقيقة sectioning EM ، بما في ذلك تشريح ، والجفاف ، وتضمينها في البويضات الى الراتنج الايبوكسي التضمين. أخيرا ، ونحن نقدم نتائج ممثل عن البويضات التي تم microinjected مع قفيصة من nucleopolyhedrovirus الفيروسة العصوية californica Autographa (AcMNPV) أو فيروس البارفو اللحظة من الفئران (MVM) ، ومناقشة التطبيقات الممكنة لهذه التقنية.

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes at JoVE.com

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

هنا علينا أن نظهر للحشوية microinjection<em&gt; القيطم المورق</em&gt; البويضات مع ركيزة استيراد النووية ، فضلا عن التحضير للحقن البويضات عن التصور بواسطة المجهر الإلكتروني رقيقة sectioning.

Microinjection من البويضات المورق القيطم

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Research

JoVE Journal

Biology

22.9K Views.  University of British Columbia - UBC. هنا علينا أن نظهر للحشوية microinjection القيطم المورق البويضات مع ركيزة استيراد النووية ، فضلا عن التحضير للحقن البويضات عن التصور بواسطة المجهر الإلكتروني رقيقة sectioning.

Video: Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

البلاستيك وتضمينها Sectioning الجنين المورق القيطم

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

الحصول على البيض من الإناث المورق القيطم

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

إعداد والتقطير من البيض مقتطفات القيطم المورق

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

التصحيح تسجيل المشبك من القنوات ايون معبرا عنه البويضات القيطم

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

تصور التعريب في الحمض النووي الريبي القيطم البويضات

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to generate maternal-effect mutant animals. Additionally, many of the techniques to overexpress or inhibit gene function in organisms such as Xenopus and zebrafish fail to sufficiently target critical maternal signaling pathways, such as Wnt signaling. In Xenopus, manipulating gene function in cultured oocytes and subsequently fertilizing them can ameliorate these problems to some extent. Oocytes are manually defolliculated from donor ovary tissue, injected or treated in culture as desired, and then stimulated with progesterone to induce maturation. Next, the oocytes are introduced into the body cavity of an ovulating host female frog, whereupon they will be translocated through the host's oviduct and acquire modifications and jelly coats necessary for fertilization. The resulting embryos can then be raised to the desired stage and analyzed for the effects of any experimental perturbations. This host-transfer method has been highly effective in uncovering basic mechanisms of early development and allows a wide range of experimental possibilities not available in any other vertebrate model organism.

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Procedure for fertilizing Xenopus oocytes by the host transfer method.

تسميد البويضات القيطم باستخدام أسلوب نقل المضيف

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

تحديد الأنسجة باستخدام زرع رسملة الحيوان (ACT) في الفحص القيطم المورق</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

تعيش خلية التصوير والتحليل الكمي من الخلايا الظهارية في الجنينية القيطم المورق</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later stages of embryonic development, and to define how enhancers and promoters regulate gene expression within the embryo. The protocol demonstrated here can be used to efficiently produce transgenic Xenopus laevis embryos. This transgenesis approach involves three parts: 1. Sperm nuclei are isolated from adult X. laevis testis by treatment with lysolecithin, which permeabilizes the sperm plasma membrane. 2. Egg extract is prepared by low speed centrifugation, addition of calcium to cause the extract to progress to interphase of the cell cycle, and a high-speed centrifugation to isolate interphase cytosol. 3. Nuclear transplantation: the nuclei and extract are combined with the linearized plasmid DNA to be introduced as the transgene and a small amount of restriction enzyme. During a short reaction, egg extract partially decondenses the sperm chromatin and the restriction enzyme generates chromosomal breaks that promote recombination of the transgene into the genome. The treated sperm nuclei are then transplanted into unfertilized eggs. Integration of the transgene usually occurs prior to the first embryonic cleavage such that the resulting embryos are not chimeric. These embryos can be analyzed without any need to breed to the next generation, allowing for efficient and rapid generation of transgenic embryos for analyses of promoter and gene function. Adult X. laevis resulting from this procedure also propagate the transgene through the germline and can be used to generate lines of transgenic animals for multiple purposes.

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

This video protocol demonstrates a method for generating transgenic Xenopus laevis by introduction of transgenes into sperm nuclei followed by nuclear transplantation into unfertilized eggs.

إنتاج المعدلة وراثيا القيطم المورق عن طريق تقييد أنزيم التكامل وساطة وزرع النووية

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

زرع الوجه في<em&gt; القيطم المورق</em&gt; الأجنة

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Microinjection من البويضات المورق القيطم

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video