وقد أيد هذا المشروع من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح HL087088 (MK) وHL18208 (MK).

1. عزل الخلايا اللمفاوية T الإنسان <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على دم الإنسان من متبرع سليم. السماح لتبريد الدم إلى درجة حرارة الغرفة (~ 30 دقيقة) قبل الانتقال الى الخطوة التالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة بلطف 3 مل من درجة حرارة الغرفة وسائل الإعلام تعدد الأشكال التدرج الكثافة في أنبوب 8 مل البوليسترين جولة القاع. إضافة بلطف 3 مل من الدم الكامل على الجزء العلوي من تعدد الأشكال وسائل الاعلام. فمن الأهمية بمكان تجنب الخلط من الكواشف اثنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الطرد المركزي ، وفصل الخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى (PBMC) الآن من مكونات الدم الأخرى في طبقة الخلايا العليا. طبقة PBMC يظهر ، من أعلى إلى أسفل ، والفرقة غائم الأولى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية واضحة ذات اللون الأصفر المرحلة العليا من الدم ، وفوق الطبقة PBMC ، ومن ثم استخدام micropipette P1000 لنقل طبقة PBMC إلى 15 مل أو 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل PBMC مرتين مع برنامج تلفزيوني ، الطرد المركزي الخلايا في 500 x ج لمدة 5 دقائق في كل مرة. سوف يكون غائما طاف بعض الشيء بعد كل غسل. </li></ol> 2. ثقافة الخلايا اللمفاوية T الإنسان <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة ، ونقل إلى PBMC T - 75 قارورة الثقافة في 20 مل من وسائل الإعلام التي تحتوي على 1640 RPMI FBS 10 ٪ ، 1 ٪ البنسلين / الستربتوميسين ، و 1 ميكروغرام / مل راصة دموية نباتية (PHA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2 على الأقل 1 ساعة ، وتصل إلى 24 ساعة. هذه الخطوة تسمح حيدات ، والتي سوف تكون ملتصقة على سطح القارورة ، ويمكن فصلها عن الخلايا الليمفاوية التي تبقى في التعليق. إذا تم استخدام حضانة قصيرة (1 ساعة) في هذه الخطوة ، فإنه من غير المقبول استخدام وسائل الإعلام التي تحتوي على RPMI 1640 بنسبة 10 ٪ و 1 ٪ FBS البنسلين / الستربتوميسين دون المكمل مع PHA على النحو المحدد في الخطوة 2.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بدقة في جميع وسائل الإعلام من القارورة ، إضافة إلى أنبوب مخروطي 50 مل ، وأجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلية بيليه ، الذي يحتوي الآن في المقام الأول الخلايا اللمفية ، ونقل الخلايا إلى قارورة T - 75 الجديدة التي تحتوي على 25 مل تحتوي على وسائل الاعلام RPMI 1640 FBS 10 ٪ ، 1 ٪ البنسلين / الستربتوميسين ، و 1 ميكروغرام / مل PHA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في احتضان 37 درجة مئوية لمدة 3 أيام (2 أيام إذا الحضانة الأولية للPBMC كان بين عشية وضحاها). بعد 24 ساعة من النمو ، قد يكون من الضروري إضافة 15-20 مل من وسائل الإعلام الجديدة ونقل إلى أحد أكبر T - 175 قارورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 3 أيام ، استخدم ماصة لإزالة الخلايا الليمفاوية وسائل الاعلام وعلقت من القارورة ونقل إلى أنبوب مخروطي 50 مل. أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend بيليه في الخلية ونقلها إلى الخلايا قارورة T - 75 أو T - 175 الجديدة التي تحتوي على 25 مل (T - 75) أو 50 مل (T - 175) 1640 مع RPMI FBS 10 ٪ ، 1 ٪ البنسلين / الستربتوميسين ، و20 نانوغرام / مل الإنسان IL - 2 أو IL - 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو الخلايا الليمفاوية ل4-7 أيام. إذا بدءا قارورة T - 75 ، فإن الثقافة يجب أن يتم توسيعها وتحويلها إلى قارورة T - 175 بعد 1-2 أيام. </li></ol> 3. الفحص في المختبر الهجرة اللمفاويات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 قبل يوم من الفحص والهجرة ، ومعطف الزجاج قاع الطبق 0.17 ملم مع بروتين ميكروغرام / مل 20 ألف أو مجموعة في برنامج تلفزيوني بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الأطباق على نطاق واسع مع برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شل ICAM-1/Fc الإنسان (10 ميكروغرام / مل) وقوات الدفاع الذاتى الإنسان - 1. (2 ميكروغرام / مل) وذلك بإضافة هذه الكواشف في محلول PBS إلى الطبق واحتضان 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير الخلايا اللمفية تي من خلال تحديد الخلية الأولى في كثافة الثقافة في قارورة T - 175 باستخدام عدادة الكريات. وينبغي أن تستخدم ما يقرب من 2-5 × 10 5 خلايا في طبق لتحقيق كثافة الخلية المناسبة لتحليل الهجرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا اللمفية تي مرتين مع برنامج تلفزيوني وresuspend ثم في وسائل الإعلام 1 L - 15 مل تحتوي على 1 ملغ / مل مد الجلوكوز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الصحون المغلفة مع ICAM-1/Fc وقوات الدفاع الذاتى 1 - نطاق واسع مع برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الخلايا اللمفية تي في وسائل الإعلام مل 1 إلى الطبق والمحافظة عليها عند 37 درجة مئوية. </li></ol> 4. التقاط تسلسل الصور باستخدام برمجيات عناصر شيكل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح شيكل عناصر البرنامج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في قائمة إعدادات الكاميرا ، اختر &quot;binning 2X2&quot; كوضع لكلا التصوير والتقاط الصور الحية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتقل إلى القائمة واختيار تطبيقات تحديد / تشغيل التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار طول الفترة الزمنية بين الصور وبطول إجمالي للصورة التقاط تسلسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضغط على &quot;تشغيل&quot; الزر لبدء الحصول على الصور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن تعقب الخلايا والمعلمات الهجرة (السرعة ، وطول المسار ، والتشرد ، وما إلى ذلك) كميا باستخدام واحدة من عدة مجموعات البرمجيات ، بما في ذلك ImageJ ، أو AutoQuant Volocity (الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإنشاء &quot;شبكة عنكبوتية المؤامرة ، و&quot; س ص إحداثيات يتم جمع كل خلية وtimepoint (الشكل 2) والمسقطة على الرسم البياني مع نقطة انطلاق مشتركة لكل خلية في الأصل (الشكل 3). </li></ol> 5. ممثل النتائج يوم للثقافة لمدة 6 أيام في وجود إما الخلايا اللمفية تي IL - 2 أو IL - 15 ،يشكلون&gt; 98 ٪ من الخلايا ، على النحو الذي يحدده تلطيخ CD3 الإيجابية وكذلك CD4 إيجابية وتلطيخ / أو CD8. لIL - 2 ، وجدنا CD4 + الخلايا 83 ٪ ، 15 ٪ CD8 + و &lt;CD4 + 1 ٪ CD8 + الخلايا. لIL - 15 ، وجدنا CD4 + الخلايا 88 ٪ ، 11 ٪ CD8 + و &lt;CD4 + 1 ٪ CD8 + الخلايا. أثناء الهجرة اللمفاويات T على ركائز ICAM-1/SDF-1 ، عرضت الخلايا بسرعة قدرها حوالي 15 ميكرون / دقيقة يمكن أن يستمر على مدى ساعة والساعة 1. تي على الهجرة لمفاوية ICAM-1/SDF-1 يعتمد على LFA - 1 - بوساطة الالتصاق ، ومضاد للLFA - 1 - يجند حجب الأضداد يمنع بشدة الهجرة. <img src="/files/ftp_upload/2017/2017fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. سمح لتتبع خلية من الخلايا اللمفية تي المهاجرة. الخلايا اللمفية تي المعزولة من الدم الكامل والمثقف في وجود أو IL - 2 IL - 15 لمدة 6 أيام إلى التمسك بها وترحيل على الزجاج ذات قاع الأطباق المغلفة مع 10 ميكروغرام / مل ICAM - 1 و 2 ميكروغرام / مل SDF - 1. تم الحصول على الصور كل 10 ثانية لمدة 30 دقيقة. وقد تم تحديد الخلايا في كل صورة وتتبعها على مر الزمن باستخدام البرمجيات Volocity. هذا الفيلم يتناول الهجرة العشوائية من الخلايا اللمفية تي في سرعة ميكرومتر 15 ~ / دقيقة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2017/2017_Kim_Movie1.mov">انقر هنا لمشاهدة الفيديو.</a> تتبع الفيلم خلية 1. ترحيل الخلايا اللمفية تي. الخلايا اللمفية تي المعزولة من الدم الكامل والمثقف في حضور IL - 2 أو سمح IL - 15 لمدة 6 أيام إلى التمسك بها وترحيل على أطباق ذات قاع الزجاج المطلي مع 10 ميكروغرام / مل ICAM - 1 و 2 ميكروغرام / مل SDF - 1 . تم الحصول على الصور كل 10 ثانية لمدة 30 دقيقة. وقد تم تحديد الخلايا في كل صورة وتتبعها على مر الزمن باستخدام البرمجيات Volocity. هذا الفيلم يتناول الهجرة العشوائية من الخلايا اللمفية تي في سرعة ميكرومتر 15 ~ / دقيقة. <img src="/files/ftp_upload/2017/2017fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. Spatiotemporal موقف الخلية. تم الحصول على إحداثيات XY كل خلية لكل نقطة باستخدام برنامج Volocity الوقت. <img src="/files/ftp_upload/2017/2017fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. &quot;نسيج العنكبوت مؤامرة&quot;. باستخدام XYt إحداثيات لكل خلية ، تم اختيار 15 الخلايا على نحو عشوائي ، وتآمر مع نقطة انطلاق مشتركة في الأصل. مقارنة المؤامرات العنكبوت يعطي تصوير بصرية سريعة للخلافات بين الهجرة في ظروف تجريبية مختلفة. مؤامرات للهجرة تي اللمفاوية تحت ظروف التحكم (اللوحة اليسرى) ، وفي وجود الأجسام المضادة يجند حجب مكافحة LFA - 1 (اللوحة اليمنى).

<ol>
	<li>Hyun, Y. M., Chung, H. L., McGrath, J. L., Waugh, R. E., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+integrin+VLA-4+localizes+to+the+lamellipodia+and+mediates+t+cell+migration+on+VCAM-1.">Activated integrin VLA-4 localizes to the lamellipodia and mediates t cell migration on VCAM-1.</a> J Immunol. 183, 359-369 (2009).</li><li>Morin, N. A., Oakes, P. W., Hyun, Y. M., Lee, D., Chin, Y. E., King, M. R., Springer, T. A., Shimaoka, M., Tang, J. X., Reichner, J. S., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonmuscle+myosin+heavy+chain+IIA+mediates+integrin+LFA-1+de-adhesion+during+T+lymphocyte+migration.">Nonmuscle myosin heavy chain IIA mediates integrin LFA-1 de-adhesion during T lymphocyte migration.</a> The Journal of experimental medicine. 205, 195-205 (2008).</li><li>Hyun, Y. M., Lefort, C. T., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+integrins+and+their+ligand+interactions.">Leukocyte integrins and their ligand interactions.</a> Immunologic research. , (2009).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

في هذه التجربة ، ونحن نقدم تفاصيل عن نظام بسيط لتحليل حركية الأولية اللمفاويات التائية البشرية. المقايسات في المختبر الهجرة استخدمت لتشريح أدوار العديد من الجزيئات ومسارات إشارات تشارك في تحرك من مختلف أنواع الخلايا. بعض عناصر التحكم الحرجة أن نأخذ في الاعتبار...

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11875</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH300070.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>1-Step Polymorphs</td><td>Accurate Chemical &amp;amp; Scientific Corporation</td><td>AN221725</td><td></td></tr><tr><td>PHA</td><td>Remel, Thermo Fisher Scientific</td><td>R30852801</td><td></td></tr><tr><td>Rec. human IL-2</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>202-IL</td><td></td></tr><tr><td>Rec. human IL-15</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>247-IL</td><td></td></tr><tr><td>Protein G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19459</td><td></td></tr><tr><td>Rec. human ICAM-1/Fc</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>720-IC</td><td></td></tr><tr><td>Rec. human SDF-1</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>350-NS</td><td></td></tr></tbody></table>

human t lymphocyte isolation, culture and analysis of migration in vitro

هجرة الخلايا اللمفية تي ينطوي على تفاعل لاصقة من integrins سطح الخلية مع يغاندس أعرب عن الخلايا الأخرى أو مع البروتينات المصفوفة خارج الخلية. تفعيل spatiotemporal دقيقة من integrins من حالة تقارب المنخفضة إلى حالة تقارب عالية عند حافة الخلية يؤدي مهمة لمفاوية T الهجرة<sup&gt; 1</sup&gt;. وبالمثل ، تراجع من حافة الخلية زائدة ، أو قدم ذنبية ، هو خطوة ضرورية في الحفاظ على استمرار اللمفاويات T إنتغرين التي تعتمد على القدرة على الحركة<sup&gt; 2</sup&gt;. مناهج علاجية كثيرة لالمناعة الذاتية أو التهابات لل integrins الأمراض المستهدفة كوسيلة لكبح التوظيف المفرط وهجرة الكريات البيض<sup&gt; 3</sup&gt;. لدراسة الأحداث الجزيئية التي تنظم الهجرة البشرية اللمفاويات T ، واستخدمت لدينا خبير<em&gt; في المختبر</em&gt; نظام الهجرة لتحليل الخلايا على ركيزة ثنائي الأبعاد الذي يحاكي البيئة أن الخلايا اللمفاوية تي واجه خلال التوظيف من الأوعية الدموية. والخلايا اللمفية تي عزله للمرة الأولى من المانحين البشرية وحفز ذلك الحين ، ومثقف لمدة سبعة إلى عشرة أيام. خلال الفحص ، ويسمح الخلايا اللمفية تي الالتزام والهجرة على ركيزة المغلفة مع جزيئات الالتصاق بين الخلايا - 1 (ICAM - 1) ، ويجند لإنتغرين LFA - 1 ، وانسجة الخلايا المشتقة من عامل - 1 (SDF - 1). بياناتنا تظهر أن الخلايا اللمفية تي المعرض سرعة المهاجرة ميكرومتر 15 ~ / دقيقة. ويمكن لمفاوية T الهجرة تثبطها الحصار إنتغرين<sup&gt; 1</sup&gt; أو مثبطات الجهاز أكتوميوزين الخلوية التي تنظم الهجرة الخلية<sup&gt; 2</sup&gt;.

Watch this Scientific Journal Video about Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro at JoVE.com

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

اللمفاويات T الهجرة يحدث أثناء صاروخ موجه إلى الأجهزة اللمفاوية ، والخروج من الأوعية الدموية ، والدخول في الأنسجة الطرفية. هنا ، نحن تصف وضع بروتوكول والتي يمكن استخدامها لتحليل الخلايا اللمفاوية تي الهجرة<em&gt; في المختبر</em&gt;.

عزل الخلايا الليمفاوية T الإنسان والثقافة والتحليل للهجرة في المختبر</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

human-t-lymphocyte-isolation-culture-analysis-migration

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

46.3K Views.  University of Rochester. اللمفاويات T الهجرة يحدث أثناء صاروخ موجه إلى الأجهزة اللمفاوية ، والخروج من الأوعية الدموية ، والدخول في الأنسجة الطرفية. هنا ، نحن تصف وضع بروتوكول والتي يمكن استخدامها لتحليل الخلايا اللمفاوية تي الهجرة في المختبر.

Video: Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

عزل الخلايا اللمفاوية من الجلد البشري لتحليل المظهري و<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; زراعة الخلايا

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

الماوس السذاجة CD4<sup&gt; +</sup&gt; عزل T خلية و<em&gt; في المختبر</em&gt; التمايز إلى T مجموعات فرعية خلية

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses3. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting4 and the investigation of proliferative abilities by 3H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

العزلة وتنشيط الخلايا الليمفاوية الفئران

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

تحليل الخلايا الليمفاوية التسرب باستخدام<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج من الدم في الدماغ الإنسان الحاجز

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and temporal specificity2. Chemotaxis is a critical function of lymphocytes and other immune cells that can be quantitatively assessed in vitro. This manuscript describes methods that permit the evaluation of chemotaxis, both in vitro and in vivo, for diverse cell types including cell lines and native cells. The in vitro, plate-based format permits the comparison of several conditions simultaneously in real-time, and can be completed within 1-4 h. In vitro assay conditions can be manipulated to introduce agonists and antagonists, as well as differentiate chemotaxis from chemokinesis, which is random movement. For in vivo trafficking assessments, immune cells can be labeled with multiple fluorescent dyes and used for adoptive transfer. The differential labeling of cells allows for mixed cell populations to be introduced into the same animal, thereby decreasing variance and reducing the number of animals required for an adequately powered experiment. Migration into lymphoid tissue occurs in as little as 1 h, and multiple tissue compartments can be sampled. Flow cytometry following tissue harvest allows for a rapid and quantitative analysis of the migratory patterns of multiple cell types.

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Protocols for quantitative assessment of lymphocyte chemotaxis and migration are important tools for immunology research. Here, an in vitro protocol is described that permits real-time, multiplexed evaluation of cell migration, as well as a complementary in vivo technique enabling tracking of native cells to spleen.

التحديد الكمي الوحيدات البشرية إنزيمية في المختبر واللمفاويات مورين الاتجار في فيفو

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

Light-sheet Microscopy for Three-dimensional Visualization of Human Immune Cells

In vivo, activation, proliferation, and function of immune cells all occur in a three-dimensional (3D) environment, for instance in lymph nodes or tissues. Up to date, most in vitro systems rely on two-dimensional (2D) surfaces, such as cell-culture plates or coverslips. To optimally mimic physiological conditions in vitro, we utilize a simple 3D collagen matrix. Collagen is one of the major components of extracellular matrix (ECM) and has been widely used to constitute 3D matrices. For 3D imaging, the recently developed light-sheet microscopy technology (also referred to as single plane illumination microscopy) is featured with high acquisition speed, large penetration depth, low bleaching, and photocytotoxicity. Furthermore, light-sheet microscopy is particularly advantageous for long-term measurement. Here we describe an optimized protocol how to set up and handle human immune cells, e.g. primary human cytotoxic T lymphocytes (CTL) and natural killer (NK) cells in the 3D collagen matrix for usage with the light-sheet microscopy for live cell imaging and fixed samples. The procedure for image acquisition and analysis of cell migration are presented. A particular focus is given to highlight critical steps and factors for sample preparation and data analysis. This protocol can be employed for other types of suspension cells in a 3D collagen matrix and is not limited to immune cells.

Here, we present a protocol to visualize immune cells embedded in a three-dimensional (3D) collagen matrix using light-sheet microscopy. This protocol also elaborates how to track cell migration in 3D. This protocol can be employed for other types of suspension cells in the 3D matrix.

النور-ورقة الفحص المجهري للتصور ثلاثي الأبعاد للخلايا المناعية البشرية

In vivo, activation, proliferation, and function of immune cells all occur in a three-dimensional (3D) environment, for instance in lymph nodes or ...

Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex vivo transmigration system. Group 2 innate lymphoid cells (ILC2) and CD4+ T helper cells were isolated from spleens and lungs of chicken egg ovalbumin (OVA)-challenged BALB/c mice. We confirmed the expression of CCR4 on both CD4+ T cells and ILC2, comparatively. CCL17 and CCL22 are the known ligands for CCR4; therefore, using this ex vivo transmigration method we examined CCL17- and CCL22-induced movement of CCR4+ lymphocytes. To establish chemokine gradients, CCL17 and CCL22 were placed in the bottom chamber of the transmigration system. Isolated lymphocytes were then added to top chambers and over a 48 h period the lymphocytes actively migrated through 3 &#181;m pores towards the chemokine in the bottom chamber. This is an effective system for determining the chemokinetics of lymphocytes, but, understandably, does not mimic the complexities found in the in vivo organ microenvironments. This is one limitation of the method that can be overcome by the addition of in situ imaging of the organ and lymphocytes under study. In contrast, the advantage of this method is that is can be performed by an entry-level technician at a much more cost-effective rate than live imaging. As therapeutic compounds become available to enhance migration, as in the case of tumor infiltrating cytotoxic immune cells, or to inhibit migration, perhaps in the case of autoimmune diseases where immunopathology is of concern, this method can be used as a screening tool. In general, the method is effective if the chemokine of interest is consistently generating chemokinetics at a statistically higher level than the media control. In such cases, the degree of inhibition/enhancement by a given compound can be determined as well.

In this protocol, lymphocytes are placed in the top chamber of a transmigration system, separated from the bottom chamber by a porous membrane. Chemokine is added to the bottom chamber, which induces active migration along a chemokine gradient. After 48 h, lymphocytes are counted in both chambers to quantitate transmigration.

تقييم هجرة الخلايا الليمفاوية في نظام الهجرة فيفو السابقين

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex ...

Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy

Overwhelming tissue accumulation of highly activated immune cells represents a hallmark of various chronic inflammatory diseases and emerged as an attractive therapeutic target in the clinical management of affected patients. In order to further optimize strategies aiming at therapeutic regulation of pathologically imbalanced tissue infiltration of pro-inflammatory immune cells, it will be of particular importance to achieve improved insights into disease- and organ-specific homing properties of peripheral lymphocytes. The here described experimental protocol allows to monitor lung accumulation of fluorescently labeled and adoptively transferred human lymphocytes in the context of papain-induced pulmonary inflammation. In contrast to standard in vitro assays frequently used for the analysis of immune cell migration and chemotaxis, the now introduced in vivo setting takes into account lung-specific aspects of tissue organization and the influence of the complex inflammatory scenario taking place in the living murine organism. Moreover, three-dimensional cross-sectional light-sheet fluorescence microscopic imaging does not only provide quantitative data on infiltrating immune cells, but also depicts the pattern of immune cell localization within the inflamed lung. Overall, we are able to introduce an innovative technique of high value for immunological research in the field of chronic inflammatory lung diseases, which can be easily applied by following the provided step-by-step protocol.

The here introduced protocol allows characterization of the lung homing capacity of primary human lymphocytes under in vivo inflammatory conditions. Pulmonary infiltration of adoptively transferred human immune cells in a mouse model of allergic inflammation can be imaged and quantified by light-sheet fluorescence microscopy of chemically cleared lung tissue.

المتقدمة التصوير من الرئة صاروخ موجه الخلايا الليمفاوية البشرية في التجريبية في نموذج فيفو للالتهاب التحسسي استناداً إلى ورقة الخفيفة الميكروسكوب

Overwhelming tissue accumulation of highly activated immune cells represents a hallmark of various chronic inflammatory diseases and emerged as an ...

Medicine

توضيح حركية الخلايا التائية: طرق تحليل الترحيل في الوقت الفعلي

Real-Time In Vitro Migration Assay for Primary Murine CD8+ T Cells

The adaptive immune response is reliant on a T cell&#39;s ability to migrate through blood, lymph, and tissue&#160;in response to pathogens and foreign bodies. T cell migration is a complex process that requires the coordination of many signal inputs from the environment and local immune cells, including chemokines, chemokine receptors, and adhesion molecules. Furthermore, T cell motility is influenced by dynamic surrounding environmental cues, which can alter activation state, transcriptional landscape, adhesion molecule expression, and more. In vivo, the complexity of these seemingly intertwined factors makes it difficult to distinguish individual signals that contribute to T cell migration. This protocol provides a string of methods from T cell isolation to computer-aided analysis to assess T cell migration in real-time&#160;under highly specific environmental conditions.&#160;These conditions&#160;may help&#160;elucidate mechanisms that regulate migration, improving our&#160;understanding of T cell kinetics and providing&#160;strong mechanistic evidence that is difficult&#160;to attain through animal experiments. A deeper understanding of the&#160;molecular interactions that impact cell&#160;migration is important to develop improved therapeutics.

تسليط الضوء على المؤلف: فهم آليات المرض من خلال التحليل في الوقت الفعلي لهجرة الخلايا التائية

This protocol providesa method of primary murine T cell isolation and time-lapse microscopy of T cell migration under specific environmental conditions with quantitative analysis.

مقايسة الهجرة في الوقت الحقيقي في المختبر لخلايا الفئران الأولية CD8 + T

The adaptive immune response is reliant on a T cell&#39;s ability to migrate through blood, lymph, and tissue&#160;in response to pathogens and foreign ...

عزل الخلايا الليمفاوية T الإنسان والثقافة والتحليل للهجرة في المختبر

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

عزل الخلايا اللمفاوية من الجلد البشري لتحليل المظهري و

الماوس السذاجة CD4

العزلة وتنشيط الخلايا الليمفاوية الفئران

تحليل الخلايا الليمفاوية التسرب باستخدام

التحديد الكمي الوحيدات البشرية إنزيمية في المختبر واللمفاويات مورين الاتجار في فيفو

النور-ورقة الفحص المجهري للتصور ثلاثي الأبعاد للخلايا المناعية البشرية

تقييم هجرة الخلايا الليمفاوية في نظام الهجرة فيفو السابقين

المتقدمة التصوير من الرئة صاروخ موجه الخلايا الليمفاوية البشرية في التجريبية في نموذج فيفو للالتهاب التحسسي استناداً إلى ورقة الخفيفة الميكروسكوب

مقايسة الهجرة في الوقت الحقيقي في المختبر لخلايا الفئران الأولية CD8 + T

مقايسة الهجرة في الوقت الحقيقي في المختبر لخلايا الفئران الأولية CD8 + T