تعدّد الخلايا اللمفاوية من السمات المهمة لأي استجابة مناعية. لذلك ، هذا البروتوكول مهم لأنه يسمح للباحث بتقييم حركة الخلايا الليمفاوية في نظام في المختبر محدد جيدًا. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تقييم مختلف الكيماويات لتحديد فعاليتها في تحفيز الهجرة في الخلايا المحددة مؤخرًا ، مثل الخلايا اللمفاوية الفطرية من المجموعة الثانية ، أو ILC2.
والميزة الثانية هي أن مثبطات أو العلاجات البيولوجية التي تهدف إلى منع مسارات chemokine معينة يمكن اختبارها من قبل هذه الطريقة قبل القيام بتجارب أكثر تكلفة مع الحيوانات. تبدأ استئصال الرئتين والطحال من الفئران الذكور والإناث القتل الرحيم التي تعامل البويضات باستخدام اثنين إلى ثلاثة لكل مجموعة. وضع الأنسجة المفككة في أنابيب منفصلة للتفكك وفقا لنوع الأنسجة والجنس الحيواني.
ضع أنسجة الرئة في 500 ميكرولترات من وسائل الانفصام في أنبوب الانفصام ، ضع الأنبوب في فصام الأنسجة الآلية ، وافصله باستخدام بروتوكول الرئة. كرر هذه الخطوات لمجموع مرتين. لتفكك أنسجة الطحال، وضعه في 500 ميكرولترات من وسائل الإعلام دورة ً في الدقيقة كاملة في الفصام، ومن ثم استخدام بروتوكول الطحال.
العمل في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية باستخدام تقنية معقمة من الآن فصاعدا، تصفية كل الأنسجة المنفصلة من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر، وجمع في أنابيب مخروطية 50 ملليلتر. شطف أنابيب الانفصام التي تحتوي على تجانس الرئة مع خمسة ملليلترات من وسائل الإعلام انفصال الرئة إضافية، وأنابيب تحتوي على تجانس الطحال مع خمسة ملليلتر من دورة في الدقيقة كاملة، وتصفية محتوياتها من خلال المرشحات المستخدمة للأنسجة المقابلة لها. لمزيد من فصل أنسجة الرئة، تتجانس الرئة احتضان لمدة 15 إلى 30 دقيقة في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
ثم إضافة خمسة ملليلترات من دورة في الدقيقة كاملة إلى كل من الرئة والطحال تجانس، والطرد المركزي. بعد التخلص من المابير ، والجمع بين الكريات التي تحتوي على الطحال وخلايا الرئة من مجموعة من الحيوانات من نفس الجنس في أنبوب مخروطي واحد 50 ملليلتر. إضافة 10 ملليلتر من دورة في الدقيقة كاملة إلى كل أنبوب، و resuspend.
تحديد إجمالي عدد الخلايا باستخدام عداد خلية تلقائي. ضبط تعليق الخلايا الذكور والإناث إلى 100 مليون خلية لكل ملليلتر في عازلة الفصل، ثم إضافة إلى أنبوب البوليسترين خمسة ملليلتر. بعد عزل الخلايا اللمفاوية الفطرية من المجموعة الثانية من 2/3 من إجمالي الخلايا كما هو موضح في المخطوطة، استخدم الخلايا المتبقية لإجراء عزل الخلايا التائية الإيجابي CD4.
لبدء CD4-إيجابية عزل الخلية T، إضافة مصل الفئران إلى تعليق تخصيب خلية CD4 T. ثم أضف كوكتيل العزل إلى عينة الخلية، وحضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. دوامة السريع المجالات لمدة 30 ثانية، وإضافة إلى عينة الخلية لتحقيق تخفيف من 75 ميكرولتر لكل ملليلتر.
مزيج بلطف، واحتضان لمدة 2 1/2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أعلى العينات مع ما يقرب من ملليلتر من العازلة فصل تصل إلى ثلاثة ملليلتر، ووضع أنابيب خمسة ملليلتر في ثماني غرف سهلة فصل المغناطيس، واحتضان لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم تلميح المغناطيس إلى الأمام، والماصات كل تعليق الخلية في أنبوب نظيفة خمسة ملليلتر.
إضافة 1.5 ملليلتر من الدم خالية من المصل إلى كل أنبوب، والطرد المركزي. صب قبالة supernatant، و resuspend بيليه خلية T إيجابية CD4 في 10 مليون خلية لكل ملليلتر في الدم خالية من المصل. لبدء هذا الجزء من البروتوكول، حدد عدد إدراجات ترانسويل اللازمة للتجربة لكل من خلايا T ILC2 وD4-positive-positive كما هو موضح في المخطوطة.
نقل بلطف إدراج ثلاثة ميكرون ترانسويل من الصفوف الوسطى من لوحة 24 جيدا إلى الصفوف العليا والسفلية من نفس لوحة 24-well مع طرف ماص اليدين وقفاز. أضف 500 ميكرولترات من وسائط الهجرة مع CCL17 إلى 1/3 من الآبار في الصف الأوسط من لوحة 24-well. إضافة 500 ميكرولترات من وسائل الإعلام الهجرة مع CCL22 إلى آخر 1/3 من الآبار.
وأخيرا، إضافة 500 ميكرولترات من الدم خالية من المصل 1/3 من الآبار التي تحتوي على أي chemokine لا 1/3 الماضي. تسمية الغطاء على لوحة بوضوح مع اسم وسائل الإعلام الهجرة المناسبة وضعت في الآبار السفلية. ثم، ضع إدراج ترانسويل مرة أخرى في الآبار التي تحتوي على العلاجات المختلفة.
أضف بلطف 100 ميكرولترات من خلايا CD4 T أو ILC2 إلى أعلى بئر من كل إدراج، مع التأكد من عدم خلط أو ماصة تعليق الخلية صعودا وهبوطا في ترانسويلس. تسمية الغطاء على لوحة بوضوح مع نوع الخلية وضعت في كل بئر، وكتابة التاريخ والوقت من اليوم الذي تم إضافة الخلايا. كرر هذه العملية بدءا من إزالة إدراج ترانسويل من لوحة حتى تم وضع جميع الخلايا في إدراج ترانسويل مع وسائل الإعلام.
وبمجرد عزل خلايا الاهتمام، فإن أهم الخطوات هي تتبع أنواع الكيماويات والخلايا التي توضع في آبار معينة، وإضافة الخلايا بلطف إلى الغرف العليا، وأخيرا لتجنب الاتصال غير الضروري مع لوحة الهجرة العابرة خلال الحضانة لمدة 48 ساعة. ضع الطبق برفق في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون، واحتضان لمدة 48 ساعة، مع التأكد من تقليل الاتصال مع اللوحة خلال فترة الحضانة. بعد إزالة لوحة بلطف من الحاضنة، وإزالة جميع إدراج ترانسويل من الصفوف الوسطى في الآبار الفارغة فقط فوق أو تحت.
جمع الخلايا من الآبار العليا والسفلى من إدراج ترانسويل في أنابيب المسمى مع أعلى أو أسفل مع CCL17، CCL22، أو وسائل الإعلام، مع نوع الخلية، ومع عدد النسخ المتماثل. شطف الآبار السفلية مع 500 ميكرولترات من 1x PBS، وجمعه في الأنابيب المقابلة، ونفعل الشيء نفسه بالنسبة لآبار الأعلى. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 378 مرات ز في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.
استخدام ماصة لإزالة بلطف كل من عظمى، ومن ثم resuspend T الخلية والكريات ILC2 مع 50 ميكرولترات من 1X PBS. بعد إزالة 10 microliters من تعليق الخلية، إضافة 90 microliters من 0.4٪ trypan الأزرق. عد الخلايا الموجودة على عداد الخلايا المؤتمت.
ولكل عينة، نسبة قياسية من صلاحية وعدد الخلايا لكل ملليلتر، وتحديد العدد الإجمالي للخلايا في كل علاج في الغرفة العلوية والسفلى. عندما تم تقييم CCR4 التعبير على كل من الخلايا T CD4 إيجابية و ILC2 عن طريق تدفق الخلايا، لم تكن هناك اختلافات بين المضيفين الذكور والإناث. ومع ذلك، كان التعبير CCR4 على أساس كل خلية على ILC2 أعلى بالمقارنة مع الخلايا T إيجابية CD4.
عندما كانت الغرفة السفلية من جهاز Transwell مليئة وسائل الإعلام ثقافة الخلية غير المعالجة، وسائل الإعلام التي تحتوي على CCL22، أو وسائل الإعلام التي تحتوي على CCL17، أقل من 14٪ من الخلايا التي تم ترحيلها في ظروف التحكم في وسائل الإعلام. ردا على CCL22، كلا النوعين الخلية، بغض النظر عما إذا كانت من الذكور أو الإناث المضيفين، وردت على CCL22. أيضا، CCL22 تسبب الهجرة أكبر من CCL17 في ذكر ILC2.
ومن ناحية أخرى، تسبب CCL17 في هجرة كبيرة لخلايا CD4 T للإناث والخلايا ILC2 مقارنة بوسائط الإعلام وحدها. CCL17 العلاج لم يكن مختلفا عن وسائل الإعلام لD4- الخلايا التائية إيجابية ذكر أو ذكر ILC2. في ظل ظروف دون المستوى الأمثل، عندما ظلت لوحة مع خلايا CD4 في درجة حرارة الغرفة لأول 24 ساعة ثم انتقلت إلى الحاضنة، لم يكن هناك هجرة نحو CCL22 و CCL17.
وعلاوة على ذلك، كانت صلاحية الخلايا منخفضة بشكل ملحوظ بالنسبة للخلايا الموجودة في الغرفة السفلية، مما يدل على أهمية استخدام درجات الحرارة والظروف الصحيحة الموصوفة في هذا البروتوكول لتحقيق أفضل النتائج. وبمجرد الانتهاء من إجراء الهجرة، ينبغي للمرء أن يرى هجرة كبيرة إلى chemokine من الفائدة بالمقارنة مع وسائل الإعلام السيطرة الآبار. إذا لم يكن هناك هجرة كبيرة ينظر إليها، يمكن للمرء أن يفترض أن الإجراء لم يعمل بشكل صحيح أو أن الخلايا الليمفاوية لا تستجيب للكيميوكاين في السؤال.
يمكن استخدام هذه التقنية على نطاق واسع لفهم هجرة الخلايا الليمفاوية عندما خضعت تلك الخلايا الليمفاوية لمجموعة واسعة من العلاجات في الجسم الحي.
