이 프로젝트는 국민 건강 기금 HL087088 (MK)의 연구소와 HL18208 (MK)에 의해 지원되었다.

1. 인간의 T Lymphocytes의 분리 <ol><li> 건강한 기증자로부터 인간의 혈액을 구합니다. 혈액은 다음 단계로 진행하기 전에 실내 온도 (~ 30 분)로 냉각 수 있습니다. </li><li> 부드럽게 8 ML 왕복 하단의 폴리스티렌 튜브로 실내 온도 Polymorph 밀도 기울기 미디어 3 ML을 피펫. 부드럽게 Polymorph 미디어 위에 전체 혈액의 3 ML를 추가합니다. 두 시약의 혼합되지 않도록하는 것이 중요합니다. </li><li> 실온에서 45 분간 500 XG에서 튜브를 원심 분리기. </li><li> 원심 분리에 따라, 말초 혈액 mononuclear 세포 (PBMC)는 이제 최고 셀 레이어에 다른 혈액 구성 요소에서 분리합니다. PBMC 계층은 첫 번째 흐림 밴드로, 위에서 아래로 나타납니다. </li><li> 조심스럽게 PBMC 레이어 위에 혈액의 맑은 노란색 상위 단계를 제거하고 15 ML 50 ML 원뿔 관에 PBMC 레이어를 전송하는 P1000 micropipette를 사용합니다. </li><li> 오분 때마다 500 XG에서 세포를 centrifuging, PBS로 두 번 PBMC 씻으십시오. 뜨는은 각 씻고 나서 약간 뿌연됩니다. </li></ol> 2. 인간의 T Lymphocytes의 문화 <ol><li> 피펫 사용하여 10 % FBS를 포함한 20 ML RPMI 1640 미디어 T - 75 문화 플라스크에 PBMC을 전송, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 1 μg / ML phytohemagglutinin (PHA). </li><li> 37 품어 ° C와 5% 적어도 1 시간 및 최대 24 시간 동안 CO 2. 이 단계는 중단에 남아 lymphocytes에서 분리된 것으로, 술병의 표면에 점착 성의 것입니다 monocytes을 수 있습니다. 짧은 부화 (1 시간)가이 단계에서 사용하는 경우, 그것은 단계 2.1에 명시된 바와 같이 PHA와 보완없이 10% FBS, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 포함하는 RPMI 1640 미디어를 사용하기 위해 허용됩니다. </li><li> 신중하게, 술병에서 미디어를 모두 제거 50 ML 원뿔 관에 추가하고, 5 분 500 XG에 원심 분리기. </li><li> 지금은 주로 lymphocytes을 포함하는 세포 펠렛을 Resuspend, 10 % FBS를 포함한 25 ML RPMI 1640 미디어를 포함하는 새로운 T - 75 플라스크에 세포를 전송, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 1 μg / ML PHA. </li><li> 삼일 (PBMC의 초기 부화가 야간 있었다면 이일)에 대한 37 ° C에서 알을 품다. 성장 후 24 시간 후, 신선한 미디어 15-20 ML을 추가하고 큰 T - 175 플라스크로 전송해야 할 수도 있습니다. </li><li> 삼일 후, 50 ML 원뿔 관에 술병과 전송에서 미디어 및 정지 lymphocytes를 제​​거하는 피펫을 사용합니다. 5 분 500 XG에 원심 분리기. </li><li> 10% FBS 25 ML (T - 75) 50 ML (T - 175) RPMI 1640을 포함하는 새로운 T - 75 또는 T - 175 플라스크에 세포 펠릿 및 전송 세포를 Resuspend, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 20 NG / ML 인간 IL - 2 또는 IL - 15. </li><li> 4-7일에 대한 lymphocytes 성장. T - 75 플라스크로 시작하는 경우, 문화 1-2 일 후에 확대와 T - 175 플라스크로 전송해야합니다. </li></ol> 3. 관내 림프구 마이 그 레이션 분석에서 <ol><li> 마이 그 레이션 분석하기 전에 일일, 코트 4 PBS에서 A 또는 G 하루 20 μg / ML 단백질과 유리 바닥 0.17 mm 요리 ° C. </li><li> PBS로 광범위하게 접시를 씻으십시오. </li><li> 인간 ICAM-1/Fc (10 μg / ML)과 인간 SDF - 1 접시에 PBS 용액에서 이러한 시약을 추가하고 실온에서 4 시간 잠복기 (2 μg / ML).를 무력화 </li><li> 먼저 hemacytometer를 사용하여 T - 175 플라스크에 문화의 세포 밀도를 결정하여 T lymphocytes를 준비합니다. 약 2-5 X 10 5 세포는 마이 그 레이션 분석을 위해 적절한 세포 밀도를 달성하기 위해 요리마다 사용해야합니다. </li><li> PBS로 두 번 T lymphocytes 씻으 다음 1 MG / ML D - 포도당을 포함하는 하나 ML L - 15 미디어 resuspend. </li><li> 광범위하게 PBS로 ICAM-1/Fc와 SDF - 1 코팅 접시를 씻으십시오. </li><li> 접시 1 ML 미디어에서 T의 lymphocytes을 전송하고 37 그들을 유지 ° C. </li></ol> 4. NIS 요소 소프트웨어를 사용하여 이미지 시퀀스를 캡처 <ol><li> NIS 요소 소프트웨어를 여십시오. </li><li> 카메라 설정 메뉴에서, 살아있는 영상 및 이미지 캡처 모두 모드로 &quot;2x2 비닝&quot;을 선택합니다. </li><li> 응용 프로그램 메뉴로 가서 실행 / 정의 실험을 선택합니다. </li><li> 이미지와 이미지 캡처 시퀀스의 총 길이 사이의 시간의 길이를 선택합니다. </li><li> 이미지 수집을 시작하기 위해 &quot;실행&quot;버튼을 누르십시오. </li><li> 전지 추적할 수 및 마이 그 레이션 매개 변수 (속도, 경로 길이, 변위 등) ImageJ, AutoQuant 또는 Volocity (그림 1)를 포함한 여러 소프트웨어 패키지 중 하나를 사용하여 계량. </li><li> 각각의 셀 및 timepoint 수집 (그림 2)와 원점에서 각 셀에 대해 일반적인 시작 지점 (그림 3)과 그래프에 예상이됩니다 생성하려면 &quot;거미줄 계획을,&quot;XY 좌표. </li></ol> 5. 대표 결과 IL - 2 또는 IL - 15, T의 lymphocytes 중 하나의 존재에 문화의 일 6뿐만 아니라 긍정적인 CD4 및 / 또는 CD8 얼룩 같은 긍정적인 인 경우에는 3 번 CD의 얼룩에 의해 결정 세포의&gt; 98%을 구성합니다. IL - 2에 대해서는 83 % CD4 + 세포가 15 % CD8 +와 &lt;1 %의 CD4 + CD8 + 세포를 발견했습니다. IL - 15의 경우, 우리는 88 %의 CD4 + 세포, CD8 + 11% 및 &lt;1 %의 CD4 + CD8 + 세포를 발견했습니다. ICAM-1/SDF-1 기판에 대한 T 림프구 마이 그 레이션하는 동안, 세포는 1 시간 기간 동안 유지할 수 약 15 μm의 / 분 속도를 전시. ICAM-1/SDF-1에 대한 T 림프구 마이 그 레이션, LFA - 1 - 중재 접착에 따라 달라집니다 같은 반 LFA - 1 리간드 차단 항체 것은 심각하게 마이 그 레이션을 억제. <img src="/files/ftp_upload/2017/2017fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. T lymphocytes 마이 그 레이션의 세포 추적. 전체 혈액에서 분리된 6 일간 IL - 2 또는 IL - 15의 면전에서 교양 T의 lymphocytes 10 μg / ML ICAM - 1과 함께 코팅 유리 바닥으로 요리를 준수하고 마이 그 레이션하는 허용되었습니다 2 μg / ML SDF - 1. 이미지는 30 분 10 초마다을 인수했다. 세포는 각 이미지를 식별하고 Volocity 소프트웨어를 사용하여 시간이 지남에 추적되었다. 이 영화는 ~ 15 μm의 / 분 속도로 T lymphocytes의 임의의 마이 그 레이션을 보여줍니다. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2017/2017_Kim_Movie1.mov">비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> T lymphocytes 마이 그 레이션의 영화 1. 세포 추적. T의 lymphocytes는 전체 혈액에서 분리의 면전에서 교양 IL - 2 6 일 또는 IL - 15는 10 μg / ML ICAM - 1, 2 μg / ML SDF - 1 코팅 유리 바닥으로 요리를 준수하고 마이 그 레이션하는 허용되었습니다 . 이미지는 30 분 10 초마다을 인수했다. 세포는 각 이미지를 식별하고 Volocity 소프트웨어를 사용하여 시간이 지남에 추적되었다. 이 영화는 ~ 15 μm의 / 분 속도로 T lymphocytes의 임의의 마이 그 레이션을 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/2017/2017fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. Spatiotemporal 세포 위치. 각 세포의 XY 좌표는 Volocity 소프트웨어를 사용하여 각 시점에 대한 취득했다. <img src="/files/ftp_upload/2017/2017fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. &quot;스파이더 웹 플롯.&quot; XYt를 사용하면 각 셀에 대한 15 세포가 무작위로 선택되었으며 원점에서 일반적인 출발점와 제휴해서 역모를 조정합니다. 거미 웹 음모를 비교하면 서로 다른 실험 조건 사이의 마이 그 레이션의 차이를 빠르게 시각적으로 묘사를 제공합니다. 제어 조건 하에서 T 림프구 마이 그 레이션 (왼쪽 패널) 및 안티 LFA - 1 리간드 차단 항체 (오른쪽 패널)의 존재에 플롯.

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	<li>Hyun, Y. M., Chung, H. L., McGrath, J. L., Waugh, R. E., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+integrin+VLA-4+localizes+to+the+lamellipodia+and+mediates+t+cell+migration+on+VCAM-1.">Activated integrin VLA-4 localizes to the lamellipodia and mediates t cell migration on VCAM-1.</a> J Immunol. 183, 359-369 (2009).</li><li>Morin, N. A., Oakes, P. W., Hyun, Y. M., Lee, D., Chin, Y. E., King, M. R., Springer, T. A., Shimaoka, M., Tang, J. X., Reichner, J. S., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonmuscle+myosin+heavy+chain+IIA+mediates+integrin+LFA-1+de-adhesion+during+T+lymphocyte+migration.">Nonmuscle myosin heavy chain IIA mediates integrin LFA-1 de-adhesion during T lymphocyte migration.</a> The Journal of experimental medicine. 205, 195-205 (2008).</li><li>Hyun, Y. M., Lefort, C. T., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+integrins+and+their+ligand+interactions.">Leukocyte integrins and their ligand interactions.</a> Immunologic research. , (2009).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

본 실험에서는, 우리는 기본 인간 T의 lymphocytes의 운동성를 분석하는 간단한 시스템에 대한 자세한 내용을 제공합니다. 체외 마이 그 레이션 assays 다양한 세포 유형의 운동에 관련된 다양한 분자와 신호 경로의 역할을 해부하다하는 데 사용되었습니다. 우리 프로토콜에서 자신의 실험을 설계할 때 염두에 두어야하는 몇 가지 중요한 컨트롤은 다음과 같습니다 : 1) 소 혈청 알부민 (BSA)...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>RPMI 1640</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>11875</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>SH300070.03</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-Step Polymorphs</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Accurate Chemical</td>
<td>AN221725</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PHA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Remel/Fisher Scientific</td>
<td>R30852801</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rec. human IL-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R&amp;D Systems</td>
<td>202-IL</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rec. human IL-15</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R&amp;D Systems</td>
<td>247-IL</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protein G</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>19459</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rec. human ICAM-1/Fc</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R&amp;D Systems</td>
<td>720-IC</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rec. human SDF-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R&amp;D Systems</td>
<td>350-NS</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

human t lymphocyte isolation, culture and analysis of migration in vitro

T lymphocytes의 마이 그 레이션은 다른 세포 또는 세포외 기질 단백질로 표현 리간드와 함께 세포 표면 integrins의 접착제 상호 작용을 포함한다. 낮은 친화 상태에서 세포 첨단에 높은 친화력 상태로 integrins의 정확한 spatiotemporal 활성화 T 림프구 마이 그 레이션에 대한 중요<sup&gt; 1</sup&gt;. 마찬가지로, 세포 후행 가장자리의 철회는, 또는 uropod, 영구적인 인테 종속적인 T 림프구의의 운동성을 유지하는 데 필요한 단계입니다<sup&gt; 2</sup&gt;. 수단으로 면역 또는 염증 질환 대상 integrins 많은 치료 방법은 leukocytes의 과도한 모집 및 마이 그 레이션을 억제하기 위해<sup&gt; 3</sup&gt;. 인간의 T 림프구의 마이 그 레이션을 조절 분자 이벤트를 연구하기 위해, 우리는를 활용해야<em&gt; 체외에서</emT 림프구는 vasculature에서 모집하는 동안 발생하는 환경을 모방 2 차원 기판의 셀 마이 그 레이션을 분석&gt; 시스템. T의 lymphocytes 먼저 인간의 기증자로부터 격리되고 나서 자극을 7 일에서 열흘 동안 양식입니다. 분석하는 동안, T의 lymphocytes는 세포 유착 분자 -1 (ICAM - 1), 인테 LFA - 1에 대한 리간드와 stromal 세포 - 파생 요소 - 1 (SDF - 1) 코팅 기판에 준수 및 마이 그 레이션하는 허용됩니다. 우리의 데이터는 T lymphocytes는 ~ 15 μm의 / 분 철새 속도를 전시 것을 보여줍니다. T 림프구 마이 그 레이션은 인테 그린의 봉쇄에 의해 저해 수 있습니다<sup&gt; 1</sup&gt; 또는 세포 actomyosin 기계 억제제에 의해 그 세포 마이 그 레이션을 조절<sup&gt; 2</sup&gt;.

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Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T 림프구 마이 그 레이션 림프 기관, vasculature에서 출구로 유도하는 동안 발생하고, 주변 조직을 체결. 여기, 우리는 T 림프구 마이 그 레이션을 분석하는 데 사용할 수있는 프로토콜을 설명<em&gt; 체외에서</em&gt;.

마이 그 레이션의 인간 T 림프구 분리, 문화 및 분석 체외에서</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

human-t-lymphocyte-isolation-culture-analysis-migration

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

46.1K 조회수.  University of Rochester. T 림프구 마이 그 레이션 림프 기관, vasculature에서 출구로 유도하는 동안 발생하고, 주변 조직을 체결. 여기, 우리는 T 림프구 마이 그 레이션을 분석하는 데 사용할 수있는 프로토콜을 설명 체외에서.