حقن واحد إلى ثلاثة ملليغرام من الجسم المضاد CD45 المترافق بالفلوروفور المخفف في 100 ملليلتر من المحلول الملحي العادي عن طريق الوريد في كل فأر مخدر. ابدأ بوضع أربعة ملليلتر من المخزن المؤقت HEPES المثلج البارد المحضر في أنبوب متخصص لتفكيك الأنسجة على الثلج لكل فأر. بعد القتل الرحيم للفأر ، ضع الرئتين المقطوعتين في أنبوب تفكك الأنسجة الخاص بكل منهما ، مبردا على الجليد.
ضع الأنابيب على جهاز فصل الأنسجة الآلي وقم بتشغيل أول برنامج محدد مسبقا لأنسجة الرئة. ثم أضف 500 ميكرولتر من محلول مخزون الليبراز و 500 ميكرولتر من محلول مخزون أمينوجوانيدين إلى كل أنبوب يحتوي على أنسجة الرئة المنفصلة. احتضنها على خلاط nutating لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
بعد ذلك ، ضع الأنابيب مرة أخرى على جهاز الانفصال وقم بتشغيل البرنامج الثاني المحدد مسبقا لأنسجة الرئة. الآن صب تعليق الخلية الواحدة من أنبوب مفكك الأنسجة من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. شطف أنبوب مفكك الأنسجة مع خمسة ملليلتر من EHAA كاملة وتمر عبر مصفاة في أنبوب 50 ملليلتر.
بعد إزالة المصفاة ، ارفع حجم تعليق الخلية إلى 50 ملليلتر مع EHAA الكامل. بدلا من استخدام أنابيب تفكك الأنسجة المتخصصة ، ضع الرئتين المقطوعتين في أنابيب ميكروفوج سعة 1.5 ملليلتر مبردة على الجليد. بمجرد حصاد جميع الرئتين ، انقل كل رئة إلى أنبوب ميكروفوج جديد بدون أي وسائط خلوية.
باستخدام المقص ، قم بتقطيع الرئتين إلى أجزاء صغيرة داخل أنبوب الميكروفوج . أضف ملليلتر واحد من كوكتيل الهضم liberase TM و DNase I إلى كل أنبوب. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حمام مائي.
بعد ذلك، اسكبي العينة فوق مصفاة خلوية حجمها 100 ميكرومتر موضوعة فوق أنبوب مخروطي حجمه 50 ملليلتر. ماصة خارج العينة المتبقية على المصفاة. هرس الأنسجة ضد الشبكة مع الطرف المطاطي للمكبس من حقنة معقمة سعة ملليلتر واحد.
شطف مصفاة مع العازلة فارز الباردة ، وجمع حجم النهائي من سبعة ملليلتر في الأنبوب. سواء باستخدام طريقة التفكك الآلي أو اليدوي ، أجهزة الطرد المركزي التي تم الحصول عليها تعليق الخلية. نضح بعناية طاف، تاركا وراءه ما يقرب من 100 ميكرولتر من الطافات وبيليه الخلية.
أخيرا ، أضف ما يقرب من 100 ميكرولتر من محلول كتلة Fc لرفع الحجم الإجمالي إلى 200 ميكرولتر ودوامة بقوة لإعادة تعليق الحبيبات.
